陳宏宇， 徐小元

北京大學(xué)第一醫(yī)院 感染疾病科， 北京 100034

慢性丙型肝炎患者的抗病毒治療目前已經(jīng)進(jìn)入了使用直接抗病毒藥物(direct-acting antivirals，DAA)的泛基因型時(shí)代。在已知的主要基因型和基因亞型的HCV感染者中，DAA都能達(dá)到90%以上的持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答(SVR)[1]。但仍存在極小部分治療失敗的患者，表現(xiàn)為對(duì)DAA藥物無應(yīng)答，在治療期間出現(xiàn)病毒學(xué)突破，或者是在完整療程的DAA治療后出現(xiàn)復(fù)發(fā)。與DAA治療失敗相關(guān)的原因有很多，如不同分期的肝病、遺傳因素、免疫應(yīng)答、性別、HCV的復(fù)制水平以及HCV基因型與基因亞型等等，而耐藥相關(guān)置換(resistance-associated substitutions，RAS)在DAA耐藥中起到很重要的作用[2-5]。本文將主要對(duì)與基因2、3型HCV相關(guān)的NS5B、NS5A兩個(gè)基因片段中研究較多的RAS，在使用不同DAA方案的初治與治療失敗的患者中的分布差異進(jìn)行闡述。

1 RAS相關(guān)概述

在定義RAS前，需先確定HCV基因型、基因亞型、HCV蛋白及氨基酸位點(diǎn)。以Y93H為例，第一個(gè)字母Y為所涉及到的氨基酸(即酪氨酸)，93為野生株中該氨基酸所在的位置，即肽鏈上第93個(gè)氨基酸，第二個(gè)字母H即為在病毒株中實(shí)際測得的氨基酸(即組氨酸)。也有部分患者會(huì)同時(shí)感染多種變異株，在同一位點(diǎn)存在多種氨基酸耐藥突變(如：Y93Y/H/M)。這種耐藥相關(guān)變異可在初次使用DAA治療前就存在(稱為預(yù)存耐藥相關(guān)變異)，也可經(jīng)抗病毒治療后，在藥物壓力的選擇下而出現(xiàn)[6]。由于DAA在治療中的應(yīng)用會(huì)使得HCV出現(xiàn)耐藥突變的選擇，在接受次優(yōu)DAA方案的患者中，獲得RAS的HCV是感染的主控因素，因此RAS對(duì)于重新接受丙型肝炎抗病毒治療的患者是具有意義的。同時(shí)接受兩類DAA治療的患者出現(xiàn)失敗的風(fēng)險(xiǎn)較低[7-8]。未發(fā)現(xiàn)干擾素聯(lián)合利巴韋林的方案治療對(duì)慢性丙型肝炎患者DAA天然耐藥突變率存在影響[9]，但隨著近年來對(duì)RAS研究的增加，RAS在HCV基因中的分布也發(fā)生著一定的變化。

2 RAS在NS5B中的分布

與NS5B基因片段相關(guān)的突變位點(diǎn)主要包括S282、L159、C316、M289、S556等。此外，在治療失敗的患者病毒株中測序還發(fā)現(xiàn)了V321、M414、A421等位點(diǎn)上的突變，但檢測到出現(xiàn)這些突變的患者較少[10]。NS5B相關(guān)的RAS可存在于多種基因型的HCV中，且對(duì)DAA敏感性影響較小[11]。在以往的研究中，NS5B相關(guān)的RAS自然分布率較低。NS5B片段相關(guān)的RAS自然分布率大多<5%?；?、3型HCV中自然分布率最高的RAS是S556G，它在2、3型HCV中分布率為100%[12]。NS5B片段中與基因2、3型HCV相關(guān)的RAS是L159F與S282T[13]。一項(xiàng)有關(guān)RAS的研究以患者初治時(shí)DAA方案為分組依據(jù)對(duì)治療失敗的患者進(jìn)行分組，發(fā)現(xiàn)不同的組別間RAS分布率具有差異。其中初治時(shí)使用索磷布韋聯(lián)合干擾素方案治療的患者，NS5B相關(guān)RAS的分布率為66%，而初治時(shí)未聯(lián)合干擾素治療的患者中，NS5B相關(guān)RAS的分布率為20.4%；使用達(dá)塞布韋方案治療失敗的患者中，NS5B相關(guān)RAS的分布率為28.6%。在治療失敗的基因3型患者，NS5B相關(guān)的突變分布率約17%，NS5B突變的數(shù)量與類型均較少[14]。與其他基因片段上的RAS相比，在治療失敗的患者中NS5B相關(guān)的RAS分布率較低。與索磷布韋相關(guān)的耐藥位點(diǎn)主要在L159、S282、V321，但這幾個(gè)位點(diǎn)的RAS出現(xiàn)率都很低(低于10%)[15]。

2.1 S282位點(diǎn)相關(guān)的RAS S282T是唯一證實(shí)在體外具有耐藥性的RAS，但S282T對(duì)藥物敏感性的影響較小。當(dāng)S282T在病毒中出現(xiàn)時(shí)，對(duì)索磷布韋半最大效應(yīng)濃度(concentration for 50% of maximal effect，EC50)是野生型病毒株的2～16倍[15]。S282T的自然分布率在基因2型患者中為0.22%，在基因3型患者中為0.03%[16]。在一些研究中，S282T在DAA初治的患者中幾乎未檢測到。盡管在使用達(dá)卡他韋聯(lián)合索磷布韋或萊迪派韋聯(lián)合索磷布韋方案治療失敗的患者中可以監(jiān)測到，但比率<1%，在使用索磷布韋聯(lián)合維帕他韋組合治療失敗的患者中未發(fā)現(xiàn)S282T突變[17]。S282T在使用了包含索磷布韋且無干擾素方案的基因3型治療失敗患者中出現(xiàn)率為5%，而在其他DAA治療方案失敗的患者中，S282T的出現(xiàn)率極低，且分布率未發(fā)現(xiàn)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異[18]。

2.2 L159與C316位點(diǎn)相關(guān)的RAS L159位點(diǎn)相關(guān)的RAS影響基因3型HCV對(duì)索磷布韋的敏感性，但影響較小，EC50較野生型病毒株倍數(shù)改變小于2倍[15]。C316位點(diǎn)相關(guān)的RAS可使病毒對(duì)達(dá)塞布韋耐藥性增強(qiáng)，其對(duì)達(dá)塞布韋耐藥的影響是NS5B位點(diǎn)相關(guān)的RAS中最強(qiáng)的?？傮w說來，L159F位點(diǎn)的RAS自然分布率為11.19%，而C316位點(diǎn)的RAS自然分布率為44.28%(其中包括43.09%C316N以及1.19%C316H)[16]。在基因3型HCV感染者中，約10%的患者出現(xiàn)L159F突變[14]。與野生型HCV病毒株相比，C316位點(diǎn)相關(guān)的RAS使病毒對(duì)達(dá)塞布韋藥物EC50倍數(shù)的改變可超過1000倍[15]。有研究[19]發(fā)現(xiàn)在基因3型HCV感染者中，治療失敗組中L159F位點(diǎn)相關(guān)RAS的出現(xiàn)率約為15%，而在初治組中則<5%。

L159F與C316N也經(jīng)常會(huì)在治療失敗的患者中同時(shí)出現(xiàn)。一項(xiàng)對(duì)治療失敗的患者進(jìn)行深度測序分析的研究[10]發(fā)現(xiàn)，在使用萊迪派韋聯(lián)合索磷布韋及達(dá)卡他韋聯(lián)合索磷布韋治療失敗的患者中，L159F與C316N同時(shí)出現(xiàn)的概率分別為48.6%與50%?？梢娫谑褂盟髁撞柬f治療失敗的患者中，近一半的患者體內(nèi)感染的HCV基因中可檢測到L159F與C316N同時(shí)出現(xiàn)的情況。

2.3 M289位點(diǎn)相關(guān)的RAS M289相關(guān)的RAS可在基因2型HCV感染者中出現(xiàn)，主要突變?yōu)镸289L，其在基因2型中分布率約為1.8%[20]。但是它們對(duì)病毒耐藥性的影響較小，與野生型病毒株相較，含有M289相關(guān)RAS的病毒株對(duì)索磷布韋的EC50倍數(shù)改變均小于2倍[17]。

2.4 NS5B片段其他位點(diǎn)相關(guān)的RAS 有研究[13]在基因3型HCV中觀察到E237G與V321A等位點(diǎn)的突變，但并無詳細(xì)的報(bào)道。過去在使用含索磷布韋的DAA治療方案失敗的患者中，可檢測到A150V與K206E兩個(gè)RAS，這兩個(gè)RAS可能使病毒對(duì)索磷布韋敏感性產(chǎn)生影響。其中A150V使病毒對(duì)索磷布韋EC50改變?yōu)橐吧筒《局甑?.75倍，K206E造成的改變?yōu)?.34倍。在一項(xiàng)研究中報(bào)道，A150V的分布率約為50%，K206E的分布率接近20%，并且在有關(guān)SVR的分析中，有A150V的患者與無A150V的患者間SVR的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。此外，A150V與K206E兩個(gè)RASs還可以同時(shí)出現(xiàn)于HCV基因中，當(dāng)它們同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，HCV對(duì)索磷布韋EC50倍數(shù)的改變比單個(gè)RAS存在時(shí)EC50倍數(shù)改變更高，EC50是野生型病毒株的35.77倍。研究[21]還發(fā)現(xiàn)，當(dāng)病毒株中K100R與G188D同時(shí)出現(xiàn)時(shí)，對(duì)索磷布韋EC50的改變是野生型病毒株的31.8倍。

3 RAS在NS5A中的分布

與NS5A基因片段相關(guān)的RAS特點(diǎn)是其種類多，覆蓋了廣泛的基因型，并且具有較低的耐藥屏障[11]。NS5A相關(guān)的RAS對(duì)病毒的耐藥具有非常重要的影響。以往研究[22]顯示，16%的基因3型HCV感染者在基線期時(shí)NS5A基因片段上可檢測到RAS。在基因2、3型HCV感染者中，NS5A相關(guān)的RAS主要包括Y93、A30、L31等位點(diǎn)相關(guān)的RAS[13]。

3.1 Y93位點(diǎn)相關(guān)的RAS Y93位點(diǎn)相關(guān)的RAS可使病毒對(duì)多種藥物產(chǎn)生耐藥。Y93位點(diǎn)相關(guān)的RAS在基因2型HCV感染者中總體分布率約為1.49%，在基因3型HCV感染者中總體分布率約為3.5%[20]。在Y93位點(diǎn)上，與2、3型HCV有關(guān)的RAS為Y93H。在一項(xiàng)研究[18]中，使用萊迪派韋聯(lián)合索磷布韋或達(dá)卡他韋聯(lián)合索磷布韋方案的患者中，基因3型HCV初治患者Y93H總體出現(xiàn)率為2%，在萊迪派韋聯(lián)合索磷布韋治療失敗的患者中出現(xiàn)率為0，但在達(dá)卡他韋聯(lián)合索磷布韋治療失敗的患者中出現(xiàn)率高達(dá)66%。另一項(xiàng)研究[23]也對(duì)NS5A治療失敗的患者進(jìn)行了耐藥相關(guān)的研究，結(jié)果顯示在使用萊迪派韋聯(lián)合索磷布韋或達(dá)卡他韋聯(lián)合索磷布韋治療失敗的基因3型HCV感染者中，Y93H在萊迪派韋聯(lián)合索磷布韋經(jīng)治患者中出現(xiàn)率為17.4%，而在達(dá)卡他韋聯(lián)合索磷布韋經(jīng)治患者中出現(xiàn)率高達(dá)70.6%，這一研究顯示了在基因3型HCV感染者中，Y93H在使用不同DAA方案治療的經(jīng)治患者中出現(xiàn)率的差異，Y93H在接受達(dá)卡他韋聯(lián)合索磷布韋方案治療失敗的患者中具有較高的分布率，這與前面的研究結(jié)果是一致的。

在與維帕他韋相關(guān)的研究中，與野生型病毒株相比，Y93H的出現(xiàn)對(duì)維帕他韋EC50倍數(shù)的改變?cè)诨?a型HCV中為45.7倍，在基因3a型HCV中為723.5倍[24-25]。在基因3型HCV感染的肝硬化患者中，Y93H的出現(xiàn)會(huì)降低使用索磷布韋/維帕他韋治療后的SVR率[26]。一項(xiàng)研究[27]對(duì)基因3型HCV感染者的治療進(jìn)行了分析，在使用索磷布韋聯(lián)合維帕他韋的患者中，不伴有肝硬化的患者，基線時(shí)檢測到Y(jié)93H突變且達(dá)到SVR的患者占90%，未檢測到Y(jié)93H突變并達(dá)到SVR的患者占99%；伴有肝硬化的患者，基線時(shí)檢測到Y(jié)93H突變且達(dá)到SVR的患者占50%，未檢測到Y(jié)93H突變達(dá)到SVR的患者占93%。使用了維帕他韋方案治療的基因3型HCV感染者中，既往治療失敗的患者里約80%出現(xiàn)Y93H突變，而初治的患者中僅約15%出現(xiàn)此突變。使用哌侖他韋的患者中，治療失敗患者中有約86%出現(xiàn)Y93H突變，而初治患者中僅14%出現(xiàn)此突變[19]。另外，有一項(xiàng)來自日本的研究[28]，對(duì)使用了格卡瑞韋聯(lián)合哌侖他韋方案的患者進(jìn)行了耐藥相關(guān)研究，研究發(fā)現(xiàn)在基因1b型再治療組中，患者基線時(shí)出現(xiàn)Y93位點(diǎn)上RAS的時(shí)候，SVR12會(huì)比不含這個(gè)RAS的患者更高(100% vs 80%，P=0.022)，但未對(duì)基因2、3型的患者進(jìn)行類似的分析。

3.2 A30與L31相關(guān)的RAS A30與L31位點(diǎn)相關(guān)的RAS主要影響基因3型HCV對(duì)藥物的敏感性。A30與L31相關(guān)的RAS在基因3型HCV中自然分布率分別為6.38%與5.79%[20]。這兩個(gè)位點(diǎn)的RAS單獨(dú)存在時(shí)，與野生型病毒株相較，A30K使病毒對(duì)達(dá)卡他韋EC50倍數(shù)改變?yōu)?17倍，對(duì)維帕他韋為50倍；L31I使病毒對(duì)達(dá)卡他韋EC50倍數(shù)改變?yōu)?40倍，L31M使病毒對(duì)達(dá)卡他韋EC50倍數(shù)改變?yōu)?37倍，對(duì)維帕他韋EC50倍數(shù)改變?yōu)?1倍。當(dāng)病毒NS5A基因片段上A30與L31位點(diǎn)同時(shí)出現(xiàn)RAS時(shí)，病毒對(duì)藥物的敏感性改變大大加強(qiáng)，當(dāng)同時(shí)出現(xiàn)A30K與L31I時(shí)，病毒對(duì)哌侖他韋EC50倍數(shù)改變?yōu)?.6倍，對(duì)維帕他韋大于100倍[13]。一項(xiàng)研究[29]報(bào)道了在基因3型HCV感染、使用索磷布韋聯(lián)合達(dá)卡他韋治療失敗，且基線期檢測到A30K的患者中，67%在使用包含索磷布韋方案復(fù)治后達(dá)到了SVR12。A30K在治療失敗的患者中分布率約為55%，而在初治患者中，其RAS分布率約為21%[19]。L31位點(diǎn)相關(guān)的RAS在治療失敗的患者中出現(xiàn)率為71.4%[30]。在基因3型HCV感染者中，L31M在治療失敗患者中分布率約為8%，而在初治患者中僅約為2%[19]。

3.3 P32位點(diǎn)相關(guān)的RAS 在一項(xiàng)研究[30]中，P32del在治療失敗的患者中出現(xiàn)率為7.1%。P32del RAS對(duì)多種NS5A抑制劑具有較強(qiáng)的耐藥作用[31]。此RAS主要影響哌侖他韋的治療效果，使病毒對(duì)哌侖他韋EC50倍數(shù)改變?yōu)橐吧筒《局甑?032倍[32]。一項(xiàng)日本的研究[28]發(fā)現(xiàn)2例檢測到P32del的患者，在格卡瑞韋聯(lián)合哌侖他韋方案三期臨床試驗(yàn)中均治療失敗，研究中認(rèn)為P32del的出現(xiàn)會(huì)明顯降低哌侖他韋的敏感性。目前關(guān)于P32del的研究相較其他RAS的研究較少，但隨著格卡瑞韋聯(lián)合哌侖他韋方案在國內(nèi)上市，P32del RAS也應(yīng)逐漸引起重視。

3.4 NS5A片段其他位點(diǎn)相關(guān)的RAS P58位點(diǎn)相關(guān)的RAS在基因2型HCV中分布率為2.74%，在基因3型HCV中分布率為14.45%，P58A使得基因2型HCV對(duì)維帕他韋的EC50倍數(shù)改變較野生型病毒株大于2.5倍，P58G使基因3型HCV對(duì)維帕他韋EC50倍數(shù)改變大于2.5倍[33]。S62位點(diǎn)相關(guān)的RAS在基因3型HCV中分布率為5.24%；V153位點(diǎn)相關(guān)的RAS在基因3型HCV中分布率為3.14%[20]。

4 總結(jié)

從2016年RAS相關(guān)的研究與2019年相關(guān)研究的對(duì)比中，有許多新的RAS被發(fā)現(xiàn)，有關(guān)RAS在藥物壓力選擇方面的研究也增加。在DAA治療失敗的基因2、3型HCV感染者中，接受過不同DAA藥物組合治療后失敗的患者，RAS的分布具有差異，反映出RAS對(duì)不同的DAA藥物組合具有不同的影響。通過對(duì)RAS的檢測可以優(yōu)化DAA的治療，但由于檢測技術(shù)及成本等原因，RAS的檢測難以在臨床中廣泛應(yīng)用。DAA的出現(xiàn)使得丙型肝炎治愈成為了現(xiàn)實(shí)。無論是從臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)，還是真實(shí)世界的研究來看，DAA的治愈率都是可觀的[34]。但由于HCV是RNA病毒，其具有易突變的特點(diǎn)，因此在DAA廣泛使用的同時(shí)，繼續(xù)對(duì)RAS進(jìn)行相關(guān)研究仍是具有意義的[35]。

作者貢獻(xiàn)聲明：陳宏宇負(fù)責(zé)文獻(xiàn)收集，撰寫文章；徐小元負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。