李衛(wèi)霞，陳劍華，王艷芳，李紅民，劉曉霞，郭旭麗，安曉東，*

（1.河北工程大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，河北邯鄲056002；2.晨光生物科技集團有限公司，河北邯鄲057250；3.河北省植物天然色素產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，河北邯鄲057250；4.河北工程大學(xué)生命科學(xué)與食品學(xué)院，河北邯鄲056002）

近年來，隨著生活質(zhì)量的提高，自由基和氧化作用對身體的損傷成為醫(yī)學(xué)研究的熱點之一，開發(fā)具有藥理功能的天然色素成為研究的新方向?；ㄉ眨╝ntho cyanins）又稱花青素，屬多酚類化合物，是由花色苷和多糖經(jīng)糖苷鍵結(jié)合而成[1]。研究發(fā)現(xiàn)，歐洲越橘花色苷作為一種天然抗氧化劑，在抗腫瘤[2]、抑制炎癥[3]、降低血脂、增強血管彈性[3-4]等方面均能發(fā)揮作用。黑米是我國重要的功能稻資源，價格低廉，且其糙米果皮和種皮內(nèi)富集有天然花色苷化合物，但其開發(fā)應(yīng)用較少。歐洲越橘花色苷作為重要的抗氧化劑，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）列為無需認證的食品添加劑，廣泛用于飲料、乳制品、糕點及醫(yī)藥行業(yè)[5]。目前對黑米花色苷的研究主要集中在花色苷的提取、分離、純化及其抗氧化性關(guān)系的研究方面[6-9]，而黑米花色苷與歐洲越橘花色苷體內(nèi)抗氧化水平差異還不清楚。本課題以黑米、歐洲越橘花色苷提取物為主要材料，通過動物體內(nèi)實驗，觀察黑米花色苷提取物的抗氧化作用，并比較其與歐洲越橘花色苷在體內(nèi)抗氧化作用差異及其對小鼠肝功的影響，為開發(fā)具有較強生理和藥理功能而又價格低廉花色苷產(chǎn)品提供有效的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器

歐洲越橘花色苷提取物（花色苷含量25%）：南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司；黑米花色苷提取物（花色苷含量13.5%）：晨光生物科技集團股份有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、總抗氧化能力（total antioxidant capability，T-AOC）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransfease，ALT）試劑盒：南京建成生物工程研究所；iMark全自動酶標儀：美國Bio-Rad公司；UV1102型紫外可見分光光度儀：上海天美科學(xué)儀器有限公司；日立7170A型全自動生化分析儀：日本Hitachi公司。

1.1.2 實驗動物

清潔級雄性昆明鼠大鼠70只，體重20 g左右:購自河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2 方法

1.2.1 實驗動物分組和給藥

小鼠按照體重隨機分為：對照組（normal control，NC）、黑米花色苷低劑量組（low dosage of anthocyanins from black rice，LBR）、黑米花色苷中劑量組（middle dosage of anthocyanins from black rice，MBR）、黑米花色苷高劑量組（high dosage of anthocyanins from black rice，HBR）、歐洲越橘花色苷低劑量組（low dosage of anthocyanins from European bilberry，LEB）、歐洲越橘花色苷中劑量組（middle dosage of anthocyanins from European bilberry，MEB）、歐洲越橘花色苷高劑量組（high dosage of anthocyanins from European bilberry，HEB），共計7組，每組10只。通過灌胃方式給小鼠灌服花色苷水溶液，參考周艷華等方法[10]，低劑量組0.5 g/（kgbw·d）、中劑量組1.0 g/（kgbw·d）、高劑量組1.5 g/（kgbw·d），對照組小鼠灌服等量的蒸餾水，給藥期間小鼠自由飲水、攝食，連續(xù)給藥6周。每天觀察小鼠毛色、飲食、大小便、活動狀況，每天稱重并根據(jù)體重調(diào)整給藥劑量。

1.2.2 小鼠血清中抗氧化指標測定

小鼠灌胃結(jié)束，空腹12h，眼眶采血，以3 000 r/min、4℃離心10 min，分離血清。血清中SOD、CAT、T-AOC的檢測嚴格按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行操作。

1.2.3 小鼠血清ALT、AST測定

由河北工程大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗科生化室通過全自動生化分析儀測定。

1.2.4 小鼠肝組織中抗氧化指標測定

小鼠灌胃結(jié)束，空腹12 h，脫頸處死小鼠并分離肝臟組織，按質(zhì)量比1∶9加入預(yù)冷的組織勻漿液[0.01 mol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸（tris hydroxymethyl aminomethan-hydrochloride，Tris-HCl），0.001 mol/L 乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt，EDTA-2Na），0.01 mol/L 蔗糖，0.8%NaCl，pH 7.4]，制備肝組織勻漿液，4℃3 500 r/min離心10 min，取組織勻漿上清液，按照二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定試劑盒操作步驟測定蛋白質(zhì)含量。肝組織中SOD、CAT、T-AOC的檢測，嚴格按照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進行操作。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

利用GraphPad Prism5.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以±s表示，組間差異比較采用t檢驗，P＜0.05為有顯著性差異，P＜0.01為有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑米與歐洲越橘花色苷對小鼠血清AST、ALT的影響

用黑米花色苷及歐洲越橘花色苷提取物對小鼠灌胃6周，采集小鼠血清，檢測血清中AST、ALT水平，結(jié)果見表1。

表1 黑米與歐洲越橘花色苷對小鼠血清AST、ALT的影響（±s，n=10）Table 1 The effects of anthocyanins from black rice and European bilberry on AST and ALT in serum of mice（±s，n=10）

表1 黑米與歐洲越橘花色苷對小鼠血清AST、ALT的影響（±s，n=10）Table 1 The effects of anthocyanins from black rice and European bilberry on AST and ALT in serum of mice（±s，n=10）

注：*代表與NC組相比P＜0.05，差異顯著；**代表與NC組相比P＜0.01，差異極顯著。

分組 ALT/（U/L） AST/（U/L）NC 47.4±5.05 165.00±10.56 LBR 42.80±0.35 132.34±11.34 MBR 34.13±6.52* 125.00±15.13*HBR 33.35±4.50* 102.25±12.12*LEB 43.81±0.45 122.89±11.50*MEB 37.43±4.62* 117.12±8.13**HEB 30.65±6.74** 103.28±6.12**參考值 30～52 96～200

結(jié)果顯示：隨著花色苷劑量的增加，小鼠血清AST、ALT活力均有所降低；與對照組相比，中、高劑量歐洲越橘及黑米花色苷均能顯著降低小鼠血清ALT、AST水平（P＜0.05），且在同等劑量時，黑米與歐洲越橘花色苷對小鼠血清AST、ALT影響無顯著差異（P>0.05）。表明黑米及歐洲越橘花色苷均對小鼠肝臟發(fā)揮一定的保護作用。

2.2 黑米與歐洲越橘花色苷對小鼠血清T-AOC、SOD和CAT活力的影響

用黑米花色苷及歐洲越橘花色苷提取物對小鼠灌胃6周，采集小鼠血清并檢測SOD、CAT和T-AOC活力，結(jié)果見圖1。

圖1 小鼠血清SOD、CAT和T-AOC活力檢測（n=10）Fig.1 Activity detection of SOD，CAT and T-AOC in serum of mice（n=10）

結(jié)果顯示：小鼠血清SOD、CAT和T-AOC活力均隨花色苷提取物劑量的增加逐漸上升，且與對照組相比有顯著差異（P＜0.05）；在同等劑量情況下，黑米與歐洲越橘花色苷提取物對小鼠血清SOD、CAT活力的影響無顯著差異（P>0.05）；但在低劑量時，歐洲越橘花色苷對小鼠肝臟T-AOC活力的提高顯著低于黑米花色苷（P<0.05）。表明黑米及歐洲越橘花色苷提取物均能提高小鼠血清抗氧化水平，且在低劑量條件下黑米花色苷提取物總抗氧化作用水平高于歐洲越橘花色苷。

2.3 黑米與歐洲越橘花色苷對小鼠肝臟SOD、GSHPx和MDA的影響

黑米花色苷及歐洲越橘花色苷對小鼠灌胃6周，采集小鼠肝臟并制備勻漿液，檢測小鼠肝臟組織中SOD、GSH-Px以及MDA含量，結(jié)果見圖2。

圖2 小鼠肝臟SOD、GSH-Px和MDA活力檢測（n=10）Fig.2 Detection of SOD，GSH-Px and MDA in liver of mice（n=10）

結(jié)果顯示：與對照組相比，歐洲越橘及黑米花色苷均能顯著提高小鼠肝臟SOD和GSH-Px活力；且在低劑量時，黑米花色苷對小鼠肝臟GSH-Px活力的提高顯著高于歐洲越橘花色苷組（P<0.05）。與對照組相比，低、中、高劑量黑米及歐洲越橘花色苷均能顯著降低小鼠肝臟MDA含量，且在同等劑量時，黑米與歐洲越橘花芭苷對小鼠肝臟MDA的清除能力無顯著差異。表明黑米及歐洲越橘花色苷均能提高小鼠肝臟抗氧化水平，且在低劑量時黑米花色苷提取物在肝臟中抗氧化作用水平優(yōu)于歐洲越橘花色苷。

3 討論

黑米花色苷主要成分包括錦葵素、天竺葵-3，5-二葡萄糖苷、矢車菊素-3-葡萄糖苷和矢車菊素-3，5-二葡萄糖苷等，是黑米抗氧化作用的主要成分[11]。不同品種、產(chǎn)地黑米所含花色苷的主要成分會有所差異，此外黑米中含有人體需要的氨基酸、多種維生素、不飽和脂肪酸及微量元素等營養(yǎng)成分，均會影響花色苷提取物的抗氧化性能[12]。

本研究發(fā)現(xiàn)黑米與歐洲越橘花色苷均能顯著提高小鼠血清抗氧化水平，該結(jié)果與石娟等采用高、中、低3種劑量的黑米花青素粗提物及其純化物灌胃小鼠實驗結(jié)果一致[13]。本研究證實在同等劑量時黑米與歐洲越橘花色苷對小鼠血清SOD、CAT的影響無顯著差異，但在低劑量時黑米花色苷對小鼠血清總抗氧化水平以及肝臟中GSH-Px的提高顯著高于歐洲越橘花色苷，該結(jié)果尚未見文獻報道。研究證明黑米中花色苷主要有矢車菊素-3-葡萄糖苷和芍藥定-3-葡萄糖苷，其含量分別為25.7%和1.7%[14]，而歐洲越橘含量最多的花色苷為矢車菊素-3-半乳糖苷，其次為矢車菊素-3-葡萄糖苷，分別占花色苷含量的13.18%和11.83%[15]。由于不同的花色苷增效基數(shù)目和位置不同，其抗氧化活性表現(xiàn)出了一定的差異[16]，因而推測黑米與歐洲越橘所含主要花色苷成分的不同也是造成其抗氧化性能差異的主要原因。本項目中測試樣品為花色苷粗提物，前期研究發(fā)現(xiàn)黑米花色苷提取物與所用歐洲越橘花色苷提取物主要成分為多糖和花色苷，且兩者在總糖、蛋白質(zhì)、脂肪以及花色苷含量等方面均有顯著差異[17]，所用花色苷成分復(fù)雜，因而不同劑量花色苷提取物造成兩者氧化性能差異不同，具體原因有待進一步分析鑒定。

研究資料顯示，歐洲越橘花色苷能通過提高機體氧化應(yīng)激能力，對鎘、CCl4誘導(dǎo)的肝損傷及酒精性肝損傷小鼠模型發(fā)揮保護作用[18-19]。項目組前期研究結(jié)果證實，黑米與歐洲越橘花色苷提取物對小鼠體重及心臟、肝、腎臟等主要臟器指數(shù)影響無顯著差異[20]，本研究進一步證明，黑米花色苷在一定程度上能降低小鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶含量，降低程度與同等劑量歐洲越橘相比無顯著差異，表明黑米花色苷在一定程度上能保護肝臟功能。田密霞等通過給實驗性糖尿病小鼠灌胃藍莓花色苷4周，發(fā)現(xiàn)藍莓花色苷可顯著降低糖尿病小鼠肝臟中的丙二醛含量，谷胱甘肽過氧化物酶活性及總抗氧化能力均顯著增加，并保持肝臟細胞的完整性[21]，該結(jié)果與本項目實驗結(jié)果一致。進一步檢測肝組織抗氧化指標，結(jié)果表明二者均能提高肝臟抗氧化作用水平，但低劑量黑米花色苷對GSHPx的提高優(yōu)于歐洲越橘。項目組前期體外實驗同樣發(fā)現(xiàn)黑米花色苷對SOD的提高優(yōu)于歐洲越橘花色苷[17]，該結(jié)果進一步提示黑米花色苷可作為一種優(yōu)良的天然抗氧化劑，能通過提高機體抗氧化作用水平對肝臟發(fā)揮保護作用，但關(guān)于黑米花色苷對肝臟保護作用的確切機理還需要進一步研究。

4 結(jié)論

黑米花色苷作為一種天然抗氧化劑，與歐洲越橘花色苷相比具有較強或相近的抗氧化功能，可以通過提高血清和肝臟組織內(nèi)抗氧化作用水平，有效地降低小鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶水平，對肝臟發(fā)揮一定的保護作用。因此，黑米花色苷可以作為一種物美價廉的抗氧化劑應(yīng)用于保肝護肝類保健品的開發(fā)。