王 敏，閆貴云，左靜靜

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太原030031）

小麥常用的育種方法主要有雜交育種、誘變育種、單倍體育種、分子設(shè)計(jì)育種等[1-2]。其中，單倍體育種具有育種年限低、后代選擇效率高等[3]優(yōu)點(diǎn)，是近年來科研工作者比較青睞的方法。普通小麥為異源六倍體，其染色體有42條，單倍體小麥為三倍體，有21條染色體[3]。因此，單倍體植株的基因型和表現(xiàn)型是完全一致的，為研究遺傳性狀和育種提供優(yōu)質(zhì)材料。目前產(chǎn)生小麥單倍體的途徑主要有離體培養(yǎng)、孤雌生殖等。筆者從這兩大類途徑出發(fā)，對(duì)其具體的方法進(jìn)行對(duì)比分析和闡述，以期為后續(xù)的單倍體育種研究工作提供基礎(chǔ)。

1 離體培養(yǎng)

小麥離體培養(yǎng)是指通過無菌操作分離小麥的一部分，接種于人工配制的培養(yǎng)基上，在人工控制的條件下進(jìn)行離體培養(yǎng)最終獲得再生植株的技術(shù)，主要包括花藥離體培養(yǎng)和花粉離體培養(yǎng)。

1.1 花藥離體培養(yǎng)

花藥離體培養(yǎng)是小麥單倍體育種中比較成熟的方法之一，該方法自20世紀(jì)70年代開始在我國(guó)推廣使用，但目前仍然存在基因依賴型、綠苗分化率低等難以克服的缺點(diǎn)。小麥的遺傳物質(zhì)對(duì)花藥培養(yǎng)的影響最為顯著。LANTOS等[4]以4種小麥材料及10種F1的品種進(jìn)行雙列雜交研究，結(jié)果表明，綠苗分化率最高的為85%，最低為6.3%。李雪等[5]通過9種小黑麥品系進(jìn)行花藥培養(yǎng)研究，結(jié)果表明，TZ26、TZ25和P4的出愈率及綠苗分化率較高，石大1號(hào)的出愈率較高，但綠苗分化率低。宋運(yùn)賢等[6]通過采用完全雙列雜交方法對(duì)部分皖北栽培小麥花藥誘導(dǎo)率進(jìn)行一般配合力效應(yīng)、特殊配合力效應(yīng)分析，并估算其遺傳參數(shù)，結(jié)果表明，新麥208、煙農(nóng)19、煤生0308具有較高的誘導(dǎo)率。大量研究表明，小麥花藥離體培養(yǎng)的出愈率和綠苗再生主要受核基因控制[7-8]，同時(shí)也可能受細(xì)胞質(zhì)因素[9-10]的影響；愈傷組織和綠苗再生是彼此獨(dú)立的、受多基因控制的數(shù)量性狀[11-13]。趙林姝等[14]以突變新種質(zhì)H307與優(yōu)質(zhì)早熟品種鄭麥9023為親本，構(gòu)建了含有131個(gè)株系的重組自交系群體，檢測(cè)到4個(gè)與愈傷組織誘導(dǎo)率、綠苗產(chǎn)率、白苗分化率相關(guān)的QTL，分別位于5B、6B和3D染色體上；TORP[15]應(yīng)用RFLP技術(shù)發(fā)現(xiàn)3個(gè)與綠苗率相關(guān)的QTL位點(diǎn)，分別在2AL、2BL、5BL上。這些結(jié)果為解決小麥花藥的基因型限制問題奠定了一定的理論基礎(chǔ)。

培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對(duì)花藥培養(yǎng)也有不可替代的作用。楊雪等[16]以小麥花藥為材料，對(duì)MS、N6、C17和K4這4種培養(yǎng)基在小麥花藥離體培養(yǎng)中愈傷組織的誘導(dǎo)作用進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，小麥花藥在4種培養(yǎng)基中愈傷組織誘導(dǎo)率從大到小排序?yàn)镵4＞C17＞N6＞MS。楊雪等[17]以C17為基本培養(yǎng)基，研究了低溫預(yù)處理和聚乙二醇對(duì)小麥花藥出愈率的影響，結(jié)果表明，低溫預(yù)處理4 d的小麥花藥出愈率最高（2.108%），且穩(wěn)定性較好（變異系數(shù)0.067），在培養(yǎng)基中加入100 mg/L PEG可顯著提高小麥花藥出愈率。趙永英等[18]通過在培養(yǎng)基中添加不同濃度的噻重氮苯基脲（Thidiazuron，TDZ）探討其對(duì)小麥花藥培養(yǎng)的作用，結(jié)果表明，TDZ的作用與添加劑量及小麥基因型密切相關(guān)，在分化培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L的TDZ能夠顯著提高綠苗分化率（最高可達(dá)50.0%）和綠苗與白苗比率（最高為1.9）。呂學(xué)蓮等[19]以103份不同基因型小麥為材料進(jìn)行花藥培養(yǎng)，結(jié)果表明，在愈傷組織誘導(dǎo)方面，C17培養(yǎng)基明顯優(yōu)于W14，而在綠苗分化方面，W14培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生的愈傷組織綠苗分化的效果更好，同時(shí)高溫培養(yǎng)比不進(jìn)行高溫培養(yǎng)的愈傷誘導(dǎo)率高。因此，要選擇合適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件進(jìn)行花藥離體培養(yǎng)，以期提高小麥的出愈率，降低白化苗的產(chǎn)生。

1.2 花粉離體培養(yǎng)

花粉培養(yǎng)是指當(dāng)花粉發(fā)育到一定階段，從花藥中取出花粉所進(jìn)行的單細(xì)胞無菌培養(yǎng)。小麥花粉培養(yǎng)又稱小孢子培養(yǎng)，主要通過胚胎途徑直接發(fā)育成植株，避免了愈傷組織階段，減少因孢子體變異而引起的農(nóng)藝性狀退化，顯著提高單倍體產(chǎn)生頻率和減少白化苗的產(chǎn)生量[20]。

1993年，TUVESSON等[21]首先培養(yǎng)出了小麥的小孢子植株。隨后，小麥的花粉培養(yǎng)技術(shù)得到了較廣泛的研究和應(yīng)用。胡含等[22]研究表明，90%的小麥花粉植株為染色體構(gòu)型較穩(wěn)定的單倍體和二倍體，其余10%的花粉植株為非整倍體、多倍體和混倍體，豐富和發(fā)展了小麥花粉離體培養(yǎng)的遺傳學(xué)理論。李波等[23]以4個(gè)小麥品種為材料，對(duì)培養(yǎng)基中的蔗糖濃度、外源激素等對(duì)離體花粉中小孢子細(xì)胞分裂啟動(dòng)的誘導(dǎo)效果進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小麥花粉培養(yǎng)的最適蔗糖濃度為3%，蔗糖濃度高于9%時(shí)不能啟動(dòng)花粉粒的脫分化及雄核發(fā)育，這說明外源激素的存在是花粉脫分化并進(jìn)入雄核發(fā)育的必要條件，2，4-D在誘導(dǎo)花粉粒轉(zhuǎn)向孢子體發(fā)育的過程中起主要作用。章靜娟等[24]進(jìn)一步研究不同雜交組合、不同培養(yǎng)基的因素對(duì)F1花粉植株再生的影響，結(jié)果表明，F(xiàn)1花粉植株再生頻率在不同組合之間存在顯著性差異；植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑4PU-30和C17、K3、W14等3種培養(yǎng)基對(duì)花藥的花粉出愈率、綠苗分化率和綠苗產(chǎn)量也產(chǎn)生影響。侯立江等[25]研究表明，小麥成熟花粉在20%蔗糖＋10% PEG4000＋40 mg/L H3BO3＋3×10-3mol/L Ca（NO3）2＋10 mg/L VB1中28℃培養(yǎng)30 min，通過鏡檢觀察，可誘導(dǎo)萌發(fā)頻率高達(dá)90%以上。楊隨莊[26]則研究發(fā)現(xiàn)，植物血凝素（PHA）對(duì)小麥花粉的誘導(dǎo)頻率也有影響。朱宏等[27]研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)幼穗花藥的低溫前處理有利于花粉細(xì)胞分裂的啟動(dòng)，經(jīng)6～9 d 7℃前處理于25～27℃下24～36 h培養(yǎng)，有利于花粉細(xì)胞分裂的啟動(dòng)?；ǚ垭x體培養(yǎng)的再生能力不僅僅與親本密切相關(guān)，在進(jìn)行小麥花粉培養(yǎng)時(shí)，要選擇農(nóng)藝性狀優(yōu)良的親本，同時(shí)，選用合適的培養(yǎng)基和外源激素在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)，將有利于提高小麥花粉植株的再生頻率。

2 孤雌生殖

孤雌生殖是指雌配子體不經(jīng)過受精，在自身基因控制或其他因素刺激下直接發(fā)育成胚的一種無融合的生殖方式[28]。由于自發(fā)產(chǎn)生率低，常采用人工誘導(dǎo)的方法進(jìn)行孤雌生殖，常用的方法有輻射花粉、化學(xué)誘導(dǎo)、異種屬花粉延遲授粉、異種屬細(xì)胞質(zhì)-核替換法、遠(yuǎn)緣雜交等。

2.1 輻射花粉

輻射花粉授粉是指將父本花粉通過紫外線或γ、X、60Co、32P等射線照射后，然后授粉給去雄的母本，從而影響其受精過程誘發(fā)的孤雌生殖。輻射花粉誘導(dǎo)雌核發(fā)育單倍體的原理一般認(rèn)為有2種：一種認(rèn)為，花粉被射線照射時(shí)，生殖核喪失活力，只能刺激卵細(xì)胞分裂發(fā)育，不能起到受精的作用；另一種觀點(diǎn)認(rèn)為，生殖核染色體數(shù)目異常不能與卵細(xì)胞配對(duì)導(dǎo)致無法受精[29]。一般認(rèn)為，該方法與小麥的基因型、輻射源和劑量等因素有關(guān)。李德炎[30]用被X射線照射過的1粒小麥花粉給未授粉的小麥柱頭授粉，誘導(dǎo)率為17.6%。胡啟德等[31]用60Co-γ線處理普通小麥的花粉，給去雄的雜種F1植株授粉，誘導(dǎo)孤雌生殖，結(jié)果表明，劑量6 000 Gy的誘導(dǎo)成功率最高為7.5%。王獻(xiàn)平[32]在誘導(dǎo)小麥-中間偃麥草易位系的工作中得到了比較理想的結(jié)果（易位頻率為2.9%），其通過進(jìn)一步研究報(bào)道了利用低劑量γ射線輻射花粉的方法誘導(dǎo)小麥-濱麥易位系，這為小麥利用其他種屬的優(yōu)良基因改善其自身的品種奠定了基礎(chǔ)。

2.2 化學(xué)誘導(dǎo)

化學(xué)誘導(dǎo)是指將小麥母本去雄，然后用化學(xué)試劑誘導(dǎo)小麥進(jìn)行孤雌生殖。這種方法操作簡(jiǎn)單，目前發(fā)現(xiàn)，DMSO、PCPA、KT、2，4-D、NAA、GA3、TRTA、DMSO＋對(duì)氯苯氧乙酸、DMSO＋KT、DMSO＋GA3、DMSO＋NAA、DMSO＋鄰氯苯氧乙酸、DMSO＋KT＋鄰氯苯氧乙酸等都可以成功地誘導(dǎo)小麥進(jìn)行孤雌生殖[33]。不同的化學(xué)試劑和濃度對(duì)小麥的誘導(dǎo)效果不同。孫耀中等[34]研究發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物雌激素的誘導(dǎo)效果按照誘導(dǎo)結(jié)實(shí)率的大小排序?yàn)榧椎卦型?.34%）＞炔諾酮（1.01%）＞乙烯雌酚（0.98%）；對(duì)氯苯氧乙酸以500 mg/L的誘導(dǎo)結(jié)實(shí)率最高，為4.6%，肌醇以100 mg/L的誘導(dǎo)結(jié)實(shí)率最高，為4.2%，2，4-D以10 mg/L的誘導(dǎo)結(jié)實(shí)率最高，為3.4%。陳傳永等[35]以16個(gè)品系為材料，在3月底用1 500 mL/hm2津奧啉對(duì)小麥進(jìn)行去雄處理，然后套袋隔離直至收獲。5月份用不同的誘導(dǎo)劑進(jìn)行孤雌生殖誘導(dǎo)，結(jié)果表明，適當(dāng)濃度的NAA、GA3、Col、MH都有利于誘導(dǎo)小麥，且含有Ca（NO3）2的配方中，結(jié)實(shí)率比較高。其具體的誘導(dǎo)機(jī)制不詳，仍需進(jìn)一步探究。

2.3 異種屬花粉延遲授粉

卵細(xì)胞接受親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的花粉很難受精，但卻能受到刺激從而孤雌生殖產(chǎn)生單倍體。異種屬花粉誘導(dǎo)小麥孤雌生殖的誘導(dǎo)率一般比較低，因此，往往結(jié)合延遲授粉的方法提高誘導(dǎo)率。常用的異種屬一般為黑麥，但誘導(dǎo)結(jié)實(shí)率一般不超過5%[36-37]。陶少武等[38]研究發(fā)現(xiàn)，用由硬粒小麥和黑麥雜交并加倍后的六倍體小黑麥作為授粉者，結(jié)實(shí)率最高可達(dá)到17.7%，可能是由于六倍體小黑麥容易在普通小麥柱頭上萌發(fā)并順利到達(dá)胚囊，只能刺激卵細(xì)胞分裂，自身精核不易與卵細(xì)胞融合而最終崩解。多數(shù)研究表明，一般延遲7～9 d授粉的效果較好[30，35-36]。苗芳等[39]采用延遲7～9 d的授粉和石蠟切片的方法，研究了黑麥花粉、小黑麥花粉以及黑麥和小黑麥花粉分段授粉誘導(dǎo)小麥孤雌生殖，結(jié)果表明，用黑麥和小黑麥花粉分段授粉時(shí)，不僅易形成胚乳，而且易形成同時(shí)具有胚和胚乳的胚囊，其誘導(dǎo)頻率最高為23.1%。

2.4 異種屬細(xì)胞質(zhì)-核替換法

KIHARA[40]研究發(fā)現(xiàn)，某些山羊草的細(xì)胞質(zhì)和普通小麥的細(xì)胞核組成的核質(zhì)雜種，具有雄性不育的特點(diǎn)，能夠產(chǎn)生較高頻率的單倍體。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞質(zhì)供體[41]主要有：尾狀山羊草、粘果山羊草、易變山羊草、高大山羊草、歐山羊草、離果山羊草、小亞山羊草和小傘山羊草、二角山羊草和偏凸山羊草。這些山羊草在作為細(xì)胞質(zhì)的供體時(shí)各有優(yōu)缺點(diǎn)，誘導(dǎo)率也各不相同。多數(shù)試驗(yàn)[42-44]表明，外源細(xì)胞質(zhì)誘導(dǎo)小麥單倍體的機(jī)制主要受細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的雙重控制，小麥1B/1RS易位系的1R短臂上有一個(gè)控制孤雌生殖的顯性基因Ptg，該基因與細(xì)胞質(zhì)互作時(shí)產(chǎn)生單倍體。劉慶法等[45]研究表明，只要雌配子體帶有Ptg基因即有發(fā)育成單倍體的潛力；父母本基因型與單倍體頻率有密切關(guān)系，但父本是否具有Ptg基因與誘導(dǎo)頻率無關(guān)。Ptg基因在普通小麥細(xì)胞質(zhì)背景下也可以表達(dá)，但外顯率較低[46]。

2.5 遠(yuǎn)緣雜交（染色體消除法）

遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)可以利用異種的特殊優(yōu)良性狀，把有益的基因轉(zhuǎn)移到小麥中，從而克服常規(guī)育種的缺點(diǎn)，擴(kuò)大小麥的種質(zhì)資源。目前，應(yīng)用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)獲得小麥單倍體中最廣泛使用的是玉米花粉和球莖大麥。

普通小麥和玉米之間雜交，能夠發(fā)生高頻率的受精作用和胚胎形成。小麥×玉米產(chǎn)生的雜合子核型高度不穩(wěn)定，在受精后雜種合子的最初幾次分裂中，父方染色體很快排除，形成小麥單倍體的幼胚[47]。丁明亮等[48]用糯、甜糯、甜、超甜4種類型共8個(gè)玉米品種分別與6個(gè)小麥DH系雜交誘導(dǎo)產(chǎn)生小麥單倍體胚，結(jié)果表明，4種玉米類型間平均單倍體胚得胚率以甜糯型最高（33.86%）、超甜型最低（29.59%），相同玉米類型而基因型不同的玉米品種間單倍體胚得胚率差異大于玉米類型間單倍體胚得胚率的差異。劉琨等[49]探討簡(jiǎn)化去雄方法對(duì)成胚率的影響，結(jié)果表明，剪穎不去雄的去雄效率比常規(guī)去雄高5倍以上，單倍體胚成胚率相同，可作為小麥×玉米雜交中批量產(chǎn)生小麥單倍體的高效去雄方法。研究表明，Kr1基因是小麥遠(yuǎn)緣雜交不親和主效基因。蔡華等[50]比較了小麥自花授粉和小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交2個(gè)過程中Kr1基因的表達(dá)差異，結(jié)果表明，DNA甲基化修飾參與了Kr1基因在小麥×玉米遠(yuǎn)緣雜交中的表達(dá)調(diào)控。

KASHA等[51]研究認(rèn)為，球莖大麥與母本株授粉后，在形成胚胎的早期，球莖大麥的染色體在合子中逐漸消失（或被排除），僅剩余母本的染色體，幼胚經(jīng)離體培養(yǎng)得到單倍體植株。胡道芬等[52]利用德國(guó)球莖大麥作為父本、4種普通小麥為母本得出小麥基因型不同，則結(jié)實(shí)率和出苗率不同。李大瑋等[53]研究得出，小麥經(jīng)用球莖大麥花粉授粉14 d后的未成熟胚，經(jīng)2℃的冷貯處理后能夠提高再生成植株的頻率。胡超等[54]用石蠟切片法，對(duì)普通小麥異源2號(hào)、中國(guó)春與球莖大麥遠(yuǎn)緣雜交受精過程和早期胚胎發(fā)育進(jìn)行比較觀察，結(jié)果表明，異源2號(hào)和中國(guó)春與球莖大麥遠(yuǎn)緣雜交，其受精和胚胎發(fā)育存在著明顯差異，造成這一差異的原因可能是由于異源2號(hào)僅具1對(duì)Kr基因，而中國(guó)春具有Kr1、Kr2、Kr3等3對(duì)雜交親和性基因。

3 討論

小麥單倍體的育種已經(jīng)有了較廣泛的研究，每種方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，但大都存在誘導(dǎo)率低、綠苗分化率低等缺點(diǎn)，需要科研工作者深入結(jié)合小麥的基因和遺傳調(diào)控等進(jìn)行具體的分析和研究。同時(shí)，可以通過小麥不同基因型的研究，將上述多種誘導(dǎo)方法相結(jié)合，進(jìn)行抗病、抗鹽堿、抗倒伏等品種的選育。相信隨著染色體工程的逐步建立和應(yīng)用，小麥單倍體育種的工作將會(huì)得到更為廣闊的發(fā)展。