羅 莎 ，鮑康德 ，姜程曦

（1.溫州大學(xué)生命科學(xué)研究院，浙江溫州 325035；2.浙江省生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，浙江溫州 325035；3.池州市九華山黃精研究所，安徽池州 242811）

中藥的質(zhì)量鑒定和質(zhì)量評(píng)價(jià)控制方法有很多，指紋圖譜屬于其中之一[1]。通過(guò)處理之后的藥材，再經(jīng)過(guò)一定的分析技術(shù)和儀器進(jìn)行檢測(cè)，可以反映該藥材及制劑中各類不同特性的共有峰圖譜的方法，稱為中藥指紋圖譜[2]。中藥指紋圖譜與指紋識(shí)別不同，指紋識(shí)別是由基因決定的，基于先天遺傳;而中藥指紋圖譜則是基于該植物物種后天的代謝產(chǎn)物。指紋識(shí)別強(qiáng)調(diào)的是“特性”，而中藥指紋圖譜既包含“共性”又包含“特性”?！肮残浴笔悄芊从巢煌幉闹g共有的特征;“特性”是能反映該藥材與其他物質(zhì)的區(qū)別，還能反映不同地區(qū)或不同采收時(shí)間的同種藥材的差異[3]。因此中藥指紋圖譜既能用來(lái)鑒別不同種類的藥材，又能評(píng)價(jià)同種類藥材質(zhì)量的好壞。

黃精是中國(guó)傳統(tǒng)的中藥材[4]，為百合科黃精屬植物的干燥根莖，分為滇黃精（Polygonatumkingianum Collet Hemsl）、黃精（Polygonatumsibiricum Red）和多花黃精（Polygonatumcyrtonema Hua）。黃精具有養(yǎng)陰潤(rùn)肺、健脾益氣、潤(rùn)肺止咳、滋腎、內(nèi)熱消渴等功效[5]。黃精分布較廣，滇黃精在云南、四川、貴州、廣西等省都有分布；黃精在東北地區(qū)、西北地區(qū)、華北地區(qū)、華東地區(qū)等有分布[6]；多花黃精在華東地區(qū)、中南地區(qū)、四川、貴州等地有分布[7]。由于不同產(chǎn)地黃精的質(zhì)量和成分含量各異，因此，需要通過(guò)建立指紋圖譜為黃精的質(zhì)量控制研究提供理論依據(jù)。

1 指紋圖譜技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀與優(yōu)勢(shì)

指紋圖譜技術(shù)作為一種綜合的、可量化的鑒別分析手段，具有模糊性、整體性和專屬性，適用于控制中藥在生產(chǎn)過(guò)程中各環(huán)節(jié)中間體及成品的質(zhì)量，對(duì)藥材、飲片、提取液、濃縮液、浸膏粉、配方顆粒進(jìn)行一致性評(píng)價(jià)[8-9]。目前，中藥指紋圖譜技術(shù)已涉及眾多方法，包括薄層掃描（TLCS）、高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）等色譜法，以及紫外光譜法（UV）、紅外光譜法（IR）、質(zhì)譜法（MS）、核磁共振法（NMR）和X-射線衍射法等光譜法。其中色譜方法為主流方法，尤其是HPLC、TLCS 和GC 已成為公認(rèn)的3 種常規(guī)分析手段[10]。由于HPLC 具有分離效能高、選擇性高、檢測(cè)靈敏度高、分析速度快、應(yīng)用范圍廣等特點(diǎn)，中藥成分絕大多數(shù)可在高效液相色譜儀上進(jìn)行分析檢測(cè)，且已積累較豐富的應(yīng)用經(jīng)驗(yàn)。因此高效液相色譜法已成為中藥指紋圖譜技術(shù)的首選方法。隨著HPLC-MS 和GC-MS 等聯(lián)用技術(shù)的應(yīng)用，中藥指紋圖譜技術(shù)更趨完善。

中藥及其制劑均為多組分復(fù)雜體系，因此評(píng)價(jià)其質(zhì)量應(yīng)采用與之相適應(yīng)、能提供豐富鑒別信息的檢測(cè)方法，但現(xiàn)行的顯微鑒別、理化鑒別和含量測(cè)定等方法都很難解決這一問(wèn)題。建立中藥指紋圖譜將能較為全面地反映中藥及其制劑中所含化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而對(duì)藥品質(zhì)量進(jìn)行整體描述和評(píng)價(jià)[11-12]，這也正好符合中醫(yī)藥整體學(xué)說(shuō)。在此基礎(chǔ)上，如果進(jìn)一步開(kāi)展譜效學(xué)研究，可使中藥質(zhì)量與其藥效真正結(jié)合起來(lái)，有助于闡明中藥作用機(jī)理。總之，中藥指紋圖譜的研究和建立，對(duì)于中藥質(zhì)量控制、促進(jìn)中藥現(xiàn)代化具有重要意義。

2 HPLC 法在黃精指紋圖譜研究中的應(yīng)用

高效液相色譜法（HPLC）是一種較為常用的藥物組分分離分析的手段，是選用高壓力泵將流動(dòng)相泵進(jìn)到加了填充劑的色譜柱中，進(jìn)而對(duì)樣品進(jìn)行分離、測(cè)定的一種色譜方法[13-14]，具有操作簡(jiǎn)單、分析迅速、高效率分離等優(yōu)點(diǎn)[15]。當(dāng)前HPLC 已經(jīng)普遍應(yīng)用于藍(lán)眼類、黃酮類[16]、皂苷類[17]、香豆素類[18]、生物堿類[19]等化學(xué)成分的分析[20]。王海洋等[21]為了建立黃精多糖組成糖的指紋圖譜，采用柱前衍生化HPLC 法測(cè)定黃精多糖的組成，并建立其組成糖的指紋圖譜。結(jié)果顯示，黃精多糖有4 個(gè)共有峰，分別為甘露糖、葡萄糖、半乳糖和木糖。董治程等[22]以薯頸皂苷元為對(duì)照品，對(duì)黃精藥材進(jìn)行HPLC 指紋圖譜研究，為其藥材質(zhì)量控制提供了新的方法，同時(shí)為提高中國(guó)藥典中黃精質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)奠定了一定的基礎(chǔ)。程林等[23]應(yīng)用RP-HPLC 建立黃精藥材酸水解物的指紋圖譜，并且經(jīng)過(guò)參考文獻(xiàn)[24-25]及多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，黃精藥材經(jīng)過(guò)酸水解衍生化后通過(guò)高效液相分析，色譜峰較高、較多且分離度良好，所以可以認(rèn)為黃精藥材的酸水解物適合建立指紋圖譜，能夠?yàn)槠渌幉牡馁|(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。根據(jù)程林等人的研究，除了選擇薯蕷皂苷或糖類為指標(biāo)對(duì)黃精進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)外，還可選擇黃精藥材的酸水解物作為指紋圖譜建立的指標(biāo)成分。趙欣等[26]用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器聯(lián)用建立陜西楊凌黃精的指紋圖譜，結(jié)果表明，用高效液相色譜-紫外檢測(cè)器聯(lián)用建立的黃精指紋圖譜穩(wěn)定性、重復(fù)性較好。但是由于試驗(yàn)樣品及采集范圍較小，且采收時(shí)間在3、10、11 月份不等，是否為其他各產(chǎn)地的黃精質(zhì)量控制提供精準(zhǔn)參考還有待考證?？稍谮w欣等人研究的基礎(chǔ)上增加樣品基數(shù)，或根據(jù)不同采收時(shí)間建立不同的指紋圖譜，然后再進(jìn)行對(duì)照比較，為黃精的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供更加精確的參考數(shù)據(jù)。

3 UPLC 法在黃精指紋圖譜研究中的應(yīng)用

超高效液相色譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）是一種新式液相色譜技術(shù)，是由超高壓力系和小顆粒填料色譜柱結(jié)合而成，其聯(lián)合之后能夠很明顯地改進(jìn)檢測(cè)樣品的靈敏度和色譜峰的分離度，可以縮短樣品分析時(shí)間，還可以減少溶劑消耗[27]。其在原理上與HPLC 類似，但又比HPLC 多了很多優(yōu)點(diǎn)。UPLC 的色譜柱粒徑最小達(dá)到了1.7 μm，而HPLC 的色譜柱粒徑一般是5 μm，因此UPLC 使得物質(zhì)的色譜峰變得更窄，增加了峰容量，大大提高了檢測(cè)的靈敏度[27]。周寶珍等[3]采用超高效液相色譜法，建立黃精UPLC 指紋圖譜。通過(guò)UPLC 對(duì)5 個(gè)不同來(lái)源的黃精成分含量進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)不同品種的黃精成分含量不一樣，由于溫度、光照、地理環(huán)境等因素的影響，同一品種不同產(chǎn)地的黃精成分含量也有差異。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)每個(gè)產(chǎn)地的4、7、10 號(hào)共有峰的峰面積都很大，因此猜測(cè)4、7、10 號(hào)峰所對(duì)應(yīng)的成分應(yīng)該是黃精中比較重要的有效成分，若進(jìn)一步確認(rèn)這些成分，對(duì)黃精的深入研究非常重要。

目前黃精UPLC 指紋圖譜的研究報(bào)道屈指可數(shù)，這對(duì)于今后的研究來(lái)說(shuō)既是困難也是機(jī)遇。基于周寶珍等人的研究，可選擇適宜的試驗(yàn)方案繼續(xù)進(jìn)行，對(duì)黃精的研究可能會(huì)有較大的突破。另外，該研究?jī)H對(duì)黃精的UPLC指紋圖譜進(jìn)行了初步探索，并未對(duì)黃精多糖、黃酮類、皂苷等進(jìn)行分析處理，因此，可在此基礎(chǔ)上選擇合適的樣品用UPLC 對(duì)其進(jìn)行研究測(cè)定，或?qū)ζ溆行С煞址暹M(jìn)一步研究分析，為黃精的質(zhì)量控制研究提供可靠的理論依據(jù)。

4 分子標(biāo)記法在黃精指紋圖譜研究中的應(yīng)用

目前，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，SSR（Simple Sequence Repeat）分子標(biāo)記以其較高的穩(wěn)定性、重復(fù)性和多態(tài)性的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)應(yīng)用于多種藥用植物的研究，包括刺蒺藜、肉果草、菊花、桑黃及雞血藤等。但在藥用黃精上的相關(guān)研究尚屬空白，急需篩選黃精的SSR 核心引物并構(gòu)建核酸指紋圖譜[28]。

王世強(qiáng)等[29]對(duì)在全國(guó)32 個(gè)不同地區(qū)的野生藥用黃精種質(zhì)收集整理基礎(chǔ)上，通過(guò)前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，篩選出黃精多糖代謝合成通路的關(guān)鍵酶基因后，據(jù)此開(kāi)發(fā)并篩選SSR 核心引物，并構(gòu)建黃精品種（系）DNA 指紋圖譜庫(kù)，為今后黃精的品種選育及鑒定提供技術(shù)支撐。該研究成功應(yīng)用12 對(duì)基于多糖代謝合成通路的關(guān)鍵酶基因開(kāi)發(fā)的SSR 引物，一次性鑒定32 個(gè)地區(qū)（3 個(gè)種）的黃精材料，對(duì)多糖含量接近且親緣關(guān)系相近的黃精品種也能擴(kuò)增出多態(tài)性條帶并進(jìn)行區(qū)分，且每個(gè)地區(qū)的指紋圖譜具有唯一性。楊培等[30]對(duì)44 份黃精屬樣品應(yīng)用通用引物擴(kuò)增其葉綠體 rbcL、matK、psbA-trnH 及核 ITS2 和 ITS 序列，分析其種內(nèi)、種間變異，應(yīng)用BLAST 和Nearest Distance方法計(jì)算物種鑒定效率。結(jié)果顯示，DNA 條形碼候選序列psbA-trnH、matK 及rbcL 不適用于黃精屬藥用植物的鑒定，葉綠體全序列或通過(guò)葉綠體全序列篩選合適的DNA片段可能是該屬藥用植物分子鑒定的方向。

王世強(qiáng)等人[29]的研究除了構(gòu)建傳統(tǒng)的指紋圖譜代碼，還為每一個(gè)地區(qū)的黃精種質(zhì)構(gòu)建指紋圖譜二維碼，可以高效、方便地錄入大量信息，有助于黃精優(yōu)良種質(zhì)及品種的鑒定。該DNA 指紋圖譜庫(kù)的構(gòu)建，一方面可以服務(wù)于黃精種質(zhì)資源遺傳多樣性分析，另一方面，也可結(jié)合形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)，更加立體地為品種保護(hù)、優(yōu)良品種選育、優(yōu)良種質(zhì)鑒定等相關(guān)工作提供支持。但是，黃精屬植物分布廣泛，在中國(guó)境內(nèi)就有30 多種，該研究將試驗(yàn)樣本分為3個(gè)種進(jìn)行研究，可參考其試驗(yàn)方法，對(duì)黃精其他種類的藥材進(jìn)行試驗(yàn)探究。楊培等人的研究為黃精的DNA 指紋圖譜打開(kāi)了思路，既然用通用引物得不到試驗(yàn)結(jié)果，是否可大膽嘗試黃精的DNA 全序列進(jìn)行試驗(yàn)，或基于葉綠體全基因組篩選合適的DNA 片段來(lái)進(jìn)行鑒定，這都是急需解決的問(wèn)題。

5 NMR 法在黃精指紋圖譜研究中的應(yīng)用

方圓等[31]將分離所得多糖單體通過(guò)單糖組成分析、核磁共振13C-NMR 和135DEPT-NMR 譜分析，得知多糖I、多糖II 及多糖III 的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)多糖III 為部分被乙酯化的果膠，這種果膠類化合物在黃精中尚屬首次發(fā)現(xiàn)。并且發(fā)現(xiàn)了低聚糖II 中有一個(gè)對(duì)稱結(jié)構(gòu)，屬于肌醇類，但具體結(jié)構(gòu)特點(diǎn)并沒(méi)有進(jìn)一步研究。由此可見(jiàn)，核磁共振氫譜（1H-NMR）是用于鑒定有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)的重要方法之一，可以獲取各種有機(jī)化合物及無(wú)機(jī)化合物的包括質(zhì)子的化學(xué)位移、數(shù)量、偶合關(guān)系等在內(nèi)的多個(gè)結(jié)構(gòu)信息[32]。另外，通過(guò)查閱文獻(xiàn)[32-33]可知，HPLC-NMR 聯(lián)用技術(shù)是同時(shí)進(jìn)行未知混合物分離和結(jié)構(gòu)鑒定最好的手段之一。隨著HPLC-NMR 技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，HPLC-NMR 聯(lián)用系統(tǒng)將成為中藥質(zhì)量控制最有效的手段之一[33]。那是否可利用核磁共振技術(shù)對(duì)黃精的某種糖類或其他含有質(zhì)子的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，從而建立黃精的核磁共振指紋圖譜研究，以及利用HPLC-NMR 聯(lián)用技術(shù)對(duì)黃精的成分進(jìn)行進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)研究，都需進(jìn)行更加深入的研究分析。

6 其他分析方法在黃精指紋圖譜研究中的應(yīng)用

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展及應(yīng)用，為中藥的質(zhì)量控制提供了新的思路。利用現(xiàn)代分子生物學(xué)的原理和方法，將動(dòng)植物類中藥的質(zhì)量控制技術(shù)從形態(tài)、組織、細(xì)胞推進(jìn)到分子水平，解決目前中藥品種分類和鑒定及內(nèi)在質(zhì)量評(píng)價(jià)的難題。

盧燕等[34]對(duì)黃精、玉竹進(jìn)行蛋白質(zhì)、POD 同工酶和EST 同工酶電泳指紋圖譜的分析比較，結(jié)果表明，兩者的蛋白質(zhì)、POD 和EST 同工酶3 種電泳指紋圖譜均具有明顯差異，表明電泳指紋圖譜在中藥品種鑒定上的可靠性、準(zhǔn)確性。

另外，還有一些方法沒(méi)有用于建立黃精指紋圖譜，但在建立其他中藥指紋圖譜上應(yīng)用相對(duì)較多。比如，邵艷華等[35]采用高效薄層色譜法建立了由9 個(gè)特征斑點(diǎn)構(gòu)成的砂仁揮發(fā)油類成分的高效薄層色譜指紋圖譜共有模式。楊波等[36]采用傅里葉變換紅外光譜分析方法，采集黨參藥材及水提物的紅外光譜并進(jìn)行雙指標(biāo)序列分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所得到的黨參及其提取物的紅外光譜分析結(jié)果具有獨(dú)特而穩(wěn)定的特征，可以作為其質(zhì)量控制的根據(jù)。閆新豪等[37]采用高純水為溶劑回流提取待測(cè)冬蟲夏草的有效成分，對(duì)不同產(chǎn)地的冬蟲夏草進(jìn)行指紋圖譜采集。黃欣佩等[38]模擬沉香熏燒的使用過(guò)程并且應(yīng)用靜態(tài)頂空進(jìn)樣-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)構(gòu)建指紋圖譜。馮繼承等[39]建立雙黃連顆粒指紋圖譜，為該產(chǎn)品質(zhì)量控制提供有效方法。以上研究均證明指紋圖譜能夠解釋和評(píng)價(jià)中藥中包含的藥效成分信息，能夠更加全面準(zhǔn)確對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)。因此，希望盡快建立更加切實(shí)有效的黃精指紋圖譜，使其分析方法多元化，進(jìn)一步為其質(zhì)量控制體系服務(wù)。

7 結(jié)論與展望

中藥指紋圖譜技術(shù)在現(xiàn)代及未來(lái)的中藥質(zhì)量控制中都占有很重要的地位，其可分析中藥中有效成分和無(wú)效成分的種類和含量分布的信息，符合中醫(yī)、中藥整體性和模糊性的特點(diǎn)。隨著越來(lái)越多的技術(shù)不斷被應(yīng)用于中藥指紋圖譜的研究，中藥指紋圖譜必然在中藥質(zhì)量控制、中藥藥效成分研究、中藥作用機(jī)制研究等多方面發(fā)揮更加重要的作用[40]。中藥指紋圖譜可鑒別出化學(xué)成分及組成層面上的差異，因此能鑒定其質(zhì)量的好壞，對(duì)于中藥的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用。而保證中藥質(zhì)量的好壞和產(chǎn)業(yè)過(guò)程的全程控制，劉昌孝院士[41]提出了建設(shè)基于中藥質(zhì)量標(biāo)志物的中藥產(chǎn)品質(zhì)量追溯系統(tǒng)。中藥質(zhì)量標(biāo)志物是存在于中藥材和中藥產(chǎn)品（飲片、中藥煎劑、中藥提取物、中成藥制劑等）中固有的或加工制備過(guò)程中形成的、與中藥的功能屬性密切相關(guān)的化學(xué)物質(zhì)，作為反映中藥安全性和有效性的標(biāo)志性物質(zhì)進(jìn)行質(zhì)量控制[42-44]。因此，將兩者有效結(jié)合是保證中藥質(zhì)量控制的關(guān)鍵。

黃精作為藥食同源的中藥材，具有極大的開(kāi)發(fā)潛質(zhì)和市場(chǎng)價(jià)值，黃精質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化是其走向大眾、走出國(guó)門的基礎(chǔ)。姜程曦等[4]通過(guò)文獻(xiàn)分析，對(duì)黃精質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行預(yù)測(cè)，認(rèn)為黃精中的多糖和皂苷類成分與其有效性密切相關(guān)，是其可能的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，可作為質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行選擇?？筛鶕?jù)此推測(cè)，采用HPLC、TLCS、NMR、HPLC-NMR 聯(lián)用等分析手段獲取其化學(xué)組分信息并建立指紋圖譜，再將試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析整合，找到發(fā)揮作用的關(guān)鍵藥效物質(zhì)，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)其質(zhì)量標(biāo)志物，這將是今后研究的重點(diǎn)與難點(diǎn)。黃精快速發(fā)展的瓶頸在于質(zhì)量的規(guī)范統(tǒng)一，如何快速、準(zhǔn)確、便捷地評(píng)價(jià)黃精的質(zhì)量，己成為當(dāng)前亟需解決的一個(gè)難題。因此，應(yīng)牢牢把握指紋圖譜這一重要手段，為黃精的質(zhì)量控制保駕護(hù)航，助力黃精的研究與發(fā)展。