石 蕓， 毛銀雪， 金俊杰， 高 珣， 唐麗娟， 秦昆明,， 李偉東*

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 南京 210023； 2.江蘇海洋大學(xué)藥學(xué)院, 連云港 222005； 3.南京海源中藥飲片有限公司, 南京 210061)

中藥材牛蒡子為菊科草本植物牛蒡ArctiumlappaL.的干燥成熟果實(shí),味辛、苦,性寒,歸肺、胃二經(jīng),具有疏散風(fēng)熱、解毒透疹、利咽消腫等功效[1],臨床常需要炒制后使用。牛蒡子中主要含牛蒡苷、牛蒡苷元等木脂素類成分,以及綠原酸、異綠原酸A等酚酸類成分[2]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[3],牛蒡子炒制之后綠原酸、牛蒡苷、異綠原酸A含量下降,異綠原酸B、異綠原酸C、牛蒡苷元含量上升。通過液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法[4],發(fā)現(xiàn)上述6個成分也是牛蒡子炮制前后的主要差異性成分,且具有一定的藥理作用,可以作為牛蒡子炮制前后的質(zhì)量標(biāo)志物成分。

中藥質(zhì)量標(biāo)志物是代表某種中藥特征的標(biāo)志物,其來源明確,與功效用途相關(guān)聯(lián),是反映一味中藥質(zhì)量特征的化合物組合,也是近年來開展中藥質(zhì)量控制和藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究的一個重要方向[5]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是區(qū)別于一般藥理學(xué)的研究方法,它是以系統(tǒng)生物學(xué)和生物網(wǎng)絡(luò)平衡為基礎(chǔ)的藥理學(xué)分支學(xué)科,通過多途徑調(diào)節(jié)信號通路來提高藥物療效,更符合中醫(yī)藥的整體觀,可以揭示中藥“成分-靶點(diǎn)-疾病”之間復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系[6]?，F(xiàn)有研究主要針對牛蒡子炮制前后主要成分變化及藥效作用的改變,尚不清楚這些發(fā)生變化的成分具有哪些藥理活性。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法,對牛蒡子炮制前后的質(zhì)量標(biāo)志物成分進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測、網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和分析,有助于進(jìn)一步研究揭示牛蒡子炮制機(jī)理及其科學(xué)內(nèi)涵。現(xiàn)以牛蒡子炮制前后發(fā)生變化的主要質(zhì)量標(biāo)志物成分為研究對象,運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法預(yù)測作用靶標(biāo),闡明“成分-靶點(diǎn)-疾病”之間的關(guān)系,為闡明牛蒡子的炮制機(jī)理提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫與軟件

數(shù)據(jù)庫與軟件包括Open Bable GUI 2.4.1化合物格式轉(zhuǎn)換軟件、PharmMapper靶點(diǎn)篩選數(shù)據(jù)庫、UniProt數(shù)據(jù)庫中的搜索功能、蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫PDB、網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋽?shù)據(jù)分析軟件Cytoscape 3.6.0、蛋白相互作用平臺STRING、Metascape生物學(xué)信息注釋數(shù)據(jù)庫。

1.2 牛蒡子炮制前后質(zhì)量標(biāo)志物的選取

課題組前期對牛蒡子炮制前后主要成分進(jìn)行了液質(zhì)聯(lián)用分析,通過化學(xué)計量學(xué)數(shù)據(jù)分析方法,結(jié)合文獻(xiàn)數(shù)據(jù)報道[7-8],發(fā)現(xiàn)牛蒡苷、牛蒡苷元、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C(圖1)可能是炮制前后的質(zhì)量標(biāo)志物成分。以這6個成分為研究對象,使用Chemical Book平臺,獲得各成分的mol格式文件。

圖1 牛蒡子炮制前后質(zhì)量標(biāo)志物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1.3 潛在作用靶點(diǎn)的預(yù)測

PharmMapper是一款小分子化合物藥效團(tuán)匹配與潛在識別靶標(biāo)平臺,有超過7 000個受體的藥效團(tuán)模型,能夠基于分子相似性原理預(yù)測小分子化合物的作用靶點(diǎn)。本研究將各成分mol格式導(dǎo)入Open Bable GUI 2.4.1 軟件,使用其convert功能,轉(zhuǎn)換成為標(biāo)準(zhǔn)的SDF格式,將SDF格式文件導(dǎo)入PharmMapper在線靶點(diǎn)篩選平臺,預(yù)測各成分作用靶點(diǎn)。

1.4 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

STRING數(shù)據(jù)庫能夠評估和整合蛋白之間的相互作用,包括蛋白與蛋白的直接和間接關(guān)聯(lián)。將預(yù)測的靶點(diǎn)上傳至STRING數(shù)據(jù)庫并選擇“Homo Sapiens”為分析的生物體,置信度得分設(shè)置為0.700。將得到的蛋白-蛋白相互作用數(shù)據(jù)導(dǎo)入 Cytoscape 3.6.0軟件中構(gòu)建蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)。利用Analyze network工具對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,完善PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

1.5 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

Cytoscape是一款圖形化軟件,可以依據(jù)節(jié)點(diǎn)的網(wǎng)絡(luò)關(guān)系構(gòu)建活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),并對網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行編輯和分析。根據(jù)上述化學(xué)成分-作用靶點(diǎn)預(yù)測結(jié)果,應(yīng)用Cytoscape軟件構(gòu)建成化學(xué)成分-靶點(diǎn)-疾病(component-target-disease,C-T-D)網(wǎng)絡(luò)模型。運(yùn)用軟件中Network analyer功能,進(jìn)一步對網(wǎng)絡(luò)模型中的相互關(guān)系進(jìn)行分析。

1.6 生物功能與通路富集分析

以標(biāo)準(zhǔn)基因名的形式將活性成分的關(guān)鍵靶標(biāo)基因列表導(dǎo)入Metascape軟件,對作用靶點(diǎn)的GO (gene ontology)注釋和KEGG通路進(jìn)行富集分析,選取P值排名靠前的20條通路。GO富集分析Ontology勾選“ALL”,對Biological Process、Molecular Function、Cellular Component 3個部分進(jìn)行富集,預(yù)測靶點(diǎn)的功能分布。

2 結(jié)果

2.1 牛蒡子質(zhì)量標(biāo)志物潛在靶點(diǎn)的預(yù)測

利用PharmMapper對牛蒡苷、牛蒡苷元、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C的潛在靶標(biāo)進(jìn)行篩選,然后選擇Norm Fit高于0.5,共有87個靶點(diǎn),其中牛蒡苷和牛蒡苷元的潛在靶標(biāo)所占比例最大,這些靶點(diǎn)主要抗腫瘤、抗炎、心臟損傷保護(hù)、肝臟疾病治療、抗氧化等方面發(fā)揮作用。牛蒡子主要活性成分潛在作用靶標(biāo)在靶點(diǎn)總數(shù)中的占比情況如圖2所示。將6個成分潛在作用靶點(diǎn)Fit值排名靠前的20個靶點(diǎn)信息和對應(yīng)的成分列在表1中。

由表1可知,牛蒡子炮制前后質(zhì)量標(biāo)志物的作用靶點(diǎn)中,很多與抗腫瘤作用相關(guān)。如腫瘤抑制蛋白p53(Cellular tumor antigen p53)是一種由抑癌基因表達(dá)產(chǎn)生,具有抑制DNA 復(fù)制及細(xì)胞惡性增殖等作用的蛋白質(zhì)。p53基因突變率20%～50%,突變后p53蛋白則失去阻止癌細(xì)胞增殖的作用,引起細(xì)胞惡變、轉(zhuǎn)化或凋亡,并誘發(fā)異常有絲分裂,促進(jìn)惡性腫瘤發(fā)生。解聚素金屬蛋白酶17(ADAM 17)具有解聚素和金屬蛋白酶的活性,在炎癥和腫瘤組織中均具有一定的作用,與腎癌、非小細(xì)胞肺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等都有著密不可分的關(guān)系[9],這與牛蒡子抗腫瘤的作用機(jī)制相一致。β-半乳糖苷凝集素4(β-galactoside-specific lectin 4)是腫瘤細(xì)胞凝集素中的一種,具有抑制體液免疫功能的作用和增強(qiáng)細(xì)胞免疫的作用,能夠調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)之間、腫瘤細(xì)胞之間的黏附,并且參與腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[10]。此外,RecA蛋白(protein recA)在修復(fù)受損DNA的過程中起到抗氧化作用,與牛蒡子抗氧化功能相關(guān)[11]。心肌細(xì)胞特異性增強(qiáng)因子2A(Myocyte-specific enhancer factor 2A, MEF2A)是心肌細(xì)胞特異性增強(qiáng)因子2(Myocyte-specific enhancer factor 2, MEF2)基因家族的成員。人類家系遺傳分析表明突變的MEF2A是冠狀動脈粥樣硬化的致病基因之一,這一致病基因的發(fā)現(xiàn)為研究冠心病的發(fā)病機(jī)理,開發(fā)預(yù)防和治療冠心病的新藥具有重要價值,這一潛在靶標(biāo)與牛蒡子治療心血管疾病的功能吻合。

圖2 牛蒡子炮制前后質(zhì)量標(biāo)志物的作用靶點(diǎn)分布

表1 牛蒡子炮制前后質(zhì)量標(biāo)志物的主要靶點(diǎn)信息

2.2 靶點(diǎn)蛋白相互作用PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將牛蒡子炮制前后質(zhì)量標(biāo)志物的關(guān)鍵靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫,在Organism中選擇Homo Sapiens,得到蛋白相互作用關(guān)系可視化圖。為了便于后期Cytoscape作圖,對基因進(jìn)行調(diào)整過濾的分值選擇0.9,離散點(diǎn)進(jìn)行隱藏,導(dǎo)出蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，如圖3所示。由圖3可以看出,除了2個靶點(diǎn)外,其他均相互關(guān)聯(lián),與牛蒡子的多靶點(diǎn)相互作用機(jī)制相吻合。

不同藍(lán)色圓點(diǎn)代表不同的靶點(diǎn),代表著靶點(diǎn)蛋白相互之間的關(guān)系；紅色和黃色圓點(diǎn)代表蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)蛋白

在上述核心靶點(diǎn)中,PSMD4(Proteasome 26S subunit, non-ATPase)基因編碼的蛋白可以參與底物識別,從而導(dǎo)致目標(biāo)蛋白質(zhì)的選擇性降解。作用于PSMD4的化合物,可以影響肝癌細(xì)胞的體外增殖和克隆[12]。RUVBL1蛋白是DNA解螺旋的關(guān)鍵酶,抑制該基因的表達(dá),可以有效抑制細(xì)胞增殖和遷移,為臨床治療肺癌提供理論基礎(chǔ)[13]。乙酰輔酶A羧化酶(ACACA)是脂肪酸合成和氧化代謝途徑的限速酶,研究表明ACACA在多種腫瘤中顯著高表達(dá),與腫瘤進(jìn)展及患者預(yù)后密切相關(guān)[14]。由此可見,牛蒡子炮制前后質(zhì)量標(biāo)志物的核心作用靶點(diǎn)均與抗腫瘤相關(guān),說明牛蒡子炮制后具有消腫散結(jié)功效,可用于腫瘤治療具有一定的科學(xué)意義。

2.3 “成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖的構(gòu)建

選擇牛蒡子炮制前后6個質(zhì)量標(biāo)志物成分,以及這些成分對應(yīng)的靶點(diǎn)和靶點(diǎn)對應(yīng)的主要疾病,運(yùn)用Cytoscape軟件進(jìn)行作圖,得到牛蒡子炮制前后質(zhì)量標(biāo)志物成分的“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，如圖4所示。圖4中包含了疾病與靶點(diǎn)、靶點(diǎn)與成分、靶點(diǎn)與靶點(diǎn)之間的關(guān)系。

藍(lán)色線條表示靶點(diǎn)與靶點(diǎn)、疾病與靶點(diǎn)之間的藥效團(tuán)關(guān)系；紅色表示靶點(diǎn)與成分之間的關(guān)系

通過“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖可以看出一個靶點(diǎn)可能對應(yīng)多個疾病,而同一個疾病可以通過多個靶點(diǎn)治療達(dá)到效果。研究發(fā)現(xiàn)：通過牛蒡子炮制前后6個質(zhì)量標(biāo)志性成分篩選出的靶點(diǎn),與腫瘤(tumour)、肝臟疾病(liver disease)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(arthritis)、心血管疾病(cardiovascular disease)、炎癥(inflammation),糖尿病(diabetes mellitus)等疾病相關(guān),其中,抗腫瘤是牛蒡子最主要的藥理學(xué)作用,在網(wǎng)絡(luò)中處于比較核心的位置,涉及多個作用靶點(diǎn)。例如,DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I和類蘇氨酸合成酶都與抗腫瘤發(fā)生相關(guān)[15]。牛蒡子炮制前后不同的質(zhì)量標(biāo)志物可能有相同的作用靶標(biāo)。如牛蒡苷和牛蒡苷元的重復(fù)靶標(biāo)有類蘇氨酸合成酶(Probable threonine synthase),Acyl CoA結(jié)合域蛋白6(Acyl-CoA-binding domain-containing protein 6),胸腺細(xì)胞選擇性相關(guān)高遷移率族蛋白TOX(Thymocyte selection-associated high mobility group box protein TOX),c-Ets-1蛋白(Protein C-ets-1)和蛋白u(yù)nc-45同源物A(Protein unc-45 homolog A)。Acyl CoA結(jié)合域蛋白6有心肌損傷保護(hù)功能,其他4個靶標(biāo)都有抗腫瘤作用。異綠原酸B和異綠原酸C重復(fù)靶標(biāo)最多,有18個,這些靶標(biāo)的藥理學(xué)作用多為抗腫瘤,例如核孔復(fù)合體蛋白nup98-nup96(Nuclear pore complex protein Nup98-Nup96)參與調(diào)解T細(xì)胞活性,在抗腫瘤、抗炎和治療自身免疫病(如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)方面發(fā)生作用；β腎上腺素能受體激酶1(β-adrenergic receptor kinase 1)可以在胰腺癌的臨床病理診斷時作為潛在標(biāo)志物。由此可見,牛蒡子炮制前后主要質(zhì)量標(biāo)志物作用靶點(diǎn)多與抗腫瘤作用相關(guān),進(jìn)一步驗(yàn)證了前期研究發(fā)現(xiàn)牛蒡子炮制后抗腫瘤作用增強(qiáng)的研究結(jié)論。

2.4 基因功能與通路富集分析

將目標(biāo)成分預(yù)測出的87個主要靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape平臺進(jìn)行GO 注釋分析和KEGG pathway分析,設(shè)置閾值P<0.01,獲取通路富集結(jié)果，如圖5所示。通路注釋分析結(jié)果顯示,目標(biāo)成分預(yù)測出的16條主要信號通路，如表2所示。結(jié)果顯示，小分子代謝過程(small molecule catabolic process)是最顯著的生物過程,該過程涉及10個作用靶點(diǎn),可能是牛蒡子抗腫瘤作用最重要的生物過程。其他生物過程包括干擾素-γ應(yīng)答(response to interferon-gamma)、有機(jī)磷化物生物合成過程(organophosphate biosynthetic process)、磷酸核苷代謝過程(nucleoside phosphate metabolic process)、免疫系統(tǒng)細(xì)胞因子信號(cytokine signaling in immune system)和α-氨基酸代謝過程(α-amino acid metabolic process)等。

圖5 牛蒡子炮制前后質(zhì)量標(biāo)志物作用通路富集分析圖

通過對相關(guān)通路進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn),嘌呤代謝(purine metabolism)有4個作用靶點(diǎn)參與,嘌呤代謝發(fā)生紊亂后會引起痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎或腎炎,通過調(diào)控該條信號通路,可能是牛蒡子發(fā)揮抗炎作用的主要途徑。胰島素信號通路(insulin signaling pathway)是機(jī)體調(diào)控血糖的重要途徑,該條通路發(fā)生紊亂,可以導(dǎo)致血糖異常,牛蒡子通過作用于該條信號通路,對血糖進(jìn)行調(diào)節(jié),與文獻(xiàn)[16]報道牛蒡子具有調(diào)節(jié)血糖作用相一致。

3 結(jié)論

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法揭示了牛蒡子炮制前后質(zhì)量標(biāo)志物的潛在作用靶標(biāo),利用PharmMapper對牛蒡苷、牛蒡苷元、綠原酸、異綠原酸A、異綠原酸B和異綠原酸C的潛在靶標(biāo)進(jìn)行篩選,證實(shí)了牛蒡子具有抗腫瘤、抗氧化、心肌損傷保護(hù)等藥理作用。如牛蒡苷元的潛在作用靶標(biāo)谷胱甘肽還原酶對維持胞內(nèi)高比率GSH/GSSG及植物細(xì)胞的氧化還原平衡有重要意義。綠原酸的潛在作用靶標(biāo)心臟脂肪酸結(jié)合蛋白(fatty acid-binding protein, heart)是一種可溶性蛋白質(zhì),但當(dāng)機(jī)體出現(xiàn)心肌損傷時,該蛋白的含量會顯著上升,敏感性和特異性較高,這就驗(yàn)證了牛蒡子治療心血管疾病的作用。異綠原酸B潛在作用靶標(biāo)刺猬蛋白(protein hedgehog, HH)不僅與胚胎的生長發(fā)育、成人組織再生以及修復(fù)相關(guān),而且與多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有相關(guān)性,這就為牛蒡子的抗腫瘤作用提供依據(jù)。

牛蒡子通過加熱炒制后減少其寒涼成分,緩和藥性,從而突出其抗炎、抗腫瘤等方面的作用。研究揭示了牛蒡子炮制后主要質(zhì)量標(biāo)志物都具有抗腫瘤作用,且主要作用靶標(biāo)與牛蒡子的潛在藥理活性是具有相關(guān)性的,也在一定程度上驗(yàn)證了中藥的傳統(tǒng)的功效。通過對潛在靶標(biāo)以及“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)的研究可以看出,牛蒡子炮制前后質(zhì)量標(biāo)志物中不同成分的作用靶點(diǎn)各不相同,但不同的信號通路存在相互聯(lián)系。同時,研究也進(jìn)一步揭示了,牛蒡子炮制前后功效改變與這6個質(zhì)量標(biāo)志物成分的作用密切相關(guān)。在下一步的研究中,將應(yīng)用傳統(tǒng)藥理學(xué)方法,對牛蒡子炮制前后不同組合的質(zhì)量標(biāo)志物進(jìn)行藥效學(xué)驗(yàn)證,從而進(jìn)一步闡明牛蒡子炮制機(jī)理。

表2 牛蒡子炮制前后質(zhì)量標(biāo)志物的相關(guān)通路信息