朱雷 黃云 李洪浩

摘要：為明確不同濃度鈦離子對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)、孢子囊釋放游動(dòng)孢子、游動(dòng)孢子萌發(fā)和致病力等方面的影響，通過在含有不同濃度鈦離子的黑麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)致病疫霉，以及配置含不同濃度離子鈦的致病疫霉孢子懸浮液，分析離子鈦對(duì)致病疫霉生長(zhǎng)和致病力的抑制效果。結(jié)果表明，16 μg/mL鈦離子處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)和孢子囊釋放游動(dòng)孢子具有較強(qiáng)的抑制作用，平均抑制率分別為95.77%、99.04%，而32 μg/mL鈦離子處理對(duì)游動(dòng)孢子萌發(fā)和致病力具有較強(qiáng)的抑制作用，平均抑制率分別為92.72%、91.11%。離子鈦對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)、孢子囊釋放游動(dòng)孢子、游動(dòng)孢子萌發(fā)和致病力等方面抑制效果與鈦離子濃度成正比，這為馬鈴薯晚疫病環(huán)境友好型藥劑的開發(fā)提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：離子鈦;致病疫霉;生物活性;馬鈴薯晚疫病; 抑制作用

中圖分類號(hào)： S435.32? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號(hào)：1002-1302（2020）20-0117-04

由致病疫霉[Phytophthora infestans （Mont.） de Bary]引起的馬鈴薯晚疫病是對(duì)馬鈴薯生產(chǎn)極具毀滅性的病害[1]。目前，馬鈴薯晚疫病仍以化學(xué)農(nóng)藥防治為主，由此導(dǎo)致的環(huán)境污染、糧食安全、病原菌抗藥性[2]等問題尤為突出?！兜?020年農(nóng)藥使用量零增長(zhǎng)行動(dòng)方案》的提出進(jìn)一步提升了環(huán)境友好型農(nóng)藥研發(fā)的重要性。鈦是地球表面分布較為廣泛的元素之一，對(duì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)，提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)有明顯的作用[3]。鈦元素通常以氧化物、硅酸鹽結(jié)合態(tài)或鈦鐵礦存在，難以被植物吸收利用[4]。而由鈦谷（天津）科技有限公司生產(chǎn)的離子鈦（titanium ion of variable valence with light energy，簡(jiǎn)稱TIVL）中鈦元素以離子的形式存在，溶于水中，對(duì)多種細(xì)菌的生長(zhǎng)具有抑制作用[5]。探討離子鈦對(duì)致病疫霉生物活性的影響，可以為研究其抑菌機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2019年在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)部西南作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試試劑 離子鈦由中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所提供，鈦離子母液濃度為4×103 μg/mL，用無(wú)菌水梯度稀釋到320、160、80、40、20、10 μg/mL備用。

1.1.2 供試菌株 馬鈴薯致病疫霉采自四川省、貴州省、云南省、湖北省和重慶市馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)，由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所分離和保存，純化、保存54份馬鈴薯致病疫霉。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 黑麥蔗糖瓊脂（rye sucrose agar，簡(jiǎn)稱RSA）培養(yǎng)基：60 g黑麥，8 g瓊脂，20 g蔗糖，蒸餾水定容至1 L。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 致病疫霉分離培養(yǎng) 對(duì)分別采自四川省、貴州省、云南省、湖北省和重慶市馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)的馬鈴薯晚疫病病葉進(jìn)行消毒處理，取病健部1 cm2葉片置于已消毒的新鮮馬鈴薯薯片下，將放置有病樣和薯片的培養(yǎng)皿置于18 ℃黑暗條件下，5 d后挑取薯片上菌絲于黑麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基上，繼續(xù)在18 ℃黑暗條件下培養(yǎng)。

1.2.2 致病疫霉菌懸液的制備 取致病疫霉菌落邊緣1 cm2菌塊，置于經(jīng)消毒的新鮮馬鈴薯薯片下，于18 ℃黑暗條件下培養(yǎng)5 d后，挑取薯片上菌絲于無(wú)菌水中，振蕩后經(jīng)雙層紗布過濾，獲得致病疫霉孢子囊懸浮液，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整孢子囊濃度為 5×104個(gè)/mL。將致病疫霉孢子囊懸浮液置于6 ℃條件下3 h刺激孢子囊釋放游動(dòng)孢子，獲得致病疫霉游動(dòng)孢子懸浮液，并用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整游動(dòng)孢子濃度為1×105個(gè)/mL。

1.2.3 含鈦平板和含鈦菌懸液的制備 含鈦黑麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板的制備：在90 mm培養(yǎng)皿中分別加入160、80、40、20、10 μg/mL 離子鈦1.5 mL與 13.5 mL 黑麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基，充分搖勻后冷凝，使離子鈦終濃度分別為16、8、4、2、1 μg/mL，以不含離子鈦的培養(yǎng)基為對(duì)照。

含離子鈦菌懸液的制備：在60 mm培養(yǎng)皿中先加入9 mL濃度為5×104個(gè)/mL的致病疫霉孢子囊懸浮液，再分別加入1 mL濃度為160、80、40、20、10 μg/mL 的含離子鈦溶液，以不含離子鈦的無(wú)菌水為對(duì)照，分別獲得離子鈦濃度為16、8、4、2、1、0 μg/mL 的致病疫霉孢子囊懸浮液10 mL;同樣，在60 mm培養(yǎng)皿中先加入9 mL濃度為1×105個(gè)/mL的致病疫霉游動(dòng)孢子懸浮液，再分別加入1 mL濃度為320、160、80、40、20、10 μg/mL的含離子鈦溶液，以不含離子鈦的無(wú)菌水為對(duì)照，分別獲得離子鈦濃度為32、16、8、4、2、1、0 μg/mL的致病疫霉游動(dòng)孢子懸浮液10 mL。

1.2.4 離子鈦對(duì)生物學(xué)特性的影響測(cè)定 致病疫霉菌絲生長(zhǎng)：在含離子鈦16、8、4、2、1 μg/mL和不含離子鈦的黑麥蔗糖瓊脂培養(yǎng)基平板中央接種直徑為5 mm致病疫霉菌餅后，經(jīng)2 500 lx光照2 h，置于 18 ℃，黑暗條件下，每個(gè)處理重復(fù)3次，7 d后采用十字交叉法統(tǒng)計(jì)菌落直徑。平板菌落直徑用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，抑菌率=（對(duì)照組平均菌落生長(zhǎng)直徑-處理組平均菌落生長(zhǎng)直徑）/對(duì)照組平均菌落生長(zhǎng)直徑×100%，以t檢驗(yàn)分析組間差異，P<0.05 視為差異顯著，P<0.01視為差異極顯著。

致病疫霉游動(dòng)孢子釋放：將含離子鈦 16、8、4、2、1、0 μg/mL的致病疫霉孢子囊懸浮液經(jīng)2 500 lx光照2 h后，置于6 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)3 h，統(tǒng)計(jì)每20個(gè)致病疫霉孢子囊中游動(dòng)孢子的釋放數(shù)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

致病疫霉游動(dòng)孢子萌發(fā)：將含離子鈦32、16、8、4、2、1、0 μg/mL的致病疫霉游動(dòng)孢子懸浮液經(jīng) 2 500 lx 光照2 h后，置于18 ℃、黑暗條件下培養(yǎng)12 h，統(tǒng)計(jì)每20個(gè)游動(dòng)孢子的萌發(fā)數(shù)，每個(gè)處理重復(fù)3次。

致病疫霉致病力：將含離子鈦 32、16、8、4、2、1、0 μg/mL的致病疫霉游動(dòng)孢子懸浮液接種于馬鈴薯組培苗離體葉片，每張葉片接種5 μL，每個(gè)處理15張葉片，重復(fù)3次，在18 ℃、光—暗條件為16 h—8 h 條件下培養(yǎng)5 d后統(tǒng)計(jì)發(fā)病葉片數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

利用Microsoft Excel 2007進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖表制作，利用DPS v7.05進(jìn)行數(shù)據(jù)差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 離子鈦對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的抑制作用

由表1可知，各濃度鈦離子對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的平均抑制率存在顯著差異，其中16 μg/mL 離子鈦處理對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)的平均抑制率最高，為95.77%。離子鈦對(duì)不同?。ㄊ校┲虏∫呙沟陌胱畲笮?yīng)濃度（EC50）差異較大，最高為15.007 3 μg/mL，最低為2396 8 μg/mL，平均EC50為5.3 321 μg/mL（表2）。

2.2 離子鈦對(duì)致病疫霉游動(dòng)孢子釋放的影響

由圖1可知，致病疫霉孢子囊在鈦離子濃度為0、1、2、4、8、16 μg/mL時(shí)的游動(dòng)孢子平均釋放率分別為74.05%、65.95%、62.14%、51.19%、3333%、0.71%。差異性分析結(jié)果表明，1 μg/mL 鈦離子試驗(yàn)組的游動(dòng)孢子釋放率與對(duì)照組（0 μg/mL）之間存在顯著性差異（P<0.05），而鈦離子濃度為2、4、8、16 μg/mL的游動(dòng)孢子平均釋放率與對(duì)照組之間存在極顯著差異（P<0.01），其中，16 μg/mL的離子鈦對(duì)致病疫霉孢子囊游動(dòng)孢子釋放有明顯的抑制作用，平均抑制率為99.04%。

2.3 離子鈦對(duì)致病疫霉游動(dòng)孢子萌發(fā)的影響

由圖2可知，致病疫霉游動(dòng)孢子在鈦離子濃度為0、1、2、4、8、16、32 μg/mL時(shí)的平均萌發(fā)率分別為91.67%、86.67%、71.67%、51.67%、36.67%、25.00%、6.67%。差異分析結(jié)果表明，含2、4、8、16、32 μg/mL 鈦離子的游動(dòng)孢子平均萌發(fā)率與對(duì)照組（0 μg/mL）之間存在極顯著性差異（P<0.01），游動(dòng)孢子萌發(fā)率隨鈦離子濃度的增加而下降，說明離子鈦對(duì)致病疫霉游動(dòng)孢子萌發(fā)有一定的抑制作用，其中32 μg/mL離子鈦處理的平均抑制率最高，為9272%（圖2）。

2.4 離子鈦對(duì)致病疫霉致病力的影響

由圖3可知，致病疫霉游動(dòng)孢子在鈦離子濃度為0、1、2、4、8、16、32 μg/mL時(shí)侵染馬鈴薯葉片，葉片平均發(fā)病率分別為100.00%、100.00%、10000%、100.00%、97.78%、84.44%、8.89%。差異性分析結(jié)果表明，試驗(yàn)組16、32 μg/mL 離子鈦處理的葉片發(fā)病率與對(duì)照組（0 μg/mL）之間存在極顯著性差異（P<0.01），對(duì)致病疫霉致病力的平均抑制率分別為15.56%、91.11%。

3 結(jié)論與討論

我國(guó)作為全球第一大馬鈴薯生產(chǎn)國(guó)，為保證糧食安全，我國(guó)啟動(dòng)馬鈴薯主糧化戰(zhàn)略，馬鈴薯成為繼水稻、小麥、玉米之后的第四大主糧。而馬鈴薯晚疫病作為危害馬鈴薯生產(chǎn)的重要病害，每年造成數(shù)十億美元的損失，其防治措施主要是噴施化學(xué)農(nóng)藥[6-9]。糧食安全和生態(tài)保護(hù)上升為國(guó)家戰(zhàn)略，針對(duì)病蟲害的綠色防控技術(shù)應(yīng)用的呼聲愈發(fā)高漲，結(jié)合農(nóng)業(yè)供給側(cè)改革，開發(fā)和使用高效低毒低殘留藥劑勢(shì)在必行。離子鈦利用鈦具有外層電子活躍、對(duì)光敏感且發(fā)生化合價(jià)跳躍的特性，在促進(jìn)植物養(yǎng)分的吸收和運(yùn)轉(zhuǎn)、提高植物體內(nèi)多種酶的活性、增加葉片中葉綠素的含量、提高作物產(chǎn)量和品質(zhì)[10-11]的同時(shí)，還具有提高植物抗逆性[12]和抑制細(xì)菌生長(zhǎng)[5]等方面的作用，有望成為環(huán)境友好型農(nóng)藥。

致病疫霉是寄生性極強(qiáng)的兼性寄生菌，主要以游動(dòng)孢子形成的休止孢產(chǎn)生芽管，自氣孔或表皮直接侵入馬鈴薯塊莖和葉片。本研究中離子鈦對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)、孢子囊釋放游動(dòng)孢子、游動(dòng)孢子萌發(fā)和致病力具有一定的抑制作用，其中32 μg/mL的離子鈦處理對(duì)游動(dòng)孢子萌發(fā)和致病力具有較強(qiáng)的抑制作用，而16 μg/mL的離子鈦處理對(duì)致病疫霉菌絲生長(zhǎng)和孢子囊釋放游動(dòng)孢子具有較強(qiáng)的抑制作用，但對(duì)致病疫霉致病力的平均抑制率較低，僅為1556%，這與致病疫霉致病力強(qiáng)有關(guān)，即使游動(dòng)孢子濃度為1個(gè)/μL，仍能成功侵染葉片。同時(shí)，經(jīng)400倍光學(xué)顯微鏡觀察，未發(fā)現(xiàn)32 μg/mL的離子鈦處理對(duì)菌絲生長(zhǎng)端、孢子囊和游動(dòng)孢子的形態(tài)產(chǎn)生明顯影響。

目前，對(duì)離子鈦的抑菌機(jī)制尚未見報(bào)道，但研究表明與離子鈦相關(guān)的TiO2對(duì)革蘭氏陰性菌、革蘭氏陽(yáng)性菌、霉菌及單細(xì)胞藻類均具有良好的殺滅效果[13]，推測(cè)離子鈦主要是通過破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞膜的完整性、干擾代謝途徑、抑制蛋白質(zhì)和核酸的合成等方面體現(xiàn)抑菌作用[5]。鈦?zhàn)鳛橐粋€(gè)變價(jià)元素，在太陽(yáng)光的作用下，其化合價(jià)可在四價(jià)和三價(jià)間反復(fù)變化，使鈦具有較強(qiáng)的氧化還原能力，參與植物光合作用、生物固氮等重要生化過程的電子傳遞[7]。此外，離子鈦對(duì)環(huán)境和生物友好，探討離子鈦對(duì)致病疫霉生物活性的影響，為進(jìn)一步研究其抑菌機(jī)制和環(huán)境友好型藥劑的開發(fā)提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]李洪浩，淳 俊，王克秀，等. CARAH預(yù)警模型在馬鈴薯晚疫病防治藥劑減量增效中的應(yīng)用[J]. 中國(guó)植保導(dǎo)刊，2018，38（12）：33-37，13.

[2]路 粉，趙建江，劉曉蕓，等. 馬鈴薯晚疫病菌對(duì)甲霜靈的抗性監(jiān)測(cè)及替代藥劑防治效果[J]. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，51（14）：2700-2710.

[3]Pais I. The biological importance of titanium[J]. Journal of Plant Nutrition，1983，6（1）：3-131.

[4]許國(guó)棟，王桂生. 鈦金屬和鈦產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[J]. 稀有金屬，2009，33（6）：903-912.

[5]范延芬，魏春梅，李彩俠，等. 光能變價(jià)離子鈦對(duì)多種細(xì)菌的抑制作用[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報(bào)，2016，22（6）：1150-1155.

[6]Fry W E. Phytophthora infestans：new tools （and old ones） lead to new understanding and precision management[J]. Annual Review of Phytopathology，2016，54（1）：529-547.

[7]張建新，姚鳳蘭. 殺菌劑防治馬鈴薯晚疫病田間藥效試驗(yàn)[J]. 農(nóng)藥，2018，57（7）：532-535.

[8]馬永強(qiáng)，朱海霞，郭青云. 馬鈴薯晚疫病病害動(dòng)態(tài)規(guī)律及藥劑防治技術(shù)研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，45（20）：123-125.

[9]陳 瑾，胡菡青，賴瑞聯(lián)，等. 69%代森錳鋅·精苯霜靈水分散粒劑防治馬鈴薯晚疫病田間防效[J]. 農(nóng)藥，2019，58（1）：65-66，75.

[10]范秀菊. 鈦的氧化還原特性及其在植物生化過程中的作用[J]. 中國(guó)土壤與肥料，2012（5）：1-4.

[11]曾艷玲，譚曉風(fēng)，張 斌，等. 鈦離子注入對(duì)油茶種子生理生化反應(yīng)及初期生長(zhǎng)的影響[J]. 中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011，27（28）：53-57.

[12]邢小軍，張建慧，王 勇. 離子鈦對(duì)煙苗生長(zhǎng)和煙葉產(chǎn)質(zhì)量的影響[J]. 中國(guó)煙草科學(xué)，2010，31（6）：38-40.

[13]Vatansever F，de Melo W C，Avci P，et al. Antimicrobial strategies centered around reactive oxygen species：bactericidal antibiotics，photodynamic therapy，and beyond[J]. FEMS Microbiology Reviews，2013，37（6）：955-989.孫 剛，王子凡，陳 杰，等. 三嶺山國(guó)家森林公園大戟科植物資源及園林應(yīng)用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2020，48（20）：121-126.