李星坤 潘慧 李攀

摘要：CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)相對于鋅指核酸酶（ZFNs）和轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶（TALENs）而言，具有操作簡便、突變效率高等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、動物科學(xué)、植物科學(xué)等領(lǐng)域。擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT84A1、UGT84A2參與植物次生代謝及外源毒物反應(yīng)，并且為同工酶。本研究以擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶同工酶基因UGT84A1和UGT84A2為靶向基因，構(gòu)建CRISPR/Cas9雙突變體表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌浸染擬南芥，從而同時定向敲除靶向基因。根據(jù)擬南芥轉(zhuǎn)基因后代的測序結(jié)果，對獲得的42株陽性轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行突變位點(diǎn)分析，結(jié)果表明，有2株陽性植株發(fā)生雙突變，由此成功構(gòu)建了ugt84a1/ugt84a2雙突變體。試驗(yàn)結(jié)果可為加快ugt84a1/ugt84a2功能基因資源的開發(fā)利用提供有力的理論與方法支持。

關(guān)鍵詞：擬南芥;雙突變體;CRISPR/Cas9;基因敲除;位點(diǎn)分析

中圖分類號：S184?? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A? 文章編號：1002-1302（2020）20-0049-07

植物體內(nèi)小分子的糖基化修飾是一種普遍存在的生理現(xiàn)象，并且是植物細(xì)胞維持體內(nèi)代謝平衡的主要機(jī)制之一[1-2]。研究表明，糖基化修飾參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的各個方面。植物中最早被鑒定的糖基轉(zhuǎn)移酶基因是諾貝爾獎獲得者M(jìn)cClintoc于1997年發(fā)現(xiàn)的控制玉米種子黑色素沉積的Bronze1基因，后證實(shí)該基因編碼產(chǎn)生黃酮糖苷的糖基轉(zhuǎn)移酶。Fraissinet-Tachet等研究番茄的防御機(jī)制時發(fā)現(xiàn)，糖基轉(zhuǎn)移酶基因Twi1的表達(dá)能夠使植株對病原菌侵染做出快速應(yīng)答[3]。Jackson等通過對擬南芥中糖基轉(zhuǎn)移酶UGT84B1的研究，發(fā)現(xiàn)其對生長素吲哚乙酸有活性，過表達(dá)后植物蓮座葉數(shù)目增加[4]。Tognetti等鑒定了擬南芥生長素糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74E2，研究其過表達(dá)體表型發(fā)現(xiàn)UGT74E2參與調(diào)節(jié)植物的形態(tài)建成和干旱、鹽脅迫的應(yīng)答[5]。Wang等研究表明，UGT87A2參與調(diào)控?cái)M南芥開花途徑進(jìn)而影響開花時間[6]，這些研究表明，糖基化修飾參與植物生長發(fā)育的諸多方面。

而針對同一小分子的糖基化修飾，往往需要幾個不同的糖基轉(zhuǎn)移酶基因。例如，在擬南芥糖基化修飾研究中，Hou等通過離體生物化學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥細(xì)胞分裂素糖基轉(zhuǎn)移酶是由5個不同的成員組成，包括催化細(xì)胞分裂素N-糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT76C1和UGT76C2，以及催化細(xì)胞分裂素O-糖基化的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT85A1、UGT73C5和UGT73C1[7]。Poppenberger等在擬南芥中發(fā)現(xiàn)，UGT73C5可以催化油菜素內(nèi)酯形成23-O-油菜素內(nèi)酯糖苷物[8]，隨后他們又發(fā)現(xiàn)UGT73C6同樣能夠糖基化修飾油菜素內(nèi)酯[9]。此外，擬南芥中已證明的生長素IAA的糖基轉(zhuǎn)移酶包括UGT84B1和UGT74D1這2個成員[10-11]，而水楊酸糖基轉(zhuǎn)移酶包括UGT74F1和UGT74F2這2個成員[12]。在玉米糖基化修飾研究中，同樣發(fā)現(xiàn)針對同一激素存在多個糖基化修飾的同工酶。例如，玉米中細(xì)胞分裂素包括cis-ZOG1和cis-ZOGT2這2個成員[13-14]。在水稻中，細(xì)胞分裂素糖基轉(zhuǎn)移酶則包括cZOGT1、cZOGT2、cZOGT3這3個成員[15]。這些同工酶的存在也導(dǎo)致了基因的功能冗余，單單敲除某個基因往往不會使植株出現(xiàn)明顯表型。

體外試驗(yàn)表明，擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT84A1、UGT84A2都能夠作用于外源毒物2，4，5-三氯苯酚[16]，Meiner等通過體外試驗(yàn)證明擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT84A1、UGT84A2同時對羥基肉桂酸具有活性[17]，表明擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT84A1、UGT84A2與植物脫毒反應(yīng)及植物的次生代謝有關(guān)，并且為同工酶。目前對擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶ugt84a1、ugt84a2僅僅停留在單突變體植株的研究，但是隨著基因編輯技術(shù)的飛速發(fā)展以及生物信息學(xué)的廣泛應(yīng)用，對擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶ugt84a1/ugt84a2雙突變體的構(gòu)建已經(jīng)成為今后科研工作者所必須的工作。鋅指核酸酶（zinc-finger nucleases，ZFN）技術(shù)[18]、類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)核酸（transcription activitor-like effector nucleases，TALEN）技術(shù)[19]以及全新的人工核酸酶CRISPR/Cas9（clustered regulatory interspaced short plindromic repeat/Cas9）系統(tǒng)[20]是目前被廣泛應(yīng)用的三大基因編輯技術(shù)。其中CRISPR/Cas9系統(tǒng)由于制作成本低、操作簡便，只需合成目標(biāo)基因的sgRNA靶向序列就能實(shí)現(xiàn)對基因特定位點(diǎn)進(jìn)行特異性編輯，因此更廣泛地運(yùn)用于分子生物學(xué)試驗(yàn)中，這一技術(shù)短短幾年就廣泛應(yīng)用于世界各地各個領(lǐng)域的分子實(shí)驗(yàn)。

本研究是利用最新的CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，同時對擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶ugt84a1/ugt84a2進(jìn)行雙位點(diǎn)的定向敲除，使糖基轉(zhuǎn)移酶的同工基因同時突變，從而獲得ugt84a1/ugt84a2雙位點(diǎn)突變體植株，并詳細(xì)分析了其突變位點(diǎn)，為驗(yàn)證該糖基轉(zhuǎn)移酶在體內(nèi)發(fā)揮的功能奠定基礎(chǔ)，為加快ugt84a1/ugt84a2功能基因資源的開發(fā)利用提供有力的理論與方法支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生型擬南芥（Arabidopsis thaliana）及突變體株系種植于臨沂大學(xué)藥學(xué)院藥用植物實(shí)驗(yàn)室植物培養(yǎng)室，溫度（22±2） ℃，光照度100 μmol/（m2·s）。CPISPR/Cas9載體，購于百格基因科技（江蘇）有限公司，大腸桿菌E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞、農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞、T4 DNA Ligase試劑盒、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、Taq酶、DNA Maker、PCR耗材等材料與試劑為筆者所在實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有保存。gRNA引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，基因序列由鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測定，試驗(yàn)開展時間為2018年9月至2020年1月。

1.2 gRNA引物設(shè)計(jì)

從擬南芥信息資源網(wǎng)站（The Arabidopsis Information Resource，TAIR）查找到已公布的擬南芥ugt84a1和ugt84a2的基因組序列號分別為AT4G15480和AT3G21560。利用sgRNA設(shè)計(jì)軟件分別設(shè)計(jì)擬南芥ugt84a1和ugt84a2的sgRNA靶點(diǎn)序列：2個都按照正向引物5′-TGATT+正向靶點(diǎn)序列進(jìn)行序列的合成，按照反向引物5′-AAAC+反向靶點(diǎn)序列進(jìn)行序列的合成。

1.3 CPRSPR/Cas9載體的構(gòu)建

首先根據(jù)ugt84a1、ugt84a2靶點(diǎn)序列制備Oligo二聚體（表1）。加入Anneal Buffer 18 μL、SG6977-UP（10 μmol/L）1 μL、SG6977-LW（10 μmol/L） 1 μL，先在95 ℃條件下變性3 min，然后以約 0.2 ℃/s 緩慢降至20 ℃進(jìn)行退火。另一個Oligo二聚體同法可得。

將Oligo二聚體與CRISPR/Cas載體連接。加入Vector-016B（線性化載體）2 μL、Enzyme Mix 1 μL、Oligo二聚體1 μL、ddH2O 6 μL，在25 ℃條件下反應(yīng)1 h。取5 μL上述反應(yīng)液，加入20 μL DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過42 ℃熱激法轉(zhuǎn)入到DH5α。轉(zhuǎn)化子通過引物PUV4-R和PUV3-F（表1）進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，驗(yàn)證正確的陽性轉(zhuǎn)化子再進(jìn)行搖菌，提取質(zhì)粒后送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測序。將驗(yàn)證100%正確的陽性轉(zhuǎn)化子放于 -80 ℃ 保存。取10 μL驗(yàn)證正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含有50 μg/mL利福平和50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，28 ℃倒置暗培養(yǎng)2 d后備用。

1.4 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥

挑取含有目的基因質(zhì)粒的單克隆陽性農(nóng)桿菌菌體置于離心管中培養(yǎng)。取培養(yǎng)后的菌液10 μL接種于10 mL含有利福平和卡那霉素的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)2～4 d，直到其D600 nm值達(dá)到0.8左右。取該菌液1 mL放于離心管中，離心后保留沉淀，用5%蔗糖溶液和Sitwet-77（萬分之二加入）的混合液重新懸浮。隨后用懸浮液浸染未開放的花序，浸染后的擬南芥用黑色塑料袋覆蓋，暗培養(yǎng)24 h后移入正常光照下繼續(xù)培養(yǎng)。為了增加浸染的成功率，每隔20 min浸染1次，共浸染3次，并且1周后再次浸染。收集擬南芥成熟種子，先用70%乙醇消毒2 min，迅速用01%的HgCl2清洗種子90 s，最后用無菌水對種子潤洗3次。處理后的種子用瓊脂水溶液均勻鋪在含有潮霉素（HYR）的LB平板上，4 ℃暗處理 2～3 d 后移入正常光照下繼續(xù)培養(yǎng)，將長成綠苗的擬南芥移入澆過營養(yǎng)液的土壤中繼續(xù)生長，用于篩選陽性苗。

1.5 擬南芥雙突變體的檢測

將得到的42株T1代植株進(jìn)行編碼，分別記為T1-1、T1-2、T1-3、…、T1-40、T1-41、T1-42。剪取擬南芥T1代幼苗葉片2～3張，提取其基因組DNA，利用引物84a1-F和84a1-R（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增目的基因，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行初步檢測，初步檢測正確后送公司進(jìn)行測序驗(yàn)證。以野生型擬南芥序列作為對照，分析該基因片段靶序列是否突變。

將驗(yàn)證好的84a1發(fā)生突變的擬南芥繼續(xù)用潮霉素篩選獲得T2代，提取陽性綠苗基因組DNA，首先利用引物84a1-F和84a1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，與T1代的檢測結(jié)果進(jìn)行比對，檢測其突變是否已經(jīng)純合。將這些84a1突變體純合體再利用引物84a2-F和84a2-R（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行初步檢測后送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測序驗(yàn)證，以野生型擬南芥作為對照，通過序列比對確定其突變基因類型。

將突變的84a2但未純合的擬南芥T2代繼續(xù)用潮霉素篩選獲得T3代，同上提取其基因組DNA，利用84a1-F和84a1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得ugt84a1目標(biāo)序列，利用84a2-F和84a2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得ugt84a2目標(biāo)序列，將2種擴(kuò)增產(chǎn)物送公司進(jìn)行測序，ugt84a1、ugt84a2同時發(fā)生突變的株系則為ugt84a1/ugt84a2雙突變體。

2 結(jié)果與分析

2.1 sgRNA靶點(diǎn)序列的選擇

從TAIR數(shù)據(jù)庫查找到已公布的擬南芥ugt84a1和ugt84a2的基因組序列（分別為AT4G15480和AT3G21560）。利用sgRNA設(shè)計(jì)軟件搜索到可能的擬南芥sgRNA序列，通過進(jìn)一步篩選最終選定2條sgRNA序列，分別為GCTCGTTACCTTCGTTACAA和GACGAAGAAGTGGATTAACG。利用該靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)引物，其中擬南芥ugt84a1靶點(diǎn)序列的引物為Oligo（5′→3′） UP（TGATTGCTCGTTACCTTCGTTACAA）和Oligo LW（AAACTTGTAACGAAGGTAACGAGCA）;擬南芥ugt84a2靶點(diǎn)序列的引物為Oligo UP（TGATTGACGAAGAAGTGGATTAACG）和Oligo LW（AAACCGTTAATCCACTTCTTCGTCA）。

2.2 載體的構(gòu)建及其驗(yàn)證

先將sgRNA靶點(diǎn)序列的引物Oligo二聚體在 95 ℃ 條件下變性3 min，然后以約0.2 ℃/s緩慢降至20 ℃進(jìn)行退火配對連接。然后與線性化的CRISPR/Cas載體在25 ℃反應(yīng)1 h進(jìn)行連接。反應(yīng)結(jié)束后首先進(jìn)行PCR驗(yàn)證，ugt84a1陽性轉(zhuǎn)化子的PCR條帶大小為510 bp（圖1），ugt84a2陽性轉(zhuǎn)化子的PCR條帶大小為470 bp（圖2）。驗(yàn)證條帶大小正確的轉(zhuǎn)化子，提取其質(zhì)粒進(jìn)一步送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司測序驗(yàn)證，選取測序序列100%正確的重組載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌并浸染擬南芥。

2.3 擬南芥雙突變體的篩選與檢測

2.3.1 ugt84a1突變體植株嵌合體序列分析 攜帶有重組雙突變體載體的農(nóng)桿菌浸染擬南芥獲得T0代植株，通過潮霉素篩選擬南芥T0代得到20株T1

代陽性苗，分別編號為T1-1、T1-2、T1-3、…、T1-18、T1-19、T1-20。提取T1代20株幼苗基因組DNA，并利用引物84a1-F和84a1-R（表1）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測序分析。將測序序列與野生型擬南芥植株序列進(jìn)行比對，在20株陽性轉(zhuǎn)基因植株中有12株缺失A堿基，引起基因的移碼突變;3株缺失A、C 2個堿基，引起基因的移碼突變;5株未發(fā)生突變。其中，缺失A堿基的12株擬南芥突變基因類型相同，缺失A、C 2個堿基的3株擬南芥突變基因類型相同（圖3），從而得到ugt84a1突變體植株（表2），從圖3可以看出，測序序列中有嵌合峰，表明T1代突變植株為嵌合體。

2.3.2 ugt84a1突變體純合體篩選 選取T1代已經(jīng)驗(yàn)證好的ugt84a1突變體T1-2、T1-16繼續(xù)經(jīng)潮霉素篩選得到T2代植株，每個號選取8株，分別編號為T2-2-1、T2-2-2、…、T2-2-7、T2-2-8;T2-16-1、T2-16-2、…、T2-16-7、T2-16-8。對這些T2代植株進(jìn)行基因組DNA提取，利用引物84a1-F和84a1-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限

公司進(jìn)行測序分析。觀察并分析測序結(jié)果，與T1代84a1突變體植株的突變位點(diǎn)進(jìn)行比對，其中T2-2-1、T2-2-5、T2-2-6的T2代與T1代突變位點(diǎn)一致，缺少A堿基;T2-16-4的T2代與T1代突變位點(diǎn)一致，缺少A、C堿基（表3），并且為純合突變體（圖4）。經(jīng)過T1代與T2代的驗(yàn)證，得到了ugt84a1純合體植株。缺C、A堿基突變類型? CTCGTTAC*TTCGTTACA*CGG???????? T2-16-4

2.3.3 ugt84a1/ugt84a2雙突變體篩選 將檢測的ugt84a1純合體T2-2-1、T2-2-5、T2-2-6和T2-16-4進(jìn)行ugt84a2基因突變檢測（圖5）。首先進(jìn)行基因組DNA提取，利用引物84a2-F和84a2-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物送鉑尚生物技術(shù)（上海）有限公司進(jìn)行測序分析。分析測序結(jié)果，與野生型植株的84a2相應(yīng)基因位點(diǎn)進(jìn)行比對，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，T2-2-1、T2-2-5、T2-2-6缺失A堿基，T2-16-4的A堿基突變?yōu)門堿基，插入1個T堿基（表4），由此得到了2種不同類型的ugt84a1/ugt84a2雙突變體，分別為ugt84a1/ugt84a2 T2-2-1（ugt84a1缺失A，ugt84a2缺失T）、ugt84a1/ugt84a2 T2-16-4（ugt84a1缺失C、A，ugt84a2缺失T、A突變?yōu)镃、G突變?yōu)門）。

3 討論與結(jié)論

CRISPR/Cas9 是一種能夠?qū)蚪M的特定位點(diǎn)進(jìn)行精確編輯的技術(shù)，其原理是核酸內(nèi)切酶Cas9蛋白通過導(dǎo)向性RNA識別特定基因組位點(diǎn)并對雙鏈DNA進(jìn)行切割，細(xì)胞隨之利用非同源末端連接或者同源重組方式對切割位點(diǎn)進(jìn)行修復(fù)，實(shí)現(xiàn)DNA水平基因敲除或精確編輯[22-24]。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)比起ZFNs和TALENs基因編輯技術(shù)而言，有著無法比擬的優(yōu)點(diǎn)[25]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)操作較為簡便，只需設(shè)計(jì)sgRNA靶向序列便可對基因進(jìn)行編輯[21]，由于其獨(dú)特的優(yōu)勢，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)已經(jīng)在醫(yī)學(xué)、動物科學(xué)、植物科學(xué)等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[ 26-28]。

植物體內(nèi)含有大量的小分子化合物，這些小分子物質(zhì)的糖基化在植物體內(nèi)普遍存在[29-30]。糖基化修飾是植物小分子代謝修飾的一種重要形式，通常會引起小分子化合物的失活，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)小分子穩(wěn)態(tài)，影響植物生長發(fā)育的諸多方面[31-32]。研究表明，擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT84A1、UGT84A2都能夠糖基化外源毒性物質(zhì)2，4，5-三氯苯酚[16]以及植物內(nèi)源物質(zhì)對羥基肉桂酸[17]，表明UGT84A1和UGT84A2為同工基因。目前這2個基因的功能研究都停留在單基因突變體研究，目前的研究結(jié)果對于解析同源基因的功能和互相作用還缺少有力的證據(jù)。雖然擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶UGT84A1和UGT84A2基因早已被發(fā)現(xiàn)并克隆，但由于體內(nèi)代謝平衡調(diào)控是一個復(fù)雜的過程，其中涉及的相關(guān)基因的有序時空表達(dá)與基因之間的相互作用還沒有具體研究透徹?；谝陨显颍狙芯坷肅RISPR/Cas9系統(tǒng)成功獲得了擬南芥ugt84a1/ugt84a2雙突變體，此研究為UGT84A1和UGT84A2基因功能研究提供了試驗(yàn)材料，為其他物種中UGT84A1和UGT84A2同源基因的功能研究提供了借鑒。

快速高效篩選雙突變體材料對于科學(xué)研究是必要的。本研究中，將UGT84A1與UGT84A2靶序列同時構(gòu)建到CRISPR/Cas9雙突變體載體，從而同時敲除同源基因ugt84a1/ugt84a2，通過分析突變體突變位點(diǎn)時發(fā)現(xiàn)，針對單一基因突變體往往會篩選到2～3種不同位點(diǎn)突變，其中多數(shù)突變的堿基是一致的，說明構(gòu)建的CRISPR/Cas9載體系統(tǒng)工作穩(wěn)定性很高。在篩選雙突變體過程中，由于2個基因同時突變的概率很低，所以首先篩選ugt84a1單突變體，找到其突變體純合體后，再篩選另一個基因ugt84a2是否同時突變，這樣不僅工作效率高，需要測序的樣品數(shù)也大大減少，從而提高了突變體篩選效率。綜上，本研究的開展對于加快ugt84a1/ugt84a2功能基因資源的開發(fā)利用提供有力的理論與方法支持。

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