艾飛 劉霞 黎暉 褚春薇 陳向云 郭俊峰 楊毅 梅麗艷 苗紀(jì)飛 溫泉 葉森

摘 要 目的：探討參附注射液（SFI）對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中高遷移率族蛋白B1（HMGB1）核轉(zhuǎn)位的干預(yù)作用。方法：以經(jīng)LPS誘導(dǎo)的小鼠單核巨嗜細(xì)胞RAW264.7為對(duì)象，以組蛋白去乙酰化酶抑制劑RGFP966為陽性對(duì)照，在CCK-8法篩選給藥劑量的基礎(chǔ)上，采用免疫熒光法觀察低、中、高劑量（3、6、12 μL/mL）SFI對(duì)細(xì)胞中HMGB1核轉(zhuǎn)位的影響，采用實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測(cè)細(xì)胞中HMGB1 mRNA的表達(dá)情況;采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中HMGB1、Toll樣受體4（TLR4）的表達(dá)情況，并比較細(xì)胞胞核、胞漿中HMGB1的表達(dá)情況;采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法檢測(cè)細(xì)胞上清液中HMGB1、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）水平。結(jié)果：在空白對(duì)照組中，HMGB1主要定位于細(xì)胞核;經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，HMGB1由細(xì)胞核向胞漿遷移。與空白對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞中HMGB1 mRNA及其蛋白、TLR4的蛋白表達(dá)量以及上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高（P<0.01）;細(xì)胞胞核中HMGB1的蛋白表達(dá)量顯著降低，而胞漿中HMGB1的蛋白表達(dá)量顯著升高（P<0.01）。經(jīng)SFI作用后，各給藥組細(xì)胞HMGB1的核移位及分泌均受到不同程度的抑制;與LPS組比較，各給藥組細(xì)胞中HMGB1 mRNA及其蛋白的表達(dá)量，陽性對(duì)照組和SFI中、高劑量組細(xì)胞中TLR4的蛋白表達(dá)量以及各給藥組細(xì)胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α水平均顯著降低（P<0.01）;陽性對(duì)照組和SFI中、高劑量組細(xì)胞胞核中HMGB1的蛋白表達(dá)量均顯著升高，而各給藥組細(xì)胞胞漿中HMGB1的蛋白表達(dá)量均顯著降低（P<0.01）。結(jié)論：SFI可能通過抑制RAW264.7細(xì)胞中HMGB1的核移位及分泌出胞，避免炎癥通路的激活和炎癥因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮減輕LPS致炎癥反應(yīng)的作用。

關(guān)鍵詞 參附注射液;RAW264.7細(xì)胞;高遷移率族蛋白B1;炎癥因子;核轉(zhuǎn)位

ABSTRACT?OBJECTIVE： To investigate the intervention effect of Shenfu injection （SFI） on the nuclear translocation of high mobility group box 1（HMGB1） in lipopolysaccharide （LPS）-induced RAW264.7 cells. METHODS： Using LPS-induced RAW264.7 cells as objects， the histone deacetylase inhibitor RGFP966 as positive control， CCK-8 assay was used to screen drug dosage， and the effects of low， medium and high doses （3， 6， 12 μL/mL） of SFI on HMGB1 nuclear translocation in RAW264.7 cells were observed by immunofluorescence method; mRNA expression of HMGB1 in RAW264.7 cells were detected by real time fluorescent PCR. Western blotting assay was used to determine protein expression of HMGB1 and Toll-like receptor 4（TLR4）; the expression of HMGB1 were compared between nucleus and cytoplasm. The levels of HMGB1， IL-1β and TNF-α in supernatant of cells were detected by ELISA. RESULTS： In blank control group， HMGB1 was mainly located in the nucleus; after LPS induction， HMGB1 migrated from nucleus to cytoplasm. Compared with blank control group， mRNA and protein expression of HMGB1， protein expression of TLR4 in RAW264.7 cells as well as the levels of HMGB1， IL-1β and TNF-α in supernatant of cells were increased significantly in LPS group （P<0.01）. The protein expression of HMGB1 was decreased significantly in nucleus while was increased significantly in cytoplasm （P<0.01）. After SFI treatment， the nuclear translocation and secretion of HMGB1 were inhibited in different degrees; compared with LPS group， mRNA and protein expression of HMGB1 in administration groups， protein expression of TLR4 in RAW264.7 cells of positive control group， SFI medium- and high-dose groups as well as the levels of HMGB1， IL-1β and TNF-α in supernatant of cells in administration groups were decreased significantly （P<0.01）. In positive control group， SFI medium- and high-dose groups， the protein expressions of HMGB1 in nucleus were increased significantly， while protein expressions of HMGB1 in cytoplasm were decreased significantly （P<0.01）. CONCLUSIONS： SFI may inhibit the nuclear translocation and secretion of HMGB1 in RAW264.7 cells， thus avoiding the activation of inflammatory pathways and the production of inflammatory factors， so as to reduce the inflammatory response induced by LPS.

KEYWORDS ? Shenfu injection; RAW264.7 cells; HMGB1; Inflammatory factors; Nuclear translocation

感染性休克的病程發(fā)展與免疫細(xì)胞過度激活有關(guān)，大量炎癥因子的產(chǎn)生使得炎癥反應(yīng)從可控進(jìn)展為不可控，最終導(dǎo)致患者多器官功能衰竭，甚至死亡[1]。高遷移率族蛋白B1（High mobility group box 1，HMGB1）為感染性休克晚期的致死性炎癥因子，在細(xì)菌脂多糖（LPS）等致炎因子的作用下，定位于細(xì)胞核內(nèi)的HMGB1將向胞漿遷移，最后分泌出胞，在胞外的HMGB1通過結(jié)合細(xì)胞膜上的晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）和Toll樣受體4（TLR4）來啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，共同激活核因子κB（NF-κB）及下游炎癥因子級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這可能是感染性休克高死亡率的原因之一[2-4]。

中醫(yī)認(rèn)為，感染性休克屬“厥脫”范疇，運(yùn)用源自《傷寒論》四逆加人參湯的參附注射液（SFI）治療具有較好的效果[5-6]。本課題組前期通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，SFI可抑制內(nèi)毒素休克模型大鼠肺組織中HMGB1的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和血漿中HMGB1的分泌水平，但其機(jī)制還有待深入研究[7-8]。在此基礎(chǔ)上，本研究擬考察SFI對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中HMGB1蛋白核轉(zhuǎn)位的影響及可能機(jī)制，以期為SFI的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Form 321型CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;EnSpire型多功能酶標(biāo)儀（美國PerkinElmer公司）;DHP-9012型恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）;PowerPac300型電泳儀、170-3930型轉(zhuǎn)膜儀、CFX96型熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）;GN98-ⅢD超聲波細(xì)胞裂解儀（上海谷寧儀器有限公司）;Tanon 5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析儀（上海天能科技有限公司）;Ama240型高壓滅菌鍋（英國Astell公司）;LSM800型激光共聚焦掃描顯微鏡（德國Leica公司）;SW-CJ-2D型超凈工作臺(tái)（蘇州凈化設(shè)備有限公司）;CKX41型普通光學(xué)倒置顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 藥品與試劑

參附注射液（雅安三九藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20170324，規(guī)格：10 mL）;RGFP966原料藥[美國Selleck公司，批號(hào)：S7229，純度：≥98%，用二甲基亞砜（DMSO）溶解至10 mmol/L，于4 ℃保存，備用];LPS（美國Sigma公司，批號(hào)：20170920，純度：≥99%;來源于大腸桿菌055：B5，用水配制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL的工作溶液，于4 ℃保存，備用）;DMEM高糖培養(yǎng)基（美國HyClone公司，批號(hào)：AD16191267）;0.25%胰酶（批號(hào)：0035017）、胎牛血清（FBS，批號(hào)：1741844）均購自以色列Biological Industries公司;青霉素/鏈霉素雙抗（北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：AD20170804）;BCA蛋白定量試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號(hào)：SL260210）;核/漿蛋白分離試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，批號(hào)：20170605）;兔HMGB1單克隆抗體（美國Epitomics公司，批號(hào)：YH081809）;兔TLR4單克隆抗體（批號(hào)：ab13556）、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)：GR313248-1）、CCK-8試劑盒（批號(hào)：ab228554）均購自英國Abcam公司;兔β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）單克隆抗體（批號(hào)：AA128-1）、兔H3單克隆抗體（批號(hào)：AF0009）、Cy3標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（批號(hào)：A0516）、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染料（批號(hào)：C1002）、Trizol試劑（批號(hào)：101006）、苯甲磺酰氟（PMSF）蛋白酶抑制劑（批號(hào)：410051）、磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 7.4，批號(hào)：ST476）、Triton X-100試劑（批號(hào)：SY1020）、吐溫20（批號(hào)：ST825）、山羊血清（批號(hào)：C0265）、RIPA裂解液（批號(hào)：P0013B）均購自碧云天生物技術(shù)研究所;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)：M20100）、定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）試劑盒（批號(hào)：M30510）均購自北京全式金生物科技有限公司;ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒（美國Millipore公司，批號(hào)：1801501）;小鼠HMGB1（批號(hào)：M173318-215a）、腫瘤壞死因子α（TNF-α，批號(hào)：M170318- 102a）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β，批號(hào)：M190325-318a）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）檢測(cè)試劑盒均購自欣博盛生物科技有限公司;PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司設(shè)計(jì)、合成（見表1）;其余試劑均為實(shí)驗(yàn)室常用規(guī)格，水為超純滅菌水。

1.3 細(xì)胞

小鼠單核巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將RAW264.7細(xì)胞置于含10%FBS、青霉素/鏈霉素雙抗（青霉素、鏈霉素濃度分別為100 U/mL、100 μg/mL）的DMEM高糖培養(yǎng)基中（以下簡稱“培養(yǎng)基”），于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（培養(yǎng)條件下同）。使用倒置顯微鏡觀察示細(xì)胞呈圓形且折光性好，部分細(xì)胞突起。取對(duì)數(shù)生長期（融合度達(dá)70%～80%）的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 給藥劑量篩選

取RAW264.7細(xì)胞適量，經(jīng)胰酶消化、計(jì)數(shù)后，按5×103個(gè)/孔接種于96孔板中，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期。將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組和藥物組（SFI最終劑量分別為1、2、4、8、12、16、20 μL/mL，劑量設(shè)置參考前期研究方法[9]和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果）。對(duì)照組加入培養(yǎng)基100 μL，各藥物組加入含相應(yīng)量SFI的培養(yǎng)基100 μL，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔;同時(shí)，設(shè)置5個(gè)不含細(xì)胞、只含培養(yǎng)基100 μL的空白孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，加入CCK-8溶液10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，使用酶標(biāo)儀于450 nm波長處測(cè)量各孔光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率（%）=（檢測(cè)孔OD值-空白孔OD值）/（對(duì)照組孔OD值-空白孔OD值）×100%。選擇不影響細(xì)胞存活率的最高劑量作為后續(xù)試驗(yàn)的高劑量，并以其1/2、1/4分別作為中、低劑量。

2.3 SFI對(duì)LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥反應(yīng)的干預(yù)作用考察

2.3.1 細(xì)胞中HMGB1定位觀察 采用免疫熒光法檢測(cè)。參照文獻(xiàn)方法[10]制作細(xì)胞炎癥模型，將滅菌蓋玻片置于24孔板（每孔含培養(yǎng)基0.5 mL）中，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按2×104個(gè)/孔滴加至各孔蓋玻片上，培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照組、LPS組、陽性對(duì)照組（RGFP966，最終濃度為10 μmol/L[11]）和SFI低、中、高劑量組（劑量設(shè)置參考“2.2”項(xiàng)下結(jié)果），空白對(duì)照組加入含雙抗、不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基（以下簡稱“完全培養(yǎng)基”）0.5 mL，LPS組加入含0.2 μg/mL LPS的完全培養(yǎng)基0.5 mL，各給藥組先加入等量LPS培養(yǎng)30 min后再加入含相應(yīng)藥物的完全培養(yǎng)基0.5 mL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用4 ℃預(yù)冷的PBS清洗，置于4%多聚甲醛溶液中室溫固定20 min;用PBS清洗3次，加入0.5% TritonX-100試劑適量，室溫反應(yīng)20 min;用PBS清洗5 min×3次，以10%山羊血清封閉1 h;加入HMGB1一抗（稀釋度為1 ∶ 200），于4 ℃孵育過夜;用磷酸鹽吐溫緩沖溶液（PBST）清洗5 min×3次，加入Cy3標(biāo)記的二抗（稀釋度為1 ∶ 500），室溫避光孵育1 h;用PBST清洗5 min×4次（此步驟及后續(xù)所有步驟均需避光操作），以DPAI染料（1 mL反應(yīng)液中加入DPAI染液1 μL）染核5 min;用PBST清洗5 min×4次，用含熒光淬滅劑的甘油封片后，置于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察HMGB1的染色情況及其在細(xì)胞內(nèi)的定位并拍照。

2.3.2 細(xì)胞中HMGB1 mRNA表達(dá)情況檢測(cè) 采用實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按1×105個(gè)/孔接種于6孔板中，按“2.3.1”項(xiàng)下方法分組、給藥（每孔總體積為2 mL）。細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，用Trizol試劑提取細(xì)胞總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（共20 ? ? ?μL）：cDNA模板1 μL、dNTP 0.2 μL、上/下游引物各0.15 μL、Taq酶0.2 μL、PCR Buffer 2 μL、ddH2O 16.3 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 min;95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法[12]計(jì)算HMGB1 mRNA的表達(dá)量。

2.3.3 細(xì)胞中HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)情況檢測(cè) 采用Western blotting法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按“2.3.2”項(xiàng)下方法分組、給藥，培養(yǎng)24 h后，各組取部分細(xì)胞用4 ℃預(yù)冷的PBS清洗2次，加入RIPA裂解液（含PMSF蛋白酶抑制劑）200 μL，于冰上裂解30 min，以12 000 r/min離心15 min，取上清液，即得總蛋白。按核/漿蛋白試劑盒說明書方法提取蛋白：各組取另一部分細(xì)胞加預(yù)冷的Buffer A 200 μL，渦旋劇烈振搖15 s，冰上放置15 min;加預(yù)冷的Buffer B 11 μL，渦旋劇烈振搖5 s，冰上放置1 min;于4 ℃下以12 500 r/min離心5 min后，收集上清液，即得漿蛋白。在離心沉淀物（即細(xì)胞核）中加入預(yù)冷的Buffer C 100 μL，超聲（功率：150 W，頻率：25 kHz）裂解2 min，冰上放置40 min，其間每隔10 min渦旋15 s;于4 ℃下以12 500 r/min離心10 min，收集上清液，即得核蛋白。采用BCA法檢測(cè)總蛋白濃度后，沸水煮5 min使蛋白變性。取變性蛋白適量，經(jīng)SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以脫脂牛奶室溫封閉2 h，再分別加入HMGB1、TLR4、β-actin、H3一抗（稀釋度均為1 ∶ 1 000），于4 ℃孵育過夜;用三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（TBST）溶液清洗3次，加入HRP標(biāo)記的二抗（稀釋度為1 ∶ 5 000），室溫孵育1 h;用TBST溶液清洗3次，以ECL法顯色后，于全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析儀上成像。采用Image J 1.8.0軟件分析圖像，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參（總蛋白、漿蛋白內(nèi)參：β-actin;核蛋白內(nèi)參：H3）條帶灰度值的比值作為目標(biāo)蛋白的表達(dá)量，分別記為細(xì)胞中HMGB1、TLR4蛋白以及細(xì)胞胞核、胞漿中HMGB1蛋白的表達(dá)量。

2.3.4 細(xì)胞上清液中炎癥因子水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞，按“2.3.2”項(xiàng)下方法分組、給藥，培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞上清液，以酶標(biāo)儀檢測(cè)各細(xì)胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α的水平。嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書操作，孵育過程在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

上述各項(xiàng)試驗(yàn)均平行操作3次。采用SPSS 23.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料均以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 給藥劑量篩選結(jié)果

與對(duì)照組比較，SFI 16 μL/mL組細(xì)胞的存活率顯著降低（P<0.05）;而其余各劑量組細(xì)胞存活率與對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見表2?；诖?，本研究選擇12 μL/mL作為SFI高劑量，6、3 μL/mL分別作為中、低劑量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.2 SFI對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中HMGB1核轉(zhuǎn)位的影響

SFI對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中HMGB1核轉(zhuǎn)位影響的顯微圖見圖1（圖中，“Cy3”“DAPI”分別標(biāo)記胞內(nèi)、胞核HMGB1蛋白，“Merge”為前兩者重疊）。由圖1可見，空白對(duì)照組中，Cy3標(biāo)記的HMGB1主要定位于胞核，與DAPI標(biāo)記的胞核重疊;LPS組中，可見HMGB1同時(shí)定位于胞核和胞漿中（圖中白色箭頭所示為遷移至胞漿的HMGB1，下同），提示LPS可促進(jìn)HMGB1從胞核向胞漿遷移;各給藥組中，HMGB1主要定位于胞核中，其遷移較LPS組減少，提示SFI可抑制LPS誘導(dǎo)的HMGB1核轉(zhuǎn)位。

3.3 SFI對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中HMGB1 mRNA表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞中HMGB1 mRNA的表達(dá)量顯著升高（P<0.01）;與LPS組比較，各給藥組細(xì)胞中HMGB1 mRNA的表達(dá)量均顯著降低（P<0.01），詳見表3。

3.4 SFI對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞中HMGB1、TLR4蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞中HMGB1、TLR4蛋白的表達(dá)量均顯著升高（P<0.01）;與LPS組比較，各給藥組細(xì)胞中HMGB1蛋白的表達(dá)量以及陽性對(duì)照組和SFI中、高劑量組細(xì)胞中TLR4蛋白的表達(dá)量均顯著降低（P<0.01），詳見圖2、表4。

3.5 SFI對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞胞核、胞漿中HMGB1蛋白表達(dá)的影響

與空白對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞胞核中HMGB1蛋白表達(dá)量顯著降低，而胞漿中HMGB1蛋白表達(dá)量顯著升高（P<0.01）;與LPS組比較，陽性對(duì)照組和LPS中、高劑量組細(xì)胞胞核中HMGB1蛋白表達(dá)量均顯著升高，各給藥組細(xì)胞胞漿中HMGB1蛋白表達(dá)量均顯著降低（P<0.01），詳見圖3、表5。

3.6 SFI對(duì)LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α水平的影響

與空白對(duì)照組比較，LPS組細(xì)胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α水平均顯著升高（P<0.01）;與LPS組比較，各給藥組細(xì)胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α水平均顯著降低（P<0.01），詳見表6。

4 討論

內(nèi)毒素休克屬于感染性休克，多因感染革蘭氏陰性菌后機(jī)體多種免疫細(xì)胞釋放促炎因子，進(jìn)一步誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合征及器官功能障礙等病理反應(yīng)[1]。根據(jù)祖國醫(yī)學(xué)的辨證思維，內(nèi)毒素休克是因邪盛正衰、正氣欲脫而邪毒欲閉，屬于中醫(yī)外感病“厥脫”范疇[5-6]。SFI組方源自《傷寒論》四逆加人參湯，由紅參、附子組成。方中，紅參為君藥，具益氣固脫，回陽救逆之效;附子為臣藥，可補(bǔ)火助陽，尚能溫經(jīng)止痛、通痹散結(jié);兩藥配伍，共奏回陽救逆、益氣固脫之效，故臨床上將其用于治療外感陽氣脫失的外感厥脫證，即感染性休克、失血性休克等[13-16]，但其具體作用機(jī)制還有待深入研究和完善。

HMGB1是由215個(gè)氨基酸構(gòu)成的高度保守的核內(nèi)結(jié)構(gòu)蛋白，具有穩(wěn)定核小體結(jié)構(gòu)、修復(fù)及重組DNA、調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化等多種生理功能[2-4]。1999年，Wang H[17]首次通過膿毒癥小鼠模型證實(shí)，胞外HMGB1是一種重要的炎癥介質(zhì)，且具有較強(qiáng)的致死性，這一發(fā)現(xiàn)使得學(xué)者們開始認(rèn)識(shí)到HMGB1作為晚期炎癥因子的重要意義。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，胞外HMGB1與特異性受體RAGE和TLRs家族結(jié)合，可激活NF-κB信號(hào)通路，導(dǎo)致促炎因子如TNF-α、IL-1β等大量產(chǎn)生，而這些促炎因子又可激活單核/巨噬細(xì)胞主動(dòng)分泌HMGB1[2-4]。可見，HMGB1的分泌是一個(gè)正反饋過程，其可作為促炎因子在細(xì)胞因子級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)中不斷觸發(fā)并維持下游炎癥反應(yīng)，加速膿毒血癥的進(jìn)程[18]。由此可見，HMGB1是重癥炎癥相關(guān)性疾病發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵調(diào)控因子。

有研究表明，核內(nèi)HMGB1在炎癥反應(yīng)過程中可能扮演著與胞內(nèi)HMGB1完全不同的角色，如髓源性HMGB1編碼基因敲除小鼠對(duì)LPS的敏感性增加，其肺內(nèi)巨噬細(xì)胞分泌的炎癥因子水平顯著高于野生型小鼠，肺組織損傷也更為嚴(yán)重[19]。類似的情況在胰腺HMGB1編碼基因敲除小鼠和肝臟HMGB1編碼基因敲除小鼠體內(nèi)得以證實(shí)[20-21]。上述研究結(jié)果提示，一方面，HMGB1遷移到細(xì)胞外，可作為致死性炎癥因子促發(fā)炎癥“瀑布效應(yīng)”;另一方面，核內(nèi)HMGB1丟失，又可導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)損傷因素的刺激反應(yīng)更為劇烈，這可能是組織器官受損和功能障礙的重要原因。因此，抑制HMGB1的核移位顯得尤為重要?；谏鲜鲈?，本研究以HMGB1為對(duì)象，并將可反映炎癥嚴(yán)重程度的HMGB1/TLR4信號(hào)通路下游炎癥因子（TNF-α、IL-1β）作為考察指標(biāo)。

本課題組前期研究表明，SFI對(duì)內(nèi)毒素休克模型大鼠肺組織有較好的保護(hù)作用，且能抑制大鼠肺組織中NF-κB、HMGB1的表達(dá)，推測(cè)SFI可能通過抑制免疫細(xì)胞HMGB1的表達(dá)、遷移和分泌來抑制NF-κB信號(hào)通路的活化和炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，從而發(fā)揮對(duì)器官起到保護(hù)的作用[7-8]。基于此，本研究通過建立細(xì)胞炎癥模型，以具有確切炎癥反應(yīng)抑制作用的組蛋白去乙?；敢种苿㏑GFP966[22]為陽性對(duì)照，對(duì)SFI治療內(nèi)毒素休克的機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步研究。結(jié)果顯示，在LPS的誘導(dǎo)下，RAW264.7細(xì)胞內(nèi)HMGB1 mRNA及蛋白的表達(dá)均顯著上調(diào)，且上調(diào)的HMGB1主要分布于胞漿，而核內(nèi)的HMGB1則顯著減少，提示核內(nèi)HMGB1大量向核外遷移，甚至大量分泌到細(xì)胞上清液中;與此同時(shí)，HMGB1的特異性受體TLR4的蛋白表達(dá)量亦顯著增加，提示胞外HMGB1可能與受體結(jié)合激活炎癥通路;隨著HMGB1分泌增加，細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-1β、TNF-α也顯著上調(diào)，提示炎癥通路被激活，大量致炎因子產(chǎn)生。經(jīng)SFI作用后，各給藥組細(xì)胞中HMGB1 mRNA及其蛋白的表達(dá)量，陽性對(duì)照組和SFI中、高劑量組細(xì)胞中TLR4的蛋白表達(dá)量以及各給藥組細(xì)胞上清液中HMGB1、IL-1β、TNF-α水平均較LPS組顯著降低;同時(shí)，陽性對(duì)照組和LPS中、高劑量組細(xì)胞核中HMGB1蛋白表達(dá)量均顯著升高，各給藥組細(xì)胞胞漿中HMGB1蛋白表達(dá)量均顯著降低。由此可見，SFI不僅抑制了HMGB1的轉(zhuǎn)錄、翻譯、核轉(zhuǎn)位及分泌，同時(shí)還增加了細(xì)胞核內(nèi)HMGB1的蛋白表達(dá)，從源頭上降低了HMGB1出胞作為致死性炎癥因子及誘導(dǎo)后續(xù)炎癥反應(yīng)的可能性，這可能是SFI發(fā)揮“扶陽固脫”功效的具體體現(xiàn)。此外，本研究還觀察到SFI抑制了HMGB1特異性受體TLR4蛋白的表達(dá)，并同時(shí)抑制了HMGB1/TLR4信號(hào)通路下游的炎癥因子的分泌，提示SFI可通過抑制HMGB1/TLR4信號(hào)通路的活化從而減少炎癥因子的產(chǎn)生。

綜上所述，SFI可通過抑制巨噬細(xì)胞中HMGB1核移位，從而減少HMGB1分泌出胞，避免炎癥通路的進(jìn)一步激活和炎癥因子的產(chǎn)生，這可能是其治療危急重癥的關(guān)鍵機(jī)制。但SFI為什么可抑制HMGB1出核、這種作用是否跟抑制HMGB1的乙酰化水平有關(guān)等問題均有待后續(xù)深入研究。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] MARSHALL JC. Sepsis definitions：a work in progress[J]. Crit Care Clin，2018，34（1）：1-14.

[ 2 ] INGELS C，DERESE I，WOUTERS PJ，et al. Soluble RAGE and the RAGE ligands HMGB1 and S100A12 in critical illness：impact of glycemic control with insulin and relation with clinical outcome[J]. Shock，2015，43（2）：109-116.

[ 3 ] SU Z，WANG T，ZHU H，et al. HMGB1 modulates Lewis cell autophagy and promotes cell survival via RAGE- HMGB1-Erk1/2 positive feedback during nutrient depletion[J]. Immunobiology，2015，220（5）：539-544.

[ 4 ] LI Y，CHEN Q，JI W，et al. HMGB1 binding to the RAGE receptor contributes to the pathogenesis of asthma[J]. Pediat Allergy Immunol Pulm，2018，31（3）：174-179.

[ 5 ] 胡晶，符子藝，謝雁鳴，等.參附注射液治療感染性休克的系統(tǒng)評(píng)價(jià)[J].中國中藥雜志，2013，38（18）：3209-3214.

[ 6 ] 陳鵬，郭瑞敏，孫燕妮.參附注射液對(duì)感染性休克患者的血流動(dòng)力學(xué)影響的研究進(jìn)展[J].中國中醫(yī)急癥，2018，27（5）：911-914.

[ 7 ] 劉霞，艾飛，褚春薇，等.參附注射液抑制HMGB1核轉(zhuǎn)位保護(hù)內(nèi)毒素休克大鼠肺損傷[J].中藥藥理與臨床，2019，35（1）：2-6.

[ 8 ] 劉霞，艾飛，褚春薇，等.參附注射液對(duì)內(nèi)毒素休克模型大鼠肺組織炎癥的改善作用及抗炎機(jī)制研究[J].中國藥房，2019，30（11）：1492-1497.

[ 9 ] 曾振國，龔洪翰，李勇，等.參附注射液對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的肺泡巨噬細(xì)胞微小RNA-146a表達(dá)的影響[J].中國危重病急救醫(yī)學(xué)，2012，24（3）：166-169.

[10] 明浩，邱珍，夏中元.組蛋白去乙酰化酶3在HK-2細(xì)胞高糖缺氧復(fù)氧損傷中的作用及機(jī)制[J].武漢大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)版），2020，41（2）：178-182.

[11] XU Q，LIU X，MEI LY，et al. Paeonol reduces the nucleocytoplasmic transportation of HMGB1 by upregulating HDAC3 in LPS-induced RAW264.7 cells[J]. Inflammation，2018，41（4）：1536-1545.

[12] HEJAZIZADEH M，MOTALLEB GR，YEGANEH MOG- HADAM A，et al. The study of CYP1A1 gene expression in patients with esophageal cancer by real time PCR[J]. J Shahrekord Univ Med Sci，2017，18（6）：35-43.

[13] WU W，JIANG RL，WANG LC，et al. Effect of Shenfu injection on intestinal mucosal barrier in a rat model of sepsis[J]. Am J Emerg Med，2015，33（9）：1237-1243.

[14] LIU X，LIU R，DAI Z，et al. Effect of Shenfu injection on lipopolysaccharide （LPS）-induced septic shock in rabbits[J]. J Ethnopharmacol，2019. DOI：10.1016/j.jep.2019. 01.008.

[15] 廖文生，李衛(wèi)青，陳世偉，等.參附注射液對(duì)慢性阻塞性肺疾病急性加重期患者炎癥細(xì)胞因子和肺功能的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合急救雜志，2008，15（3）：149-151.

[16] 羅福全，李大珍，葉茂，等.參附注射液預(yù)先給藥對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠腸黏膜上皮的影響[J].重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，38（7）：746-750.

[17] WANG H. HMG-1 as a late mediator of endotoxin lethality in mice[J]. Science，1999，285（5425）：248-251.

[18] HUEBENER P，PRADERE JP，HERNANDEZ C，et al. The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis[J]. J Clin Invest，2015，125（2）：539-550.

[19] YANAI H，MATSUDA A，AN J，et al. Conditional ablation of HMGB1 in mice reveals its protective function against endotoxemia and bacterial infection[J]. Proc Natl Acad Sci U S A，2013，110（51）：20699-20704.

[20] KANG R，ZHANG Q，HOU W，et al. Intracellular HMGB1 inhibits inflammatory nucleosome release and limits acute pancreatitis in mice[J]. Gastroenterology，2014，146（4）：1097-1107.

[21] HUANG H，NACE GW，MCDONALD KA，et al. Hepatocyte-specific high-mobility group box 1 deletion worsens the injury in liver ischemia/reperfusion：a role for intracellular high-mobility group box 1 in cellular protection[J]. Hepatology，2014，59（5）：1984-1997.

[22] LEUS NG，VAN DER WOUDEN PE，VAN DEN BOSCH T，et al. HDAC 3-selective inhibitor RGFP966 demonstrates anti-inflammatory properties in RAW 264.7 macrophages and mouse precision-cut lung slices by attenuating NF-κB p65 transcriptional activity[J]. Biochem Pharmacol，2016. DOI：10.1016/j.bcp.2016.03.010.

（收稿日期：2020-04-03 修回日期：2020-08-05）

（編輯：張?jiān)拢?/p>