王 標，吳妍妍，陳紅莉，魏 勇，齊亞銀*

(1.石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832000；2.新疆天山軍墾牧業(yè)有限責任公司，新疆 石河子 832000；3.新疆天澳牧業(yè)有限公司 新疆 奎屯 833200)

牛病毒性腹瀉(BVD)又稱牛病毒性腹瀉-粘膜病(BVD-MD),是由牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)引起的一種以發(fā)熱、劇烈腹瀉、黏膜糜爛潰瘍、免疫抑制為主要特征的接觸性傳染病[1-2]。該病可引起仔畜先天性免疫缺陷、發(fā)育不良、存活率低等，還可引起妊娠母畜流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎等繁殖障礙性疾病，對養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展帶來嚴重的危害，同時造成嚴重的經(jīng)濟損失。目前該病呈世界性分布，廣泛存在于美國、英國等國家，在我國新疆、內(nèi)蒙、寧夏等20多個省市自治區(qū)均有該病的發(fā)生，隨著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，該病時有發(fā)生，嚴重危害著養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[3-5]。

2019年7月間，新疆某規(guī)?；翀鲫懤m(xù)出現(xiàn)犢牛腹瀉、死亡的情況，發(fā)病犢牛在3月齡以內(nèi)，并且發(fā)病急，病死率高。本試驗以現(xiàn)場流行病學調(diào)查結合實驗室診斷的方法，從發(fā)病原因、經(jīng)過、臨床癥狀、病理剖檢變化入手，同時無菌采集發(fā)病犢牛的腸內(nèi)容物、病死牛的臟器組織以及健康犢牛的腸內(nèi)容物等樣品，通過RT-PCR對BVDV 5’-UTR基因進行檢測及序列分析，試驗結果為本地區(qū)牛病毒性腹瀉-粘膜病的診斷、免疫防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 在本次牧場犢牛發(fā)病期間無菌采集的4頭病死犢牛腸組織、38份發(fā)病犢牛腸內(nèi)容物、10份同群亞健康犢牛腸內(nèi)容物。

1.1.2 主要儀器及試劑 移液器、電動組織研磨器購自上海力辰科技有限公司；TC-512 PCR 儀購自英國 Bibby 科技有限公司；DYY-6B 電泳儀購自雷琪實驗器材有限公司；電子天平購自上海歡奧科技有限公司；離心機購自SiGMA 離心機公司；全自動凝膠成像系統(tǒng)儀購自美國BIO-RAD公司；總RNA提取試劑盒、普通瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒購自天根生化科技有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自寶生物工程大連公司；引物由北京睿博興科生物技術有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 現(xiàn)場流行病學調(diào)查 2019年7月間，3次前往某大型牧場進行調(diào)查取樣，與管理人員溝通，了解犢牛發(fā)病史、發(fā)病年齡、發(fā)病特點、往年發(fā)病率和發(fā)病季節(jié)，檢查圈養(yǎng)犢牛情況，包括圈舍衛(wèi)生、環(huán)境清潔程度、空氣質(zhì)量、溫度、初乳投喂量、消毒、病犢隔離等情況，觀察感染犢牛的癥狀，包括感染犢牛的整體狀態(tài)、精神狀態(tài)、體溫、食欲和排便等情況，詢問治療情況和效果，并做好記錄，解剖病死犢牛，觀察內(nèi)臟病理情況，采集樣本。

1.2.2 RT-PCR檢測 將采集的病料處理后，使用總RNA提取試劑盒提取病毒核酸，然后使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，最后使用參照文獻[4]中BVDV 5’-UTR引物(詳表1)進行PCR和瓊脂凝膠電泳試驗以及目的條帶的回收和測序，反轉(zhuǎn)錄反應體系及條件詳見表2, PCR 反應體系及擴增程序詳見表3。

表1 試驗中BVDV 5’-UTR基因的引物序列

表2 反轉(zhuǎn)錄反應體系及條件

表3 PCR 反應體系及擴增程序

1.2.3 序列測定與分析 將從兩頭死亡犢牛腸組織中提取的核酸經(jīng)RT-PCR擴增后的陽性產(chǎn)物切膠回收，然后與PMD19-T載體16 ℃連接過夜，使用E.coli DH5α感受態(tài)細胞對連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化，再涂布于含有AMP的LB培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單個菌落進行菌液PCR驗證，最后將這2份陽性樣品送至北京睿博興科生物技術有限公司進行測序。使用DNAStar軟件分析測序結果，與GenBank中登錄的8株BVDV-1型、4株BVDV-2型參考株(表4)進行序列比對和同源性比較，并使用MEGA軟件構建BVDV5’-UTR基因系統(tǒng)進化樹。

2 結果與分析

2.1 現(xiàn)場流行病學調(diào)查結果

本次疾病發(fā)生于炎熱的夏季，發(fā)病犢牛年齡集中在3月齡以內(nèi)，存在水平傳播和垂直傳播兩種方式，潛伏期2～14 d不等。在調(diào)查期間該牧場共有

142頭犢牛，發(fā)病率為39.43%(56/142)，死亡18頭，病死率為32.14%(18/56)；犢牛圈舍整體環(huán)境較差，糞便未能及時清理，未安裝換氣扇，導致空氣不流通，氨氣味較重，沒有降溫設備，圈舍整體溫度較高。飼養(yǎng)管理人員防范意識淡薄，僅使用石灰對地面進行消毒，未對周圍環(huán)境進行消毒，發(fā)病犢牛仍與其他健康犢牛同群飼喂，未進行嚴格隔離。查閱資料表明，該牧場往年同季節(jié)也曾發(fā)生過本病。

發(fā)病犢牛主要表現(xiàn)為精神沉郁、食欲減退或廢絕、反芻停止、被毛粗亂無光澤、體溫升高至39.8～41.5 ℃之間、嚴重腹瀉、部分糞便中帶有血液和腸黏膜碎片、部分病牛表現(xiàn)有神經(jīng)癥狀和呼吸困難。病理解剖可見病死牛嚴重脫水、腸道有大量出血點、腸黏膜有出血點、腸壁菲薄、胃腸道內(nèi)容物有大量氣泡、腸系膜淋巴結腫大、心臟表面充血、少量出血點、心包內(nèi)有大量積液，打開顱腔可見腦組織腫脹有出血點、顱腔內(nèi)有積液,詳見圖1。

注:1.血樣糞便；2.腸道廣泛性出血；3.腸黏膜出血；4.胃腸內(nèi)容物有大量氣泡；5.腸系膜淋巴結腫大出血；6.心臟表面充血出血

2.2 RT-PCR檢測結果

將采集的病料樣品經(jīng)過RT-PCR檢測，可以擴增得到293 bp大小的目的基因，確定該病病原為BVDV，其中死亡犢牛腸組織核酸提取樣陽性率為100.00%(4/4)，發(fā)病犢牛腸內(nèi)容物提取樣核酸陽性率為94.74%(36/38)，同群亞健康犢牛腸內(nèi)容物提取樣核酸陽性率為30.00%(3/10)，結果詳見圖2。

注:M為DNA 標準 DL 1000; 0為陽性對照1～2為死亡犢牛組織提取樣;3～5為發(fā)病犢牛糞便提取樣;6為亞健康犢牛糞便提取樣;7為陰性對照。

2.3 遺傳進化分析

此次共送檢測序兩份RT-PCR陽性樣品，將這兩份陽性樣品的測序結果使用DNAStar Meggalign軟件與部分BVDV參考株進行序列對比(圖3)。此次測序的2份陽性樣品的同源性為99.0%，XJB19-01株、XJB19-02株均與參考BJ-2013的同源性最高，分別為97.9%、98.4%，屬于BVDV-1a型。使用MEGA軟件將測序的兩株BVDV基因與部分參考株做系統(tǒng)遺傳進化樹，結果(圖4)表明，相比于其他參考株，XJB19-01和XJB19-02與參考株BJ-2013處于同一進化分支，三者親緣關系最近。

圖3 檢測陽性基因與GeneBank上參考株同源性比較

圖4 BVDV 5’-UTR 基因系統(tǒng)進化樹

3 討論

近年來，隨著我國養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，越來越多的疾病也隨之而來，嚴重困擾并影響著養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。牛病毒性腹瀉-粘膜病目前在世界各地均有發(fā)病的報道，該病自20世紀40年代在美國首次發(fā)現(xiàn)以來[6]，便在世界范圍內(nèi)廣泛流行和傳播。目前為止在我國新疆等20多個省市自治區(qū)都有發(fā)病，表明該病具有很強的傳染性，同時牛群感染BVDV已經(jīng)是很普遍的現(xiàn)象[7-8]。

本次試驗采用現(xiàn)場流行病學調(diào)查和實驗室檢測相結合的方法進行診斷，具有較高的準確性。通過對發(fā)病犢牛的年齡、臨床癥狀、病理剖檢情況及實驗室檢測發(fā)現(xiàn)，該牧場發(fā)病感染牛群呈現(xiàn)低齡化，引起的病變典型，病死率高，存在較多的隱性感染牛，增大了防控難度。

加強飼養(yǎng)管理，隔離淘汰病牛，嚴格按照消毒程序?qū)θι徇M行徹底消毒，改善飼養(yǎng)環(huán)境，降低炎熱的天氣對犢牛造成的應激反應，提高犢牛的舒適感。健康牛群使用BVD-IBR二聯(lián)疫苗(哞樂優(yōu))免疫。在免疫前14 d、免疫后21 d采用ELISA的方法對隨機選取的21頭健康犢牛的血清進行BVDV抗體檢測，陽性率分別為61.90%(13/21)、90.48%(19/21)，免疫后抗體水平相比于免疫前得到了顯著的提升，經(jīng)上述方法的綜合防控，該牧場已經(jīng)有效的控制了本病的進一步發(fā)生。由此也進一步表明牛群整體抗體陽性率達到較高水平時可以避免疾病在牛群內(nèi)傳播，同時疫苗免疫也是防控疾非常有效的方法之一。

關于本病的防控，全世界養(yǎng)牛國家主要有兩種做法，一是歐洲各國目前采取的是檢疫、淘汰的方法，取得了較好的效果，但也存在投資大、耗時長等問題；二是美國等部分地區(qū)的做法，采用檢疫結合免疫的方式，效果較好[9-10]。結合我國畜牧業(yè)國情及本次試驗結果，建議首先對牛群進行檢疫，篩選并淘汰PI牛，從根本上消滅傳染源；其次制定嚴格全面生物安全防控，加強消毒，加強飼養(yǎng)管理，改善牛群生長環(huán)境，減少應激，提高牛群抗病力；同時采用BVD-IBR二聯(lián)疫苗全群免疫，科學規(guī)范免疫程序，定期抗體檢測，通過科學的免疫防控控制該病的發(fā)生。