賀 豐，朱立國(guó)*，趙 赫，付玲玲，李學(xué)朋

（1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院，北京 100102；2.清華大學(xué)材料學(xué)院，北京 100084；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院，北京 100700）

神經(jīng)根型頸椎病是一種較為常見的神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙性疾病,常由頸部脊髓神經(jīng)根受到機(jī)械壓迫或因神經(jīng)根周圍組織受損釋放炎性因子刺激導(dǎo)致,如間盤退變椎間孔變窄、椎間關(guān)節(jié)活動(dòng)度減小、鉤突關(guān)節(jié)增生等［1］。Radhakrishnan等［2］研究表明50～54歲年齡組每10萬人的年發(fā)病率最高可達(dá)202.9,隨著電腦、智能手機(jī)的普及和伏案工作時(shí)間增長(zhǎng),發(fā)病率逐漸增高,而且發(fā)病年齡逐漸年輕化。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病屬于“項(xiàng)痹” 范疇,內(nèi)因氣血不足,不能濡養(yǎng)筋骨,外加勞累,起居不慎,風(fēng)寒濕邪入侵,壅閉經(jīng)絡(luò),導(dǎo)致氣血凝滯、經(jīng)絡(luò)不通而產(chǎn)生疼痛、麻木等癥狀［3］。神經(jīng)根型頸椎病以上肢疼痛,受累神經(jīng)根支配區(qū)域感覺異常、肌力減退甚至肌肉萎縮為典型癥狀,嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。其治療方法主要以非手術(shù)療法為主,西醫(yī)包括頸部制動(dòng)、牽引、理療、抗炎、神經(jīng)根脫水、硬膜外激素注射等［4］。而中醫(yī)治療神經(jīng)根型頸椎病具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì),包括針灸、手法、拔罐、中藥外敷、小針刀、中藥方劑辨證施治等。其中,辨證后使用方劑治療神經(jīng)根型頸椎病是一種別具特色且效果良好的方法。

行氣活血通絡(luò)方,是中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院院內(nèi)制劑,由三七、川芎、延胡索、秦艽、獨(dú)活、桂枝、葛根、威靈仙、當(dāng)歸、白芍、地龍11味中藥組成,具有活血通絡(luò)、行氣止痛之效。其中,川芎、延胡索活血行氣、散郁止痛共為君藥。白芍,養(yǎng)血合營(yíng)、緩急止痛；當(dāng)歸、地龍補(bǔ)血活血、通經(jīng)活絡(luò),主肢體麻木,半身不遂；桂枝、葛根溫經(jīng)通脈,善治頸項(xiàng)肢節(jié)強(qiáng)痛,上5味共為臣藥。秦艽、威靈仙、獨(dú)活祛風(fēng)除濕,和血舒筋,通絡(luò)止痛,主風(fēng)濕痹痛,肢麻筋攣,頭項(xiàng)難伸共為佐藥；三七活血消腫、祛瘀止痛為使藥。諸藥合用化瘀行氣、通絡(luò)止痛,治療神經(jīng)根型頸椎病臨床效果顯著。目前的研究多通過臨床療效或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討行氣活血通絡(luò)方作用機(jī)制,對(duì)其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及分子水平作用機(jī)制等方面研究尚不明確。并且由于復(fù)方中藥活性成分多樣,可作用于不同靶點(diǎn),所以用常規(guī)方法來描述此方治療神經(jīng)根型頸椎病藥理學(xué)機(jī)制則顯得比較困難。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于藥物通過“多靶點(diǎn)、多途徑、多通路” 發(fā)揮作用的理念而發(fā)展起來的新方法［5］,它可整合各種藥物、蛋白、基因等數(shù)據(jù)庫(kù),采用生物信息學(xué)技術(shù)分析和構(gòu)建藥物-靶點(diǎn)-疾病的網(wǎng)絡(luò)相互作用模型,探索藥物發(fā)揮作用機(jī)制,其整體性、系統(tǒng)性的特點(diǎn)非常適合應(yīng)用于中藥及中藥復(fù)方的研究。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)行氣活血通絡(luò)方治療神經(jīng)根型頸椎病的機(jī)制進(jìn)行探討,并為中藥復(fù)方的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 行氣活血通絡(luò)方所含成分的收集與篩選 行氣活血通絡(luò)方由11味中藥組成,分別是三七、川芎、延胡索、秦艽、獨(dú)活、桂枝、葛根、威靈仙、當(dāng)歸、白芍、地龍。通過國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)調(diào)研和中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)分析平臺(tái)TCMSP （https：//tcmspw.com/tcmsp.php）收集以上11味中藥的活性成分,因地龍未在TCMSP中收錄,因此通過BATMAN-TCM （http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索其活性成分,然后將地龍活性成分輸入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索,最后以口服生物利用度（oral bioavailability,OB）≥30% 和類藥性 （drug-likeness,DL）≥0.18［6］為限定條件對(duì)所有活性成分進(jìn)行篩選。

1.2 行氣活血通絡(luò)方成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“1.1” 項(xiàng)中篩選出的活性成分的相關(guān)蛋白靶點(diǎn),由于檢索到的蛋白靶點(diǎn)存在命名不規(guī)范的問題,因此使用UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org/）中的UniprotKB搜索功能,通過輸入靶點(diǎn)名稱并設(shè)定物種為人,將檢索到的所有靶點(diǎn)蛋白校正為其官方基因名稱（Official Symbol）。

1.3 神經(jīng)根型頸椎病相關(guān)基因靶點(diǎn)的篩選 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù) （http：//www.genecards.org,Version 4.5.0）、OMIM數(shù) 據(jù) 庫(kù) （https：//omim.org/）和DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.disgenet.org）檢索與神經(jīng)根型頸椎病相關(guān)基因。因?yàn)樯窠?jīng)根型頸椎病屬于周圍神經(jīng)損傷,為了使結(jié)果更加全面準(zhǔn)確,因此分別使用檢索詞peripheral nerve injury、cervical radiculopathy進(jìn)行檢索,獲取與神經(jīng)根型頸椎病相關(guān)基因。

1.4 行氣活血通絡(luò)方活性成分靶點(diǎn)與神經(jīng)根型頸椎病相關(guān)靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 利用R語言韋恩圖將行氣活血通絡(luò)方活性成分靶點(diǎn)基因與神經(jīng)根型頸椎病相關(guān)基因進(jìn)行合并,交集的部分很有可能是行氣活血通絡(luò)方活性成分治療神經(jīng)根型頸椎病的靶點(diǎn)基因。將交集基因及與之對(duì)應(yīng)化合物導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建行氣活血通絡(luò)方活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),并對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析,保存網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果。在網(wǎng)絡(luò)中,用節(jié)點(diǎn)（node）表示成分和靶點(diǎn),用邊（edge）表示成分與靶點(diǎn)之間的相互作用。

1.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org,Version 10.5）［7］是一個(gè)收集了大量蛋白相互作用關(guān)系的數(shù)據(jù)庫(kù),其中包含了經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和通過生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)得到的數(shù)據(jù),共涉及9 643 763個(gè)蛋白,1 380 838 440個(gè)相互作用。將行氣活血通絡(luò)方活性成分作用的蛋白靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),限定物種為人,獲取蛋白相互作用關(guān)系,結(jié)果保存成TSV格式,導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0軟件繪制相互作用網(wǎng)路。首先對(duì)此蛋白互作網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行總體分析,然后使用Cytoscape 3.6.0軟件中的cytohubba插件確定最重要的10個(gè)蛋白互作關(guān)系,計(jì)算方法的選擇最大團(tuán)中心性（maximal clique centrality,MCC）［8］。

1.6 GO分析與KEGG通路分析 Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//metascape.org）可為大規(guī)模的基因或蛋白提供系統(tǒng)綜合的生物功能注釋信息,能夠找出最顯著富集的生物學(xué)注釋［9］。將行氣活血通絡(luò)方的作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù),Input as species和Analysis as species均設(shè)置為H.sapiens,選擇自定義分析（Custom Analysis）中的富集（Enrichment）,分別對(duì)GO Biological Processes、GO Molecular Functions、GO Cellular Components、KEGG Pathway進(jìn)行富集分析（Enrichment Analysis）,保存結(jié)果,篩選排名靠前條目。GO分析用GraphPad Prism 7.0軟件繪制條形圖、KEGG Pathway,用R語言繪制氣泡圖。

2 結(jié)果

2.1 行氣活血通絡(luò)方成分的收集與篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù),以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為參數(shù)收集行氣活血通絡(luò)方中符合條件的活性成分,結(jié)果三七8種、川芎8種、延胡索49種、秦艽2種、獨(dú)活9種、桂枝7種、葛根4種、威靈仙7種、當(dāng)歸2種、白芍13種；地龍?jiān)贐ATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到8種活性成分,代入TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)后,滿足篩選條件的1種。所有化合物去重后共得到93種活性成分。

2.2 行氣活血通絡(luò)方靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索行氣活血通絡(luò)方所含93種活性成分,結(jié)果得到出784個(gè)靶點(diǎn),其中三七54個(gè)、川芎45個(gè)、延胡索215個(gè)、秦艽40個(gè)、獨(dú)活92個(gè)、桂枝52個(gè)、葛根69個(gè)、威靈仙53個(gè)、當(dāng)歸70個(gè)、白芍90個(gè)、地龍4個(gè)。去重后共得到250個(gè)靶點(diǎn),通過UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將靶點(diǎn)蛋白轉(zhuǎn)換為官方名稱（Officical Symbol）。

2.3 神經(jīng)根型頸椎病相關(guān)基因靶點(diǎn)篩選 在數(shù)據(jù)庫(kù)中以peripheral nerve injury、cervical radiculopathy進(jìn)行檢索后,分別獲得5 025、79個(gè)相關(guān)基因靶點(diǎn),刪除重復(fù)后共得到5 041個(gè)神經(jīng)根型頸椎病相關(guān)基因。

2.4 行氣活血通絡(luò)方活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)互作 將“2.2” “2.3” 項(xiàng)中的基因進(jìn)行映射對(duì)比,發(fā)現(xiàn)213個(gè)共同基因,見圖1,推測(cè)這些可能為行氣活血通絡(luò)方治療神經(jīng)根型頸椎病的基因靶點(diǎn)。將交集基因靶點(diǎn)與對(duì)應(yīng)活性成分輸入Cytoscape 3.6.0軟件構(gòu)建行氣活血通絡(luò)方活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò),見圖2。圖中共涉及303個(gè)節(jié)點(diǎn),1 239條邊,其中菱形節(jié)點(diǎn)代表行作用靶點(diǎn),圓形代表活性成分,邊代表活性成分和作用靶點(diǎn)間的相互關(guān)聯(lián)。從圖中可看出同一靶點(diǎn)可對(duì)應(yīng)于不同的活性成分,同一活性成分也可對(duì)應(yīng)于不同的靶點(diǎn),體現(xiàn)了行氣活血通絡(luò)方多成分、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)。其中川芎、延胡索共有成分槲皮素（quercetin/133個(gè)靶點(diǎn)）,白芍獨(dú)有成分山柰酚（kaempferol/52個(gè)靶點(diǎn)）,葛根獨(dú)有成分芒柄花黃素（formononetin/34個(gè)靶點(diǎn)）是作用靶點(diǎn)最多3種化合物。β-谷甾醇（beta-sitosterol/33個(gè)靶點(diǎn)）作用靶點(diǎn)數(shù)目排名第4,但當(dāng)歸、白芍、獨(dú)活、三七、秦艽、桂枝、葛根、威靈仙8味藥中都含有此種成分。因此,上述4種化合物可能是此方劑中比較重要的活性成分。

2.5 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果見圖3,圖中節(jié)點(diǎn)表示蛋白,邊表示蛋白之間的關(guān)聯(lián),共涉及210個(gè)節(jié)點(diǎn),3 721條邊（其中ADH1C、ATP5F1B未在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到,EIF6與其他蛋白沒有相互作用,這3個(gè)蛋白不在相互作用網(wǎng)絡(luò)中體現(xiàn)）。使用cytohubba插件中MCC方法計(jì)算后,確定最重要的10個(gè)蛋白互作關(guān)系,結(jié)果見圖4。

圖1 行氣活血通絡(luò)方化合物相關(guān)靶點(diǎn)與神經(jīng)根型頸椎病相關(guān)靶點(diǎn)映射

圖2 行氣活血通絡(luò)方“活性成分-靶點(diǎn)” 相互作用網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

2.6 基因功能分析 使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)行氣活血通絡(luò)方活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析,并篩選靠前的生物學(xué)過程、分子功能和細(xì)胞組分,用GraphPad Prism 7.0軟件繪圖,見圖5～7。

圖4 10個(gè)最重要的蛋白互作關(guān)系

其中BP分析（圖5）中排名靠前的有response to toxic（對(duì)有毒物質(zhì)的反應(yīng),65個(gè)靶點(diǎn)/30.66%）、response to inorganic substance （對(duì)無機(jī)物的反應(yīng),61個(gè)靶點(diǎn)/28.77%）、cellular response to nitrogen compound （細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng),59個(gè)靶點(diǎn)/27.83%）、cellular response to organic cyclic compound （細(xì)胞對(duì)有機(jī)環(huán)狀化合物的反應(yīng),56個(gè)靶點(diǎn)/26.42%）、response to lipopolysaccharide （對(duì)脂多糖的反應(yīng),44個(gè)靶點(diǎn)/20.75%）等生物學(xué)過程。MF分析（圖6）排名靠前的的有neurotransmitter receptor activity （神經(jīng)遞質(zhì)受體活性,22個(gè)靶點(diǎn)/10.38%）、kinase binding （激酶結(jié)合,39個(gè)靶點(diǎn)/18.4%）、G protein-coupled amine receptor activity（G蛋白偶聯(lián)胺受體活性,15個(gè)靶點(diǎn)/7.08%）、transcription factor binding （轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合,35個(gè)靶點(diǎn)/16.51%）、protein domain specific binding （蛋白域特異性結(jié)合,34個(gè)靶點(diǎn)/16.04%）等分子功能。CC分析（圖7）排名靠前的有membrane raft （膜筏,31個(gè)靶點(diǎn)/14.62%）、postsynaptic membrane （突觸后膜,26個(gè)靶點(diǎn)/12.26%）、dendrite （樹突,32個(gè)靶點(diǎn)/15.09%）、receptor complex （受體復(fù)合物,26個(gè)靶點(diǎn)/12.26%）、vesicle lumen （囊腔,19個(gè)靶點(diǎn)/8.96%）等細(xì)胞組分。

圖5 GO分析生物學(xué)過程

圖6 GO分析分子功能

圖7 GO分析細(xì)胞組分

2.7 KEGG通路分析 使用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)行氣活血通絡(luò)方治療神經(jīng)根型頸椎病的213個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路分析,根據(jù)LogP值篩選靠前的10個(gè)代表性通路見圖8。圖中節(jié)點(diǎn)的顏色從綠到紅反應(yīng)了LopP值從大到小,節(jié)點(diǎn)從小到大反應(yīng)了相關(guān)基因數(shù)量的從少到多。結(jié)果顯示,行氣活血通絡(luò)方治療神經(jīng)根型頸椎病的機(jī)制主要涉及AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications、Pathways in cancer、TNF signaling pathway、Neuroactive ligand-receptor interaction、HTLV-I infection、MAPK signaling pathway、Platinum drug resistance、cAMP signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、Amoebiasis等通路。因此推測(cè)行氣活血通絡(luò)方治療神經(jīng)根型頸椎病可能與上述通路關(guān)系密切。

3 討論

神經(jīng)根型頸椎是頸椎病分型中的一種,以放射性上肢疼痛麻木或上肢感覺、運(yùn)動(dòng)功能障礙為主要表現(xiàn)。中藥治療頸椎病一般采取祛風(fēng)散寒、活血行氣、化痰祛濕、補(bǔ)益肝腎、通絡(luò)止痛等治療方法。行氣活血通絡(luò)方,是中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院院內(nèi)協(xié)定方,由三七、川芎、延胡索、秦艽、獨(dú)活、桂枝、葛根、威靈仙、當(dāng)歸、白芍、地龍11味中藥組成。方中川芎、延胡索活血行氣、散郁止痛共為君藥。白芍,合營(yíng)止痛；當(dāng)歸、地龍活血通絡(luò)；桂枝、葛根溫經(jīng)通脈,上5味共為臣藥。秦艽、威靈仙、獨(dú)活祛風(fēng)除濕,通絡(luò)止痛,共為佐藥；三七活血消腫、祛淤止痛為使藥。諸藥合用活血行氣、通絡(luò)止痛,臨床采用此方加減治療神經(jīng)根型頸椎病具有良好療效,以此方為基礎(chǔ)化裁出的頸痛顆粒,已經(jīng)批準(zhǔn)上市用于治療神經(jīng)根型頸椎?。?0］。但行氣活血通絡(luò)方治療神經(jīng)根型頸椎病的藥理學(xué)機(jī)制尚不明確。

圖8 行氣活血通絡(luò)方治療神經(jīng)根型頸椎病相關(guān)靶點(diǎn)KEGG通路富集

本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法從行氣活血通絡(luò)方所含11味中藥中,篩選出93種活性成分,250個(gè)基因靶點(diǎn),其中有213個(gè)基因與神經(jīng)根型頸椎病相關(guān),構(gòu)建行氣活血通絡(luò)方活性成分-作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖,有303個(gè)節(jié)點(diǎn),1 239條邊。顯示了行氣活血通絡(luò)方多成分、多靶點(diǎn)共同作用治療神經(jīng)根型頸椎病的特點(diǎn)。其中槲皮素是行氣活血通絡(luò)方中君藥川芎、延胡索的共有成分,擁有133個(gè)作用靶點(diǎn)在所有化合物中排名第1。臣藥白芍的化合物山柰酚、葛根的化合物芒柄花黃素分別作用于52、44個(gè)靶點(diǎn)位列第2、3位,間接說明了君、臣藥在此方中的重要作用。而第4位的β-谷甾醇（beta-sitosterol/33個(gè)靶點(diǎn)）是當(dāng)歸、白芍、獨(dú)活、三七、秦艽、桂枝、葛根、威靈仙8味中藥的共有化合物,說明此方劑組合可產(chǎn)生一定的協(xié)同作用。以上兩點(diǎn)可反應(yīng)此方配伍較為科學(xué)合理。槲皮素是一種廣泛存在于自然界的天然黃酮類化合物,目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)它具有多重生物活性,如抗氧化、抗病毒、抗炎作用［11］。Lazo-Gomez等［12］研究表明,槲皮素可通過活化sirtuin 1 （去乙酰化酶）防止慢性興奮毒性刺激引起的脊髓運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元退行性變。Chen等［13］研究表明槲皮素可通過調(diào)節(jié)與再生和營(yíng)養(yǎng)支持有關(guān)的基因的表達(dá),如增加環(huán)磷酸腺苷表達(dá)使神經(jīng)細(xì)胞在外周神經(jīng)軸突再生中的生長(zhǎng)激活,促進(jìn)軸突再髓化,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度加快,從而促進(jìn)小鼠坐骨神經(jīng)擠壓損傷后運(yùn)動(dòng)和感覺功能的恢復(fù)。山柰酚是一種黃酮類化合物,具有明顯的抗氧化和抗炎活性。Su等［14］研究表明,山柰酚通過抑制NADPH氧化酶和保護(hù)SHP-2 （酪氨酸磷酸酶）免受氧化失活抑制膠原誘導(dǎo)的血小板活化,這說明山柰酚具有預(yù)防和治療血栓性血管疾病的治療潛力。農(nóng)藥毒死蜱（Chlorpyrifos,CPF）,是一種潛在的食品污染物,會(huì)引起神經(jīng)毒性,Hussein等［15］研究表明,山柰酚可能通過調(diào)節(jié)GSK3β-Nrf2 （糖原合成酶激酶3β-核因子E2相關(guān)因子）信號(hào)通路,抑制GSK3β 介導(dǎo)基因表達(dá)和誘導(dǎo)Nrf2在大腦組織表達(dá),提高抗氧化酶活性和乙酰膽堿酯酶活性,起到對(duì)神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用。芒柄花黃素可抑制腦內(nèi)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激,從而起到對(duì)腦外傷大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用［16］。β-谷甾醇廣泛地存在于多種植物的細(xì)胞膜中,藥理活性多樣,研究表明,β-谷甾醇可調(diào)控多種細(xì)胞信號(hào)通路,包括細(xì)胞周期、凋亡、增殖、存活、侵襲、血管生成、轉(zhuǎn)移和炎癥［17］。

蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示行氣活血通絡(luò)方作用于神經(jīng)根型頸椎病的靶點(diǎn)間存在著復(fù)雜的交互關(guān)系,而不是獨(dú)立的發(fā)揮作用,網(wǎng)絡(luò)中共有210個(gè)節(jié)點(diǎn),3 721條邊,經(jīng)過計(jì)算后發(fā)現(xiàn)JUN （轉(zhuǎn)錄因子AP-1）、VEGFA （血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A）、TP53 （腫瘤抑制蛋白）、AKT1 （蛋白激酶B）、MAPK1 （絲裂原激活的蛋白激酶1）、BCL2 （細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白）、PIK3CG （磷脂酰肌醇3激酶）、IL-6 （白細(xì)胞介素6）、PTGS2 （前列腺素內(nèi)過氧化物合酶）、MMP9 （基質(zhì)金屬蛋白酶9）等可能是行氣活血通絡(luò)方治療神經(jīng)根型頸椎病的主要靶蛋白。GO富集分析發(fā)現(xiàn),行氣活血通絡(luò)方治療神經(jīng)根型頸椎病主要涉及毒性反應(yīng)、無機(jī)物反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)有機(jī)循環(huán)化合物的反應(yīng)、脂多糖反應(yīng)、細(xì)胞對(duì)藥物的反應(yīng)、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號(hào)通路、氧水平反應(yīng)、類固醇激素反應(yīng)、活性氧代謝等生物學(xué)過程；涉及神經(jīng)遞質(zhì)受體的活性、激酶結(jié)合、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域特異性結(jié)合、蛋白異構(gòu)化活性、核受體活性、突觸后神經(jīng)遞質(zhì)受體活性、受體調(diào)節(jié)活性、蛋白酶結(jié)合等分子功能；涉及膜筏、突觸后膜、樹突、受體復(fù)合體、囊泡腔、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體、胞質(zhì)核周區(qū)、細(xì)胞頂部、樹突膜等細(xì)胞組分,是一個(gè)復(fù)雜的過程。

通過KEGG生物途徑富集分析發(fā)現(xiàn),有10條信號(hào)通路被顯著富集。其中,腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）信號(hào)通路,可誘導(dǎo)多種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo),包括凋亡、細(xì)胞存活、炎癥和免疫Rothman等［18］研究發(fā)現(xiàn)大鼠頸背根神經(jīng)節(jié)受壓可產(chǎn)生疼痛,而TNF-α 抗體可阻斷相關(guān)信號(hào)傳導(dǎo)提高痛閾。NF-κB （nuclear factor-kappa B,NF-κB）是一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子家族的通稱,可調(diào)控涉及免疫、炎癥和細(xì)胞存活的基因。Suzuki等［19］發(fā)現(xiàn)使用NF-κB拮抗劑可明顯抑制大鼠受壓背根神經(jīng)節(jié)中轉(zhuǎn)錄激活因子3 （ATF-3）及降鈣素基因相關(guān)肽（CGRP）基因表達(dá),從而提高大鼠的機(jī)械性痛閾和熱覺痛閾,同時(shí)也證明NF-κB可能是腰椎間盤突出引起的坐骨神經(jīng)痛明確的治療靶點(diǎn)。晚期糖基化終末產(chǎn)物與其受體（AGEs-RAGE）是一組特異性組合,AGEs的產(chǎn)生和蓄積是導(dǎo)致神經(jīng)、血管等多組織器官損傷的重要病理基礎(chǔ)［20］。AGEs與RAGE相互作用啟動(dòng)一系列受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,激發(fā)多種細(xì)胞因子的形成與釋放,導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)、血管的病理改變。AGEs與RAGE的相互作用還可導(dǎo)致氧化應(yīng)激的發(fā)生,進(jìn)而激活NF-κB。NF-κB的激活可以增加黏附因子、內(nèi)皮素和促凝血組織因子等基因的表達(dá),使血流調(diào)節(jié)受損,導(dǎo)致神經(jīng)內(nèi)膜血流灌注減少［21］。神經(jīng)活性配體-受體相互作用是質(zhì)膜上所有與細(xì)胞內(nèi)外信號(hào)通路相關(guān)的受體和配體的集合。涉及環(huán)境信息處理,信號(hào)分子間相互作用等功能。人T細(xì)胞白血病病毒1型（HTLV-1）是一種致病性逆轉(zhuǎn)錄病毒,除了成人T細(xì)胞白血病/淋巴瘤（ATL）有關(guān),它還與非腫瘤性慢性炎性疾病密切相關(guān),Tax是此通路中一種病毒調(diào)控蛋白和轉(zhuǎn)錄輔助因子,可干擾與抗凋亡或細(xì)胞增殖相關(guān)的多個(gè)信號(hào)通路,Tax調(diào)控信號(hào)通路也可涉及到它的結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB等［22］。絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級(jí)聯(lián)是一個(gè)高度保守的模塊,參與細(xì)胞的增殖、分化和遷移等多種功能。Obata等［23］研究表明MAPK在初級(jí)傳入神經(jīng)的活化作用,可能與炎癥誘導(dǎo)的神經(jīng)根病變的病理生理機(jī)制相關(guān),初級(jí)傳入神經(jīng)中的MAPK通路,可能是背根神經(jīng)節(jié)體細(xì)胞附近由炎性引起的神經(jīng)病理性疼痛潛在的藥物干預(yù)靶點(diǎn)。環(huán)腺苷酸信號(hào)通路（cAMP signaling pathway,cAMP）是最常見、最普遍的第二信使之一,它的形成是由腺苷酰環(huán)化酶（AC）在G蛋白偶聯(lián)受體（GPCRs）被激素、神經(jīng)遞質(zhì)等信號(hào)分子配體連接后激活而促進(jìn)的。細(xì)胞內(nèi)cAMP水平的改變會(huì)影響細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,進(jìn)而調(diào)節(jié)蛋白活性、基因表達(dá)和細(xì)胞功能,進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、分化和凋亡［24］。據(jù)報(bào)道［25］,神經(jīng)組織中cAMP水平的升高不僅有助于減少SCI后的繼發(fā)性病理反應(yīng),還能促進(jìn)神經(jīng)再生。Yang等［26］研究表明,補(bǔ)陽還五湯聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)脊髓損傷后紅核神經(jīng)元的神經(jīng)保護(hù)具有協(xié)同作用,其機(jī)制可能與上調(diào)cAMP水平、激活cAMP/CREB/RhoA信號(hào)通路、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)因子表達(dá)有關(guān)。此外癌癥、阿米巴病、鉑耐藥3個(gè)信號(hào)通路也富集了較豐富的基因,這3條通路參與細(xì)胞的增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、遷移,還與炎性反應(yīng)、血管的生成、細(xì)胞凋亡等多種生物功能相關(guān)。因此推斷行氣活血通絡(luò)方可能通過以上通路發(fā)揮治療神經(jīng)根型頸椎病的作用。

綜上所述,本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)行氣活血通絡(luò)方治療神經(jīng)根型頸椎病的機(jī)制進(jìn)行探討,發(fā)現(xiàn)此方包含多種活性成分,涉及多種信號(hào)通路和生物過程,體現(xiàn)了“多成分-多靶點(diǎn)-多途徑發(fā)揮作用的特點(diǎn)。以期為研究行氣活血通絡(luò)方治療作用的分子機(jī)制及藥理學(xué)機(jī)制奠定基礎(chǔ),同時(shí)也為其他復(fù)方中藥的研究提供思路和方法。