敖青霞，姜媛媛，許 軻，豐先紅，趙茂俊，張 利*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，四川雅安 625014；2.四川省園藝作物技術(shù)推廣總站，四川成都 610041；3.甘孜藏族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，四川康定 626000）

丹參Salvia miltiorrhizaBge.唇形科鼠尾草屬多年生草本植物,以其干燥根和根莖入藥［1-2］,是我國傳統(tǒng)大宗藥材。丹參主要有效成分為水溶性酚酸類和脂溶性丹參酮類,其中酚酸類具有較強的抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基能力,是目前已知抗氧化作用最強的天然產(chǎn)物之一［3］。李欣等［4］發(fā)現(xiàn)丹參葉中總酚酸含有量較高,且總酚酸含有量和抗氧化活性之間有很高的相關(guān)性。曾慧婷等［5］發(fā)現(xiàn),丹參莖葉具有較強的抗氧化活性,其提取物中富含酚酸類成分,如丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素和咖啡酸。丹參莖葉雖富含酚酸類成分,但在實際生產(chǎn)過程中并未被有效利用,造成嚴重的資源浪費和環(huán)境污染［6-8］。

酚酸類成分性質(zhì)極不穩(wěn)定,對熱敏感,在受熱情況下極易發(fā)生分解、氧化以及脫氫羥基反應(yīng),干燥時易造成酚酸類成分損失［9］。郭輝［10］采用不同干燥方式對丹參提取液進行干燥,發(fā)現(xiàn)冷凍干燥對丹參提取液中酚酸含有量的影響最小。陳立軍等［11］研究真空減壓干燥、噴霧干燥、微波干燥和冷凍干燥對丹參中酚酸含有量的影響,發(fā)現(xiàn)冷凍干燥能最大程度的保留丹參中酚酸類成分。沙秀秀［12］發(fā)現(xiàn)不同的干燥條件對丹參莖葉中酚酸類成分含有量影響較大,其中微波殺青-熱風(fēng)干燥的丹參莖葉品質(zhì)較優(yōu)。因此,選用合適的干燥方式對丹參莖葉中酚酸類成分的保留至關(guān)重要。目前關(guān)于干燥方式對丹參莖葉中酚酸類成分含有量及其抗氧化活性的影響鮮有報道。本研究通過探討不同干燥方式對丹參莖葉中總酚酸、丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素和咖啡酸含有量及其抗氧化活性的影響,以期篩選適合丹參莖葉的干燥方式,為丹參莖葉的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 丹酚酸B （批號MUST-18070503）、迷迭香酸 （批號MUST-18053110）、丹參素 （批號MUST-13030108）、咖啡酸（批號MUST-12042403）對照品均購自成都曼思特生物科技有限公司,純度均大于98%；乙腈（色譜純,美國J.T.Baker公司）；無水乙醇、甲醇（分析純,成都市科隆化學(xué)品有限公司）。

1.2 材料及干燥方法 丹參莖葉于2018年8月采自四川中江,經(jīng)四川農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院楊瑞武教授鑒定為唇形科鼠尾草屬植物丹參Salvia miltiorrhizaBge.的莖葉。將采集的丹參莖葉除去泥土,切成均勻小段,混勻后平均分為3份,分別進行自然陰干、真空冷凍干燥和恒溫鼓風(fēng)干燥,干燥至恒定質(zhì)量,粉碎,過50目篩,干燥保存?zhèn)溆谩Ｗ匀魂幐?將丹參莖葉置于室內(nèi)通風(fēng)處自然陰干；真空冷凍干燥,將經(jīng)預(yù)凍處理的丹參莖葉置于真空冷凍干燥機中；恒溫鼓風(fēng)干燥,將丹參莖葉置于鼓風(fēng)干燥箱內(nèi)烘干,溫度55 ℃。

1.3 丹參莖葉提取液制備 分別準確稱取不同干燥方式處理的丹參莖葉粉末0.5 g,置于具塞錐形瓶中,參照翟宏宇等［13］的方法提取丹參莖葉中的酚酸類成分。提取后過濾,取1 mL濾液,甲醇稀釋定容至25 mL,備用。

1.4 總酚酸含有量測定 參照文獻［14］,以沒食子酸為對照品,采用福林-酚比色法測定丹參莖葉中總酚酸含有量,以吸光值為縱坐標（Y）,以沒食子酸濃度為橫坐標（X）,進行回歸。

1.5 丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素、咖啡酸含有量測定

1.5.1 分析條件 參考文獻［2］,Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm,5 μm）；流動相乙腈（A）-0.05%磷酸水（B）；梯度洗脫（0～15 min,90%～80% B；15～35 min,80%～75% B；35～45 min,75%～70% B；45～55 min,70%～10%B；55～70 min,10% B）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長286 nm；進樣量10 μL。

1.5.2 對照品溶液制備 分別精密稱取對照品丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素和咖啡酸各5 mg,甲醇溶解后定容至 10 mL,制備成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的對照品貯備液。所有對照品溶液均在4 ℃條件下保存。

分別精密吸取上述丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素和咖啡酸對照品貯備液1.50、1.30、0.90、0.30 mL,甲醇定容至10 mL,搖勻,即得75 μg/mL丹酚酸B、65 μg/mL迷迭香酸、45 μg/mL丹參素、15 μg/mL咖啡酸的混合對照品溶液。

在“1.5.1” 項條件下測得丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素和咖啡酸的對照品在不同質(zhì)量濃度時的峰面積,以峰面積為縱坐標（Y）,質(zhì)量濃度為橫坐標（X）,進行回歸。

1.6 抗氧化活性測定

1.6.1 還原力 將不同干燥方式處理的丹參莖葉的提取液配成系列梯度質(zhì)量濃度溶液 （0～30 μg/mL）,采用鐵氰化鉀還原法［15］測定丹參莖葉的還原力。平行實驗3次,取其平均值。

1.6.2 DPPH自由基清除活性 將不同干燥方式處理的丹參莖葉的提取液配成系列梯度質(zhì)量濃度溶液（10～300 μg/mL）,參照Wang等［16］方法,測定丹參莖葉的DPPH自由基清除活性。平行實驗3次,取其平均值。按公式（1）計算：

式中,As為含樣品的溶液吸光值； Ao為水代替樣品的溶液吸光值。

1.6.3 超氧陰離子自由基清除活性 將不同干燥方式處理的丹參莖葉的提取液配成系列梯度質(zhì)量濃度溶液（0～60 μg/mL）,參照Lu等［17］方法測定丹參莖葉的超氧陰離子自由基清除活性。平行實驗3次,取其平均值。按公式（2）計算：

式中,A1為加入樣品溶液的吸光值； A0為水代替樣品混合溶液的吸光值； A2為未加鄰苯三酚的樣品溶液的吸光度。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析 采用Microsoft excel 2010和Origin 8.5軟件對數(shù)據(jù)處理,并繪制相應(yīng)的圖表；采用SPSS 23.0軟件對測定結(jié)果進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干燥方式對丹參莖葉中總酚酸含有量的影響

采用福林-酚比色法得到總酚酸的回歸方程為Y=0.285 1X-0.027 （ r=0.999 8）,在 500～5 500 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。用相同方法測定不同干燥方式處理后的丹參莖葉中總酚酸含有量。由表1可知,經(jīng)自然陰干、真空冷凍干燥和恒溫鼓風(fēng)干燥3種干燥方式處理的丹參莖葉中總酚酸含有量分別為107.63、112.12、87.95 mg/g；真空冷凍干燥的丹參莖葉中總酚酸含有量高于自然陰干（P＜0.05）,且極顯著恒溫鼓風(fēng)干燥（P＜0.01）。

表1 不同干燥方式處理后丹參莖葉總酚酸含有量Tab.1 Content of total phenolic acids in stems and leaves of S.miltiorrhizaafter different drying process

2.2 干燥方式對丹參莖葉中丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素和咖啡酸含有量的影響 采用HPLC法測定不同干燥方式處理后丹參莖葉中丹酚酸B、迷迭香酸、丹參素和咖啡酸的含有量,結(jié)果見圖1、表2～3。由表3可知,干燥方式對丹參莖葉中丹酚酸B含有量無顯著影響。經(jīng)3種干燥方式處理后丹參莖葉中迷迭香酸含有量存在統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.01）,真空冷凍干燥處理的丹參莖葉中迷迭香酸含有量最高（25.94 mg/g）；自然陰干次之（20.67 mg/g）；恒溫鼓風(fēng)干燥最低（15.06 mg/g）。真空冷凍干燥和恒溫鼓風(fēng)干燥對丹參莖葉中丹參素含有量無顯著影響,其含有量分別為0.70、0.68 mg/g,且均高于自然陰干（P＜0.05）。真空冷凍干燥的丹參莖葉中咖啡酸含有量高于其他2種干燥方式（P＜0.01）,達到0.69 mg/g,恒溫鼓風(fēng)干燥（0.39 mg/g）高于自然陰干（0.36 mg/g）（P＜0.05）。

圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

表3 不同干燥方式處理后丹參莖葉中酚酸類成分含有量（mg/g）Tab.3 Contents of phenolic acids in stems and leaves of Salvia miltiorrhizaafter different drying processes（mg/g）

2.3 干燥方式對丹參莖葉抗氧化活性的影響

2.3.1 還原力 經(jīng)不同干燥方式處理丹參莖葉后,測定吸光度,計算還原力,結(jié)果見圖2。由結(jié)果可知,丹參莖葉的還原力與提取液的濃度呈明顯的量效關(guān)系。當(dāng)提取液質(zhì)量濃度一致時,不同干燥方式處理的丹參莖葉的還原力大小依次為真空冷凍干燥、自然陰干、恒溫鼓風(fēng)干燥。

2.3.2 DPPH自由基清除能力 經(jīng)不同干燥方式處理丹參莖葉后,其DPPH自由基清除結(jié)果見圖3。由結(jié)果可知,經(jīng)不同干燥方式處理的丹參莖葉均具有較強的清除DPPH自由基能力。由曲線擬合所得,經(jīng)自然陰干、真空冷凍干燥和恒溫鼓風(fēng)干燥處理的丹參莖葉對DPPH自由基清除能力的IC50值分別為40、30、70 μg/mL,表明真空冷凍干燥處理的丹參莖葉清除DPPH自由基的能力最強,自然陰干次之,恒溫鼓風(fēng)干燥最弱。

圖3 不同干燥方式處理后丹參莖葉DPPH自由基清除能力Fig.3 DPPH free radical scavenging capacity of S.miltiorrhizastems and leaves after different drying processes

2.3.3 超氧陰離子自由基清除作用 不同干燥方式處理丹參莖葉后其清除超氧陰離子自由基,結(jié)果見圖4。由結(jié)果可知,丹參莖葉提取液濃度與超氧陰離子自由基清除率呈正相關(guān)。由曲線擬合所得,經(jīng)自然陰干、真空冷凍干燥和恒溫鼓風(fēng)干燥處理的丹參莖葉對超氧陰離子自由基清除能力的IC50值依次為28、25、30 μg/mL。丹參莖葉清除超氧陰離子自由基能力從強到弱依次為以真空冷凍干燥、自然陰干、恒溫鼓風(fēng)干燥。

圖4 不同干燥方式處理后丹參莖葉清除超氧陰離子自由基能力Fig.4 Scavenging capacity of superoxide anion free radicals in stems and leaves of S.miltiorrhizaafter different drying processes

3 討論

丹參莖葉常被當(dāng)做農(nóng)業(yè)廢棄物,但早在清代的《醫(yī)方守約》 中已有記載將其搗碎合酒糟可消腫?，F(xiàn)代研究表明丹參莖葉中含酚酸類成分,主要為丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B［4-5,18］。因此,研究丹參莖葉中酚酸類成分,不僅能提高對丹參莖葉的資源化利用,還能減少環(huán)境污染。但由于酚酸類成分不穩(wěn)定,在干燥過程中易受溫度、氧分壓等因素影響,發(fā)生氧化、分解使其含有量減少［19］。

不同干燥方式對藍莓葉［20］、甜菊葉［21］中酚酸類成分的影響,其研究結(jié)果均表明在干燥過程中溫度和氧分壓越低,越能有效的保留酚酸類成分。本研究發(fā)現(xiàn)真空冷凍干燥后丹參莖葉中總酚酸、迷迭香酸、丹參素和咖啡酸含有量均最高。可能是由于真空冷凍干燥是在低溫、真空狀態(tài)下,低溫使丹參莖葉中的酶失活,最大程度減少丹參莖葉中酚酸類成分的降解和酶促反應(yīng),能較好的保存丹參莖葉中該類成分［20］。而恒溫鼓風(fēng)干燥后丹參莖葉中總酚酸和迷迭香酸含有量均最低,但丹參素和咖啡酸含有量卻比自然陰干的丹參莖葉中高,可能是由于受熱條件下酚酸類成分可自身降解［22］,導(dǎo)致丹參莖葉中其含有量減少。已有研究表明迷迭香酸可由咖啡酸和丹參素等小分子酚酸聚合形成,而迷迭香酸也可分解為小分子酚酸［14,23］。因此,推測在恒溫鼓風(fēng)干燥時可能由于溫度較高致使迷迭香酸分解為咖啡酸和丹參素或其他小分子酚酸,使得恒溫鼓風(fēng)干燥的丹參莖葉中咖啡酸和丹參素含有量高于自然陰干的丹參莖葉。

本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)不同干燥方式處理后丹參莖葉抗氧化活性強弱存在一定差異,可能是因不同干燥方式對丹參莖葉中酚酸類成分的影響不同。大量研究結(jié)果表明,抗氧化活性與酚酸類成分含有量之間存在相關(guān)性［24-26］。如藍莓葉［20］和金銀花［22］提取物中酚酸類成分含有量反應(yīng)了其抗氧化活性的強弱,且經(jīng)真空冷凍干燥后藍莓葉和金銀花中酚酸類成分含有量最高,抗氧化活性也最強。本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)真空冷凍干燥后丹參莖葉的還原力、DPPH自由基清除能力和超氧陰離子清除能力均最強,迷迭香酸、丹參素和咖啡酸含有量均最高。恒溫鼓風(fēng)干燥處理與自然陰干處理相比,丹參莖葉中迷迭香酸含有量較低,丹參素和咖啡酸含有量均較高,但其抗氧化活性低于自然陰干,因此,可推測丹參莖葉的抗氧化活性與迷迭香酸含有量成正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),不同干燥方式對丹參莖葉中迷迭香酸含有量與抗氧化活性的影響趨勢基本一致。因此,推測丹參莖葉發(fā)揮抗氧化活性的物質(zhì)基礎(chǔ)主要為迷迭香酸。

4 結(jié)論

干燥方式對丹參莖葉中總酚酸、迷迭香酸、丹參素和咖啡酸含有量有一定影響,對丹酚酸B含有量無顯著影響。總酚酸、迷迭香酸、丹參素和咖啡酸含有量均以真空冷凍干燥后的丹參莖葉中最高。干燥方式對丹參莖葉抗氧化活性的影響由大到小依次為真空冷凍干燥、自然陰干、恒溫鼓風(fēng)干燥。綜上所述,真空冷凍干燥為最適合丹參莖葉的干燥方式。