張超 莫延敬

摘要：【目的】明確重慶市萬(wàn)州區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)斑點(diǎn)叉尾鮰暴發(fā)出血性敗血癥的病因，為實(shí)際生產(chǎn)中有效防控該病提供參考依據(jù)?！痉椒ā客ㄟ^(guò)常規(guī)的細(xì)菌分離純化、生理生化試驗(yàn)、16S rDNA序列和cpn60基因檢測(cè)、系統(tǒng)進(jìn)化分析及動(dòng)物回歸感染試驗(yàn)對(duì)病原菌進(jìn)行鑒定，并采用K-B藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行病原菌藥敏試驗(yàn)。【結(jié)果】從患病斑點(diǎn)叉尾鮰的肝臟、腎臟、脾臟和腦組織中分離獲得1株優(yōu)勢(shì)菌（WZ1906），革蘭氏染色呈陰性，短桿狀，兩端鈍圓;其菌落表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，直徑大小為1～2 mm，呈灰白色至淺黃色;有運(yùn)動(dòng)性，氧化酶反應(yīng)、V-P反應(yīng)、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)均呈陽(yáng)性，能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖，能水解明膠和七葉靈，產(chǎn)生吲哚。WZ1906菌株16S rDNA序列和cpn60基因的核苷酸序列均與嗜水氣單胞菌相關(guān)基因的核苷酸序列高度同源，其相似性達(dá)100%;從基于16S rDNA序列和cpn60基因核苷酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)也可看出，WZ1906菌株與嗜水氣單胞菌聚為一支。以WZ1906菌株回歸感染的斑點(diǎn)叉尾鮰均發(fā)病死亡，其體表和鰭條基部出血，肝臟、腎臟和脾臟腫大充血，腸道出血，與自然發(fā)病斑點(diǎn)叉尾鮰的癥狀相似，但未觀察到明顯的腸套疊癥狀。WZ1906菌株對(duì)苯唑西林、大觀霉素、克拉霉素、氯霉素、四環(huán)素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、多粘菌素B、復(fù)方新諾明及呋喃妥因等28種藥物敏感，對(duì)青霉素G、氨芐西林和頭孢噻吩已產(chǎn)生耐藥性（不敏感）。【結(jié)論】引起重慶市萬(wàn)州區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)斑點(diǎn)叉尾鮰出血性敗血癥的病原菌是嗜水氣單胞菌，可選用恩諾沙星、氟苯尼考或復(fù)方新諾明等水產(chǎn)類(lèi)常用抗菌藥物進(jìn)行防治。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)定期對(duì)養(yǎng)殖水體進(jìn)行養(yǎng)護(hù)，科學(xué)投喂，從根本上預(yù)防斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊的發(fā)生，降低其防治難度。

關(guān)鍵詞： 斑點(diǎn)叉尾鮰;嗜水氣單胞菌;出血性敗血癥;腸套疊;16S rDNA序列;cpn60基因

中圖分類(lèi)號(hào)： S941.429? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）09-2287-09

Identification and drug sensitivity test of the pathogen of channel catfish manifested as hemorrhagic sepsis

ZHANG Chao， MO Yan-jing

（Chongqing Three Gorges Vocational College， Wanzhou， Chongqing? 404155， China）

Abstract：【Objective】The research was conducted to clarify the etiology of hemorrhagic sepsis of channel catfish in a farm in Wanzhou， Chongqing， and provide reference for the prevention and treatment of the disease in production.【Method】The pathogenic bacteria were identified through routine bacterial isolation and purification， physiological and biochemical tests， 16S rDNA sequence and cpn60 gene detection， phylogenetic analysis and animal regression infection test. The K-B drug susceptibility disc diffusion method was used to carry out the drug susceptibility test of the pathogen. 【Result】One dominant strain（WZ1906） was isolated from the brain， liver， kidney and spleen of the diseased channel catfish. The isolate was Gram-negative， rod-shaped， both ends were obtuse; the surface of the colony was smooth and moist， with smooth edges， with a diameter of 1-2 mm， off-white to light yellow. The bacteria were motile. Oxidase reaction， V-P reaction and arginine double hydrolase test were positive， the glucose， sucrose， maltose， and lactose could be fermented， gelatin and esculin could be hydrolyzed， indole test was positive. 16S rDNA and cpn60 gene sequencing results had the highest homology with Aeromonas hydrophila， up to 100%. It could also be found that the WZ1906 strain and A. hydrophila clustered together from phylogenetic trees constructed based on the similarity of the 16S rDNA and cpn60 gene sequence. The channel catfish with recurrent infections all fell onset and died. The body surface and the base of the fin rays were congested， the liver and kidneys were enlarged and congested， and the intestinal bleeding. The symptoms were similar to those of the naturally occurring diseased channel catfish， but no obvious symptoms of intussusception were observed. The results of drug susceptibility test showed that the bacteria were sensitive to 28 drugs such as oxacillin， spectinomycin， clarithromycin， chloramphenicol， tetracycline， norfloxacin， ciprofloxacin， polymyxin， enrofloxa-cin， compound trimethoprim and nitrofurantoin， but not sensitive to penicillin G， ampicillin and cefotaxime. 【Conclusion】The pathogen causing channel catfish hemorrhagic sepsis in a farm in Wanzhou， Chongqing is A. hydrophila. Commonly used aquatic antibiotics such as enrofloxacin， florfenicol and compound trimethoprim can be used for prevention and treatment of disease. In the actual production process， the aquaculture water body should be maintained regularly and the fish should be fed scientifically to fundamentally prevent the occurrence of channel catfish intussusception and reduce the difficulty of disease prevention.

Key words： Ictalurus punctatus; Aeromonas hydrophila; hemorrhagic sepsis; intussusception; 16S rDNA sequence; cpn60 gene

Foundation item：National Natural Science Foundation of China（31602201）;Science and Technology Research Project of Chongqing Municipal Education Commission（KJQN201903506）

0 引言

【研究意義】斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）又稱(chēng)溝鯰（Channel catfish），是一種原產(chǎn)于北美洲的大型淡水魚(yú)，隸屬于鯰形目（Siluriformes）鮰科（Ictaluri-dae），因具有適應(yīng)性廣、食性雜、抗病力強(qiáng)、生長(zhǎng)快及肉質(zhì)鮮美等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國(guó)主要的名特優(yōu)水產(chǎn)品之一（李林等，2012;嚴(yán)朝暉等，2013）。但隨著集約化養(yǎng)殖水平的不斷提高，各種病害頻繁發(fā)生，不僅制約斑點(diǎn)叉尾鮰的健康養(yǎng)殖，還給養(yǎng)殖戶(hù)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失（韋昌用等，2014;劉韜等，2016;楊移斌等，2017）。因此，分離鑒定病原微生物并采取有效的防控措施對(duì)保障斑點(diǎn)叉尾鮰產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。【前人研究進(jìn)展】近年來(lái)，從斑點(diǎn)叉尾鮰上分離獲得的細(xì)菌病原有嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydro-phila）（周碧君等，2004;童桂香等，2009）、嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas maltophilia）（耿毅等，2006;汪開(kāi)毓等，2006）、愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella ictaluri）（梁萬(wàn)文等，2007）、柱狀黃桿菌（F1avobacterium columnare）（劉禮輝等，2008）、魯氏耶爾森菌（Yersinia ruckeri）（范方玲等，2010）、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）（顧澤茂等，2010）、溫和氣單胞菌（A. sobria）（韋昌用等，2014;楊移斌等，2017）和維氏氣單胞菌（A. veronii）（劉韜等，2016;田浪等，2018）。其中，鮑曼不動(dòng)桿菌病主要表現(xiàn)為肝臟發(fā)白;愛(ài)德華氏菌病的典型癥狀為頂骨出現(xiàn)裂縫;魯氏耶爾森菌病的典型特征為鰾出血;柱狀黃桿菌感染主要引起鰓組織腐爛;嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌及其他氣單胞菌屬病原菌感染的主要癥狀為全身廣泛性出血。從臨床癥狀來(lái)說(shuō)，除鮑曼不動(dòng)桿菌外，其他各類(lèi)病原均能引起斑點(diǎn)叉尾鮰不同程度的出血癥狀，且常伴有腸套疊現(xiàn)象，給疾病治療帶來(lái)極大困難。2009年美國(guó)阿拉巴馬州西部和密西西比州東部養(yǎng)殖的斑點(diǎn)叉尾鮰發(fā)生大面嗜水氣單胞菌原發(fā)性感染，造成數(shù)千噸的商品魚(yú)死亡（Jubirt et al.，2015;Zhang et al.，2016a）。此外，李艷和等（2010）從患病斑點(diǎn)叉尾鮰中分離獲得5株病原菌[3株嗜水氣單胞菌和2株豚鼠氣單胞菌（A. caviae）];Mohammed和Peatman（2018）研究發(fā)現(xiàn)副乳鏈球菌（Streptococcus parauberis）、腐敗希瓦氏菌（Shewanella putrefaciens）和維氏氣單胞菌混合感染斑點(diǎn)叉尾鮰的現(xiàn)象。可見(jiàn)，2種或2種以上病原菌混合感染在斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖中較普遍，對(duì)其病害診治和防控提出了新挑戰(zhàn)，在生產(chǎn)實(shí)踐中應(yīng)引起高度重視。針對(duì)魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性疾病，目前生產(chǎn)上主要采用外用消毒劑結(jié)合內(nèi)服抗菌藥物的方法進(jìn)行治療，而預(yù)防此類(lèi)疾病的根本措施是保持良好的水質(zhì)環(huán)境?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】出血性敗血癥是近年來(lái)斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖過(guò)程中的常見(jiàn)病害，其主要癥狀表現(xiàn)為全身廣泛性出血，并發(fā)腸套疊，但不同地區(qū)的病原分離鑒定結(jié)果差異明顯。2019年6—7月重慶市萬(wàn)州區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)的斑點(diǎn)叉尾鮰在雨后出現(xiàn)大量死亡，臨床癥狀表現(xiàn)為頭部和鰭基部出血，內(nèi)臟廣泛性出血，伴有嚴(yán)重的腸套疊現(xiàn)象，為典型的細(xì)菌性感染;病魚(yú)平均體重85.0 g/尾，7日內(nèi)死亡量從開(kāi)始的2～3尾劇增至200多尾，病程持續(xù)1個(gè)多月，累積死亡率為30%～40%，與已報(bào)道斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)菌性疾病的癥狀和病程（蔡焰值等，2010;Zhang et al.，2016b;Abdelhamed et al.，2017;Baumgartner et al.，2017）存在差異，因此有必要進(jìn)一步明確其發(fā)病原因并科學(xué)用藥治療?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】對(duì)重慶市萬(wàn)州某養(yǎng)殖場(chǎng)患出血性敗血癥的斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)，旨在查找出斑點(diǎn)叉尾鮰的發(fā)病原因，為實(shí)際生產(chǎn)中有效防控該病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

患病斑點(diǎn)叉尾鮰取自重慶市萬(wàn)州區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng);健康斑點(diǎn)叉尾鮰購(gòu)自當(dāng)?shù)厮a(chǎn)品市場(chǎng)，暫養(yǎng)7 d后，隨機(jī)挑選健康斑點(diǎn)叉尾鮰進(jìn)行回歸感染試驗(yàn)。普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染色液、藥敏檢測(cè)試劑盒及細(xì)菌微量生化鑒定管等購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA回收試劑盒和DNA Marker購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1. 2 病原菌分離純化

無(wú)菌操作下挑取典型癥狀病魚(yú)的肝臟、腎臟、脾臟和腦組織，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)24～48 h，挑選形態(tài)大小一致的優(yōu)勢(shì)菌落，重復(fù)劃線傳代2～3次純化培養(yǎng)。純化后的菌落轉(zhuǎn)移至普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫钜票蟮龋?017）。

1. 3 病原菌形態(tài)特征觀察及其生理生化特性鑒定

參照革蘭氏染色說(shuō)明進(jìn)行染色，光學(xué)顯微鏡下觀察病原菌的形態(tài)特征。同時(shí)，參照細(xì)菌生化微量鑒定管說(shuō)明和《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》（東秀珠和蔡妙英，2001）對(duì)病原菌進(jìn)行生理生化特性鑒定。

1. 4 16S rDNA和cpn60基因序列分析

使用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取待檢菌株的DNA。16S rDNA序列擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)參照Ucko等（2002）、石存斌等（2009）的方法，上游引物為5'-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3'，下游引物為5'-AAG GAGGTGATCCAGCCGCA-3'。PCR反應(yīng)體系50.0 μL：10×PCR緩沖液5.0 μL，MgCl2（25 mmol/L）5.0 μL，dNTP（10 mmol/L）0.8 μL，上、下游引物（20 μmol/L）各0.5 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）1.2 μL，DNA模板5.0 μL，無(wú)菌雙蒸水補(bǔ)足至50.0 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性10 min;94 ℃ 1 min，56 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，進(jìn)行30個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。cpn60基因擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)參照Mi?ana-Galbis等（2009）的方法，上游引物為5'-GAAATYGAACTG GAAGACAA-3'，下游引物為5'-GTYGCTTTTTCC AGCTCCA-3';PCR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序同16S rDNA序列。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，膠回收后克隆至T載體上，并挑選陽(yáng)性質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果與GenBank已公布的參考序列進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，利用ClustalX 1.81進(jìn)行多重序列匹配和聚類(lèi)分析，并以MEGA 4.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

1. 5 回歸感染試驗(yàn)

選取60尾健康斑點(diǎn)叉尾鮰（平均體重85.0 g/尾）隨機(jī)分為4組（2組為攻毒組，2組為對(duì)照組）。調(diào)整菌懸液濃度至1.0×108 CFU/mL，攻毒組每尾斑點(diǎn)叉尾鮰胸鰭基部注射0.2 mL菌懸液，對(duì)照組則注射等量生理鹽水。攻毒后將試驗(yàn)魚(yú)置于水溫25～30 ℃的養(yǎng)殖箱中飼養(yǎng)，每天觀察并記錄其發(fā)病及死亡情況，持續(xù)觀察2周。同時(shí)對(duì)瀕臨死亡或已死亡試驗(yàn)魚(yú)再次進(jìn)行剖檢和病原菌分離鑒定。

1. 6 藥敏試驗(yàn)

采用K-B藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行病原菌藥敏試驗(yàn)。取1.0×108 CFU/mL菌懸液0.2 mL均勻涂布于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，等距離貼上不同藥物的藥敏紙片，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)24 h后觀察并記錄抑菌圈直徑，根據(jù)藥敏紙片說(shuō)明判定其敏感性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 自然發(fā)病特點(diǎn)及臨床癥狀

重慶市萬(wàn)州某養(yǎng)殖場(chǎng)的斑點(diǎn)叉尾鮰在雨后發(fā)病，發(fā)病時(shí)池塘平均水溫30 ℃，7日內(nèi)的發(fā)病死亡量從開(kāi)始的2～3尾劇增至200多尾，病程持續(xù)1個(gè)多月，累積死亡率為30%～40%。臨床癥狀：病魚(yú)的頭部、口腔和胸鰭基部出血，眼球突出（圖1-A）;剖檢可見(jiàn)肝臟暗紅，腎臟和腸道充血，脾臟腫大呈醬黑色，腸壁稀薄，腸套疊嚴(yán)重（圖1-B），呈典型的敗血癥癥狀。

2. 2 病原菌的形態(tài)特征

從患病斑點(diǎn)叉尾鮰的肝臟、腎臟、脾臟和腦組織中均能分離到菌落形態(tài)特征一致的單一株菌，命名為WZ1906。其菌落呈圓形，灰白色至淺黃色，表面光滑濕潤(rùn)，邊緣整齊，直徑大小為1～2 mm（圖2）。革蘭氏染色呈陰性，短桿狀，兩端鈍圓，為單個(gè)或成對(duì)排列，無(wú)芽孢和莢膜（圖3）。

2. 3 病原菌的生理生化特性

由表1可知，WZ1906菌株具運(yùn)動(dòng)性，其氧化酶反應(yīng)、V-P反應(yīng)、精氨酸雙水解酶試驗(yàn)均呈陽(yáng)性，能發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖，能水解明膠和七葉靈，產(chǎn)生吲哚。WZ1906菌株的生理生化特性與嗜水氣單胞菌TE090214株（童桂香等，2009）和AHIA04株（李艷和等，2010）相似。

2. 4 16S rDNA和cpn60基因序列分析結(jié)果

16S rDNA序列和cpn60基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，分別得到約1500和750 bp的清晰目的條帶（圖4），與預(yù)期結(jié)果相符。獲得的序列經(jīng)BLAST比對(duì)分析，結(jié)果顯示，16S rDNA序列和cpn60基因的核苷酸序列均與嗜水氣單胞菌相關(guān)基因的核苷酸序列高度同源，其相似性達(dá)100%。從基于16S rDNA序列和cpn60基因核苷酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖5和圖6）均可看出，WZ1906菌株與嗜水氣單胞菌聚為一支。

2. 5 回歸感染試驗(yàn)結(jié)果

攻毒組斑點(diǎn)叉尾鮰在人工攻毒感染2 d后，出現(xiàn)活力下降、游動(dòng)無(wú)力現(xiàn)象，其體表和鰭條基部出血（圖7-A），5 d內(nèi)的累計(jì)發(fā)病魚(yú)占攻毒總數(shù)的90%，而注射無(wú)菌生理鹽水的對(duì)照組斑點(diǎn)叉尾鮰未見(jiàn)任何異常（表2）。剖檢發(fā)病死亡斑點(diǎn)叉尾鮰可見(jiàn)肝臟、腎臟和脾臟腫大充血，腸道出血（圖7-B），與自然發(fā)病斑點(diǎn)叉尾鮰的癥狀相似，但未觀察到明顯的腸套疊癥狀。再次分離獲得的菌株與WZ1906菌株的形態(tài)特征、生理生化特性及16S rDNA和cpn60基因序列分析結(jié)果一致，說(shuō)明WZ1906菌株即為斑點(diǎn)叉尾鮰出血性敗血癥的致病菌。

2. 6 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

35種抗菌藥物的敏感試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，WZ1906菌株對(duì)苯唑西林、大觀霉素、克拉霉素、氯霉素、四環(huán)素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、多粘菌素B、復(fù)方新諾明及呋喃妥因等28種藥物敏感，對(duì)青霉素G、氨芐西林和頭孢噻吩已產(chǎn)生耐藥性（不敏感）。

3 討論

I型伴侶蛋白cpn60為高度保守蛋白，近年來(lái)常用于物種系統(tǒng)進(jìn)化分析及種間鑒定。已有研究表明，采用cpn60基因序列對(duì)氣單胞菌屬細(xì)菌的鑒定效率明顯高于16S rDNA序列（Hill et al.，2004;Mi?ana-Galbis et al.，2009;Guo et al.，2016;Navarro and Martíne-Murcia，2018）。本研究對(duì)分離自患出血性敗血癥斑點(diǎn)叉尾鮰的WZ1906菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，分別擴(kuò)增其16S rDNA序列和cpn60基因，經(jīng)BLAST比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)16S rDNA序列和cpn60基因的核苷酸序列均與嗜水氣單胞菌相關(guān)基因的核苷酸序列高度同源，其相似性達(dá)100%。從基于16S rDNA序列和cpn60基因核苷酸序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)也可看出，WZ1906菌株與嗜水氣單胞菌聚為一支。綜合WZ1906菌株的形態(tài)特征、生理生化特性及回歸感染試驗(yàn)結(jié)果，可確定嗜水氣單胞菌即為斑點(diǎn)叉尾鮰出血性敗血癥的致病菌。

嗜水氣單胞菌在自然界的分布十分廣泛，隸屬于弧菌科（Vibrionaceae）氣單胞菌屬（Aeromonas），為典型的條件致病菌，且多為繼發(fā)感染，是淡水魚(yú)類(lèi)細(xì)菌性敗血癥的主要病原，幾乎能侵染所有的淡水魚(yú)類(lèi)，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失（Ardó et al.，2010;王權(quán)和朱光來(lái)，2012;Zhang et al.，2016a）。此外，從各地患出血癥斑點(diǎn)叉尾鮰檢測(cè)出的致病菌存在明顯差異。在貴州烏江（周碧君等，2004）和廣西天峨（童桂香等，2009）檢測(cè)出的致病菌為嗜水氣單胞菌;在四川成都檢測(cè)出的致病菌為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌（耿毅等，2006）;在廣西龍州（韋昌用等，2014）、湖北仙桃（楊移斌等，2017）和貴州羅甸（田浪等，2018）等地檢測(cè)出的致病菌為溫和氣單胞菌;在河南中牟檢測(cè)出的致病菌為維氏氣單胞菌（劉韜等，2016）;在湖北省宜都和長(zhǎng)陽(yáng)檢測(cè)出愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌混合感染（劉堂水等，2006）;在安徽富煌則發(fā)現(xiàn)是嗜水氣單胞菌和豚鼠氣單胞菌混合感染（李艷和等，2010）。本研究從重慶市萬(wàn)州某養(yǎng)殖場(chǎng)患出血性敗血癥的斑點(diǎn)叉尾鮰中分離獲得嗜水氣單胞菌，結(jié)合貴州烏江（周碧君等，2004）和廣西天峨（童桂香等，2009）兩地斑點(diǎn)叉尾鮰的發(fā)病時(shí)間（2—3月），推測(cè)本病例是投喂量變化引起的繼發(fā)感染，而美國(guó)斑點(diǎn)叉尾鮰暴發(fā)的嗜水氣單胞菌病為原發(fā)性感染（Zhang et al.，2016a）。可見(jiàn)，不同養(yǎng)殖模式下斑點(diǎn)叉尾鮰對(duì)氣單胞菌屬的致病菌均具有易感性，但不同地區(qū)的病原流行種類(lèi)及其他流行病學(xué)存在明顯差異。

本研究的藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，分離自患出血性敗血癥斑點(diǎn)叉尾鮰的嗜水氣單胞菌對(duì)頭孢哌酮、卡那霉素、氧氟沙星、恩諾沙星、諾氟沙星及復(fù)方新諾明等藥物敏感，與周碧君等（2004）、童桂香等（2009）、李艷和等（2010）的研究結(jié)論基本相同。童桂香等（2009）研究發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)叉尾鮰嗜水氣單胞菌對(duì)氨芐青霉素、頭孢唑林、頭孢拉定、慶大霉素、土霉素、四環(huán)素和氟苯尼考已產(chǎn)生耐藥性;李艷和等（2010）研究表明斑點(diǎn)叉尾鮰嗜水氣單胞菌對(duì)青霉素、氨芐青霉素、慶大霉素、卡那霉素、頭孢膚肟、四環(huán)素、先鋒霉素V和先鋒霉素VI等藥物不敏感（耐藥）。在本研究中，斑點(diǎn)叉尾鮰嗜水氣單胞菌對(duì)大多數(shù)抗菌藥物敏感，僅對(duì)青霉素G、氨芐西林和頭孢噻吩具有耐藥性，究其原因可能是菌株區(qū)域性差異所致（陳言峰等，2014）。2019年9月農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布了最新的《水產(chǎn)養(yǎng)殖用藥明白紙》，僅有12種抗菌藥物可用于食用水生動(dòng)物的養(yǎng)殖生產(chǎn)，即氟苯尼考、甲砜霉素粉、恩諾沙星粉、氟甲喹粉、硫酸新霉素粉、鹽酸多西環(huán)素粉、維生素C磷酸酯鎂、鹽酸環(huán)丙沙星預(yù)混劑、復(fù)方磺胺二甲嘧啶粉、復(fù)方磺胺甲噁唑粉、復(fù)方磺胺嘧啶粉和磺胺間甲氧嘧啶鈉粉;而氯霉素、克拉霉素、萬(wàn)古霉素、克林霉素、諾氟沙星、氧氟沙星、呋喃妥因、呋喃唑酮、利福霉素、頭孢唑啉、頭孢噻吩、頭孢哌酮、頭孢噻肟及頭孢曲松等藥物在水生食品動(dòng)物中已禁止使用。因此，斑點(diǎn)叉尾鮰嗜水氣單胞菌的臨床防治宜選用氟苯尼考、恩諾沙星或復(fù)方磺胺甲噁唑粉等藥物。

在實(shí)際生產(chǎn)中，養(yǎng)殖品種單一、池塘負(fù)載過(guò)高、水質(zhì)惡化及飼料營(yíng)養(yǎng)配比不合理等均是造成疾病頻發(fā)的主要因素（陳昌福，2007;安樹(shù)偉等，2019）。單純的嗜水氣單胞菌感染防治并不困難，但并發(fā)或繼發(fā)嚴(yán)重腸套疊時(shí)給治療帶來(lái)極大挑戰(zhàn)。在本研究中，自然發(fā)病斑點(diǎn)叉尾鮰的典型特征為嗜水氣單胞菌感染并發(fā)腸套疊癥狀，但回歸感染的斑點(diǎn)叉尾鮰并未出現(xiàn)與自然發(fā)病相似的腸套疊癥狀，與童桂香等（2009）的研究結(jié)果相似。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道及臨床案例分析，推測(cè)魚(yú)類(lèi)腸套疊癥狀是魚(yú)類(lèi)體質(zhì)、飼料、養(yǎng)殖環(huán)境及病害等綜合因素影響的結(jié)果，因此，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)定期對(duì)養(yǎng)殖水體進(jìn)行養(yǎng)護(hù)，科學(xué)投喂，從根本上預(yù)防魚(yú)類(lèi)腸套疊的發(fā)生。

4 結(jié)論

引起重慶市萬(wàn)州區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)斑點(diǎn)叉尾鮰出血性敗血癥的病原菌是嗜水氣單胞菌，可選用恩諾沙星、氟苯尼考或復(fù)方新諾明等水產(chǎn)類(lèi)常用抗菌藥物進(jìn)行防治。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中應(yīng)定期對(duì)養(yǎng)殖水體進(jìn)行養(yǎng)護(hù)，科學(xué)投喂，從根本上預(yù)防斑點(diǎn)叉尾鮰腸套疊的發(fā)生，降低其疾病防治難度。

參考文獻(xiàn)：

安樹(shù)偉，顧玲玲，周建忠，沈偉芳. 2019. 池塘工業(yè)化生態(tài)養(yǎng)殖斑點(diǎn)叉尾鮰病害分析及對(duì)策[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚(yú)，（9）：46-47. [An S W，Gu L L，Zhou J Z，Shen W F. 2019. Analysis and countermeasures of diseased eco-cultured channel catfish disease in ponds[J]. Scientific Fish Farming，（9）：46-47.]

蔡焰值，雷曉中，汪亮，陳紅連，張娟，王紅葉. 2010. 斑點(diǎn)叉尾鮰重要疾病發(fā)病原因及預(yù)防措施[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，49（11）：2867-2872. [Cai Y Z，Lei X Z，Wang L，Chen H L，Zhang J，Wang H Y. 2010. Causes and prevention measures of the channel catfish main disease[J]. Hubei Agricultural Sciences，49（11）：2867-2872.]

陳昌福. 2007. 關(guān)于我國(guó)斑點(diǎn)叉尾鮰養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的思考[J]. 漁業(yè)致富指南，（11）：18-19. [Chen C F. 2007. Thoughts on the development of the channel catfish breeding industry in China[J]. Fishery Guide to be Rich，（11）：18-19.]

陳言峰，周愛(ài)國(guó)，陳冠鋒，陳建酬，張繼平，張輝華. 2014. 養(yǎng)殖雜交鱧遲緩愛(ài)德華菌的分離鑒定[J]. 南方水產(chǎn)科學(xué)，10（5）：1-7. [Chen Y F，Zhou A G，Chen G F，Chen J C，Zhang J P，Zhang H H. 2014. Isolation of Edwardsiella tarda from cultured hybrid snakehead（Channa maculata ♀×C. argus ♂） and its identification[J]. South China Fishe-ries Science，10（5）：1-7.]

東秀珠，蔡妙英. 2001. 常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)[M]. 北京：科學(xué)出版社：114-116. [Dong X Z，Cai M Y. 2001. Handbook of identification of common bacterial systems[M]. Beijing：Science Press：114-116.]

范方玲，汪開(kāi)毓，耿毅，黃小麗，陳德芳. 2010. 斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus）源魯氏耶爾森氏菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 海洋與湖沼，41（6）：862-868. [Fan F L，Wang K Y，Geng Y，Huang X L，Chen D F. 2010. Isolation，identification and phylogenetic analysis of Yersinia ruckeri in channel catfish Ictalunes punctatus[J]. Oceano-logia et Limnologia Sinica，41（6）：862-868.]

耿毅，汪開(kāi)毓，陳德芳，黃小麗. 2006. 斑點(diǎn)叉尾鮰一株致病菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J]. 微生物學(xué)報(bào)，46（4）：649-652. [Geng Y，Wang K Y，Chen D F，Huang X L. 2006. Isolation，identification and phylogenetic analysis of a pathogenic bacterium of channel catfish[J]. Acta Microbiologica Sinica，46（4）：649-652.]

顧澤茂，柳陽(yáng)，陳昌福，朱健，謝駿，徐跑. 2010. 鮑曼不動(dòng)桿菌斑點(diǎn)叉尾鮰株的分離與鑒定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，29（4）：489-493. [Gu Z M，Liu Y，Chen C F，Zhu J，Xie J，Xu P. 2010. Isolation and identification of Acinetobacter baumannii from the diseased channel catfish[J]. Journal of Huazhong Agricultural University，29（4）：489-493.]

李林，嚴(yán)朝暉，肖友紅. 2012. 斑點(diǎn)叉尾鮰國(guó)內(nèi)市場(chǎng)現(xiàn)狀及產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景淺析[J]. 中國(guó)水產(chǎn)，（9）：35-36. [Li L，Yan Z H，Xiao Y H. 2012. Analysis of the current domestic market situation and industrial development prospects of channel catfish[J]. China Fisheries，（9）：35-36.]

李艷和，楊克禮，佘磊，徐滌平，王永杰. 2010. 斑點(diǎn)叉尾鮰氣單胞菌的分離與鑒定[J]. 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），27（2）：150-153. [Li Y H，Yang K L，She L，Xu D P，Wang Y J. 2010. Isolation and identification of Aeromonas from channel catfish（Ictalurus punctatus）[J]. Journal of Qingdao Agricultural University（Natural Science），27（2）：150-153.]

梁萬(wàn)文，陳明，余曉麗，李莉萍，雷愛(ài)瑩，陳漢忠，徐增輝，甘西，黃維義. 2007. 斑點(diǎn)叉尾鮰腸敗血癥病原菌的分離與鑒定[J]. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，20（5）：1124-1129. [Liang W W，Chen M，Yu X L，Li L P，Lei A Y，Chen H Z，Xu Z H，Gan X，Huang W Y. 2007. Isolation and identification of causative pathogen from enteric septicemia of catfish （ESC）[J]. Southwest China Journal of Agricultural Scien-ces，20（5）：1124-1129.]

劉禮輝，李寧求，石存斌，潘厚軍，付小哲，吳淑勤. 2008. 斑點(diǎn)叉尾鮰爛鰓病病原柱狀黃桿菌的分離及鑒定[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，36（17）：7124-7126. [Liu L H，Li N Q，Shi C B，Pan H J，F(xiàn)u X Z，Wu S Q. 2008. Isolation and classification of pathogenic bacterium caused by gill-rot disease in channel catfish（Ictalurus punctatus）[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，36（17）：7124-7126.]

劉堂水，汪成竹，陳昌福. 2006. 斑點(diǎn)叉尾鮰細(xì)菌性病原的分離與鑒定[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，25（5）：550-554. [Liu T S，Wang C Z，Chen C F. 2006. Isolation and identification of pathogenic bacteria from channel catfish，Ictalurus punctatus[J]. Journal of Huazhong Agricultural Univer-sity，25（5）：550-554.]

劉韜，王二龍，汪開(kāi)毓，朱琳，何潔，段靖，李亞軍，賀揚(yáng). 2016. 河南中牟地區(qū)斑點(diǎn)叉尾鮰突發(fā)性敗血癥病原分離及鑒定[J]. 中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，38（1）：53-57. [Liu T，Wang E L，Wang K Y，Zhu L，He J，Duan J，Li Y J，He Y. 2016. Isolation and identification of pathogenic Aeromo-nas veronii from Ictalurus punctatus[J]. Chinese Journal of Preventive Veterinary Medicine，38（1）：53-57.]

石存斌，潘厚軍，常藕琴，付小哲，段圣和，梁裕昕，吳淑勤. 2009. 養(yǎng)殖烏鱧結(jié)節(jié)病的病原分析[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，37（16）：7384-7386. [Shi C B，Pan H J，Chang O Q，F(xiàn)u X Z，Duan S H，Liang Y X，Wu S Q. 2009. Pathogen analysis on the sarcoidosis in cultured Ophiocephalus argus[J]. Journal of Anhui Agricultural Sciences，37（16）：7384-7386.]

田浪，溫貴蘭，張升波，楊佰啟，李昌紅，徐麗，林漢卿，管?chē)?guó)丹. 2018. 斑點(diǎn)叉尾鮰源致病性維氏氣單胞菌的分離與生物學(xué)特性鑒定[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，45（11）：3203-3210. [Tian L，Wen G L，Zhang S B，Yang B Q，Li C H，Xu L，Lin H Q，Guan G D. 2018. Isolation and biological charac-terization of pathogenic Aeromonas veronii from Icta-lurus punctatus[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine，45（11）：3203-3210.]

童桂香，黎小正，韋信賢，吳祥慶，盧小花. 2009. 斑點(diǎn)叉尾鮰套腸癥的病原鑒定及其藥敏特性[J]. 大連水產(chǎn)學(xué)院學(xué)報(bào)，24（6）：475-481. [Tong G X，Li X Z，Wei X X，Wu X Q，Lu X H. 2009. Identification and antibiotic sensitivity of pathogen of intussusception disease found in channel catfish Ictalurus punctatus[J]. Journal of Dalian Fishe-ries University，24（6）：475-481.]

汪開(kāi)毓，耿毅，黃小麗，陳德芳. 2006. 斑點(diǎn)叉尾鮰Ictalurus punctatus（Rifinesque）傳染性套腸癥（Infectious intussusception）[J]. 現(xiàn)代漁業(yè)信息，21（9）：3-8. [Wang K Y，Geng Y，Huang X L，Chen D F. 2006. Infectious intussusception of channel catfish（IICC）[J]. Modern Fisheries Information，21（9）：3-8.]

王權(quán)，朱光來(lái). 2012. 水產(chǎn)動(dòng)物疾病防治[M]. 北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社：72-73. [Wang Q，Zhu G L. 2012. Prevention and control of aquatic animal diseases[M]. Beijing：China Agriculture Press：72-73.]

韋昌用，彭亞，劉杰，胡大勝，黃艷華，米強(qiáng)，梁靜真，黃鈞. 2014. 斑點(diǎn)叉尾鮰腹水病病原菌分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，45（5）：875-881. [Wei C Y，Peng Y，Liu J，Hu D S，Huang Y H，Mi Q，Liang J Z，Huang J. 2014. Isolation and identification of ascites disease pathogen from channel catfish and its drug sensitivity test[J]. Journal of Southern Agriculture，45（5）：875-881.]

嚴(yán)朝暉，肖友紅，李林. 2013. 世界鲇魚(yú)產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀及對(duì)我國(guó)斑點(diǎn)叉尾鮰產(chǎn)業(yè)市場(chǎng)定位的重新認(rèn)識(shí)[J]. 中國(guó)水產(chǎn)，（6）：36-40. [Yan Z H，Xiao Y H，Li L. 2013. The current status of the worlds catfish industry and a new understan-ding of the market positioning of Chinas channel catfish industry[J]. China Fisheries，（6）：36-40.]

楊移斌，胥寧，董靖，楊秋紅，劉永濤，艾曉輝. 2017. 斑點(diǎn)叉尾鮰病原中溫和氣單胞菌的分離鑒定及藥敏特性分析[J]. 中國(guó)漁業(yè)質(zhì)量與標(biāo)準(zhǔn)，7（4）：45-50. [Yang Y B，Xu N，Dong J，Yang Q H，Liu Y T，Ai X H. 2017. Isolation and identification of Aeromonas sobria from Ictalunes punctatus and its antimicrobial susceptibility[J]. Chinese Fishery Quality and Standards，7（4）：45-50.]

周碧君，李永明，溫貴蘭，胡遠(yuǎn)洲. 2004. 斑點(diǎn)叉尾鮰致病性嗜水氣單胞菌的分離[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，23（12）：9-12. [Zhou B J，Li Y M，Wen G L，Hu Y Z. 2004. The identification and isolation of a pathoge Aeromonas hydrophila from channel catfish[J]. Fisheries Science，23（12）：9-12].

Abdelhamed H，Ibrahim I，Baumgartner W，Lawrence M L，Karsi A. 2017. Characterization of histopathological and ultrastructural changes in channel catfish experimentally infected with virulent Aeromonas hydrophila[J]. Frontiers in Microbiology，8：1519. doi：10.3389/fmicb.2017. 01519.

Ardó L，Jeney Z，Adams A，Jeney G. 2010. Immune responses of resistant and sensitive common carp families follo-wing experimental challenge with Aeromonas hydrophila[J]. Fish & Shellfish Immunogy，29（1）：111-116.

Baumgartner W A，F(xiàn)ord L，Hanson L. 2017. Lesions caused by virulent Aeromonas hydrophila in farmed catfish （Ictalurus punctatus and I. punctatus×I. furcatus） in Missi-ssippi[J]. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation，29（5）：747-751.

Guo S L，Yang Q H，F(xiàn)eng J J，Duan L H，Zhao J P. 2016. Phylogenetic analysis of the pathogenic genus Aeromo-nas spp. isolated from diseased eels in China[J]. Microbial Pathogenesis，101：12-23.

Hill J E，Penny S L，Crowell K G，Goh S H，Hemmingsen S M. 2004. cpnDB：A chaperonin sequence database[J]. Genome Research，14（8）：1669-1675.

Jubirt M M，Hanson L A，Hanson-Dorr K C，F(xiàn)ord L，Lemmons S，F(xiàn)ioranelli P，Cunningham F L. 2015. Potential for great egrets（Ardea alba） to transmit a virulent strain of Aeromonas hydrophila among channel catfish（Ictalu-rus punctatus） culture ponds[J]. Journal of Wildlife Disea-ses，51（3）：634-639.

Mi?ana-Galbis D，Urbizu-Serrano A，F(xiàn)arfán M，F(xiàn)usté M C，Lorén J G. 2009. Phylogenetic analysis and identification of Aeromonas species based on sequencing of the cpn60 universal target[J]. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，59（8）：1976-1983.

Mohammed H H，Peatman E. 2018. Winter kill in intensively stocked channel catfish（Ictalurus punctatus）：Coinfection with Aeromonas veronii，Streptococcus parauberis，and Shewanella putrefaciens[J]. Journal of Fish Diseases，41（9）：1339-1347.

Navarro A，Martíne-Murcia A. 2018. Phylogenetic analyses of the genus Aeromonas based on housekeeping gene sequencing and its influence on systematics[J]. Journal of Applied Microbiology，125（3）：622-631.

Ucko M，Colorni A，Kvitt H，Diamant A，Zlotkin A，Knibb W R. 2002. Strain variation in Mycobacterium marinum fish isolates[J]. Applied and Environmental Microbiology，68（11）：5281-5287.

Zhang D H，Moreira G S A，Shoemaker C，Newton J C，Xu D H. 2016a. Detection and quantification of virulent Aeromonas hydrophila in channel catfish tissues following waterborne challenge[J]. FEMS Microbiology Letters，363（9）：fnw080. doi：10.1093/femsle/fnw080.

Zhang D H，Xu D H，Shoemaker C. 2016b. Experimental induction of motile Aeromonas septicemia in channel catfish（Ictalurus punctatus） by waterborne challenge with virulent Aeromonas hydrophila[J]. Aquaculture Reports，3：18-23.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）