吳 瓊，吳雍真，李 倩，杜海洋，俞 琦

貴州中醫(yī)藥大學(xué)(貴州 貴陽(yáng) 550025)

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是以血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙、巨噬細(xì)胞激活、平滑肌增殖和遷移等過(guò)程為主要發(fā)展的一種血管壁慢性炎癥性疾病，也是導(dǎo)致各類(lèi)心腦血管疾病發(fā)生的病理基礎(chǔ)，其主要病因是脂質(zhì)代謝功能紊亂和免疫功能失調(diào)[1-2]?，F(xiàn)已成為對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生巨大威脅的常見(jiàn)慢性疾病之一[3]。而中藥多途徑、多靶點(diǎn)的作用在有效改善AS相關(guān)癥狀及預(yù)后方面受到廣泛關(guān)注[4]。中醫(yī)認(rèn)為AS的主要病因是熱毒，因而清熱解毒則是治療AS等疾病的主要中醫(yī)治法。中藥黃連(Coptischinensis)歸心、肝、胃、大腸經(jīng)，為毛茛科植物黃連、三角葉黃連或云南黃連的干燥根莖，其性寒、味苦，具有瀉火解毒、清熱燥濕的功效。現(xiàn)代藥理作用研究顯示[5-6]，黃連及其主要活性成分具有調(diào)節(jié)血脂、降低血壓、免疫調(diào)節(jié)、改善糖代謝等作用。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，以黃連為君藥的黃連解毒湯發(fā)揮抗AS作用可通過(guò)調(diào)控NLRP3炎癥小體的表達(dá)，降低小鼠AS模型炎癥因子水平[7]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可通過(guò)構(gòu)建“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網(wǎng)絡(luò)，尋找發(fā)揮關(guān)鍵作用的有效成分與靶點(diǎn)。因此，本文擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究方法，對(duì)黃連活性成分、靶蛋白及其與AS共同作用所涉及的信號(hào)通路、基因功能進(jìn)行分析，為進(jìn)一步研究傳統(tǒng)中藥黃連對(duì)AS的具體機(jī)制提供依據(jù)。

1 方法

1.1篩選黃連有效活性成分與OP靶蛋白通過(guò)TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)數(shù)據(jù)庫(kù)以口服生物利用度(OB)≥30，藥物相似度(DL)≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)，篩選黃連有效活性成分；查詢(xún)有效活性成分相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。在DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.disgenet.org/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.genecards.org/)獲取AS相關(guān)靶點(diǎn)。所得化合物的靶點(diǎn)與AS靶點(diǎn)取交集，使用Cytoscape V3.7.2軟件構(gòu)建藥物-活性成分-靶蛋白-疾病可視化聯(lián)系。

1.2蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)構(gòu)建交集靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)，選定“Homo sapiens”，構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)PPI網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)Degree值篩選出前20為核心靶點(diǎn)。

1.3生物學(xué)功能和通路分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)1.2核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(GO)功能和基因組百科全書(shū)(KEGG)通路分析，并設(shè)定物種為“Homo sapiens”、P<0.01。其中GO分析包括生物過(guò)程(BP)、細(xì)胞成分(CC)和分子功能(MF)。

2 結(jié)果

2.1黃連有效成分及靶蛋白分析通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索關(guān)鍵詞“黃連”并通過(guò)相關(guān)條件篩選得到黃連有效成分14個(gè)，并查詢(xún)獲得有效活性成分相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，結(jié)果顯示11個(gè)活性成分共對(duì)應(yīng)128個(gè)靶點(diǎn)。在DisGeNET、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索關(guān)鍵詞“Atherosclerosis”，篩選得到相應(yīng)靶點(diǎn)后取并集，刪除重復(fù)項(xiàng)后獲得AS相關(guān)靶點(diǎn)。將篩選獲得的有效活性成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)與AS相關(guān)靶點(diǎn)取交集，獲得62個(gè)靶點(diǎn)分別對(duì)應(yīng)10個(gè)活性成分。利用Cytoscape軟件建立“藥物-活性成分-靶蛋白-疾病”網(wǎng)絡(luò)(見(jiàn)圖 1)。Degree排前3的有效活性成分為槲皮素、巴馬汀、小檗堿，推測(cè)可能為黃連治療AS的關(guān)鍵有效成分，見(jiàn)表1。

圖1 黃連治療AS的“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)

表1 黃連治療AS關(guān)鍵有效成分

2.2構(gòu)建蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)將重合的62個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入String作PPI網(wǎng)絡(luò)，網(wǎng)絡(luò)共有62個(gè)節(jié)點(diǎn)，483條邊，見(jiàn)圖2，根據(jù)Degree大小排列，取前20篩選為核心靶點(diǎn)，見(jiàn)圖3。

圖2 黃連治療AS靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

圖3 Degree前20靶蛋白

2.3 GO功能與KEGG分析通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)黃連治療AS的20個(gè)潛在作用的核心靶點(diǎn)進(jìn)行分析，根據(jù)P<0.01，共得到108個(gè)GO注釋?zhuān)?0條KEGG通路。按P值大小，篩選出前20個(gè)GO注釋?zhuān)?jiàn)圖4，表中GO注釋11個(gè)與BP有關(guān)，9個(gè)與MF有關(guān)，GO注釋大多與BP和MF相關(guān)，如酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的正調(diào)控作用、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、對(duì)藥物的反應(yīng)等。KEGG結(jié)果顯示，20個(gè)核心靶點(diǎn)共富集在40條通路上，主要集中在癌癥信號(hào)通路、乙型肝炎、低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)信號(hào)通路、病毒性心肌炎、腫瘤壞死因子(TNF-α)信號(hào)通路、軍團(tuán)菌病、磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、人嗜T淋巴細(xì)胞病毒I型感染、P53信號(hào)通路等。P值排前20條通路，見(jiàn)圖5。

圖4 黃連治療AS的GO功能柱狀圖

圖5 黃連治療AS的KEGG通路氣泡

3 討論

AS是一種在動(dòng)脈內(nèi)膜積聚的脂質(zhì)外觀(guān)呈黃色粥樣，常見(jiàn)且重要的動(dòng)脈硬化血管病，主要病理基礎(chǔ)是冠心病、腦血管病和血栓栓塞性疾病等缺血性心腦血管病[8]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年死于A(yíng)S性疾患者約有2000萬(wàn)，嚴(yán)重危害人類(lèi)生命健康[9]。目前因?qū)S的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，故導(dǎo)致臨床上有效防治藥物缺乏[10]。因此，尋找療效顯著且副作用小的藥物成為亟待解決的問(wèn)題，傳統(tǒng)中藥多途徑、多靶點(diǎn)的作用也受到學(xué)者廣泛關(guān)注。本文通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)構(gòu)建黃連治療AS靶蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)、黃連活性成分-AS靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)等，分析黃連防治和治療AS的可能作用機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)[11]槲皮素可有效改善動(dòng)脈粥樣硬化，不僅通過(guò)影響脂質(zhì)代謝、膠原等成分的合成與分泌，還可通過(guò)干預(yù)PI3K/Akt/NF-κb通路中關(guān)鍵蛋白的活性，抑制平滑肌細(xì)胞、主動(dòng)脈壁成纖維細(xì)胞增殖，從而延緩動(dòng)脈硬化進(jìn)程；巴馬汀在一定程度上可降低血清低密度脂蛋白(LDL-C)、膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)，起到抑制AS作用[12]；小檗堿作為黃連的主要活性成分，具有降血糖血脂、抗充血性心力衰竭、抗血小板聚集，減輕缺血再灌注損傷，保護(hù)心肌抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞和促血管內(nèi)皮舒張因子釋放等多種作用，可從多個(gè)環(huán)節(jié)抑制AS的形成與發(fā)展[13-15]。

PPI網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果顯示，黃連治療AS與白介素-6(IL-6)、表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(CASP)3等20個(gè)靶點(diǎn)關(guān)系密切。IL-6為炎癥反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子，IL-6廣泛表達(dá)于脂紋中泡沫細(xì)胞，并在纖維帽及粥樣斑塊肩部高表達(dá)，其還可作用于下丘腦與肝臟，引起C反應(yīng)蛋白、纖維蛋白原及血清淀粉樣蛋白的產(chǎn)生，促進(jìn)AS[16]。EGFR廣泛存在于哺乳類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞表面，與配體表皮生長(zhǎng)因子或轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子結(jié)合，傳遞信號(hào)，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)與分化。EGFR的活性對(duì)心臟正常發(fā)育至關(guān)重要，在心血管疾病中具有重要作用，EGFR的激活與AS、血壓調(diào)節(jié)等具有密切聯(lián)系[17]。VEGFA是VEGF家族中最重要的成員之一，被認(rèn)為是傳統(tǒng)意義上的VEGF。研究顯示，VEGF在粥樣斑塊形成處表達(dá)明顯增高，并且經(jīng)其受體的介導(dǎo)對(duì)單核/巨噬細(xì)胞的趨化作用，使其在斑塊部位進(jìn)一步聚集，促進(jìn)炎癥病變發(fā)展[18]。CASP3是caspase家族中在細(xì)胞凋亡過(guò)程發(fā)揮重要功能的凋亡執(zhí)行者，位于caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)的最下游。晚期A(yíng)S中斑塊的變化多由巨噬細(xì)胞和血管平滑肌細(xì)胞的凋亡而導(dǎo)致，而CASP3是細(xì)胞凋亡途徑中的關(guān)鍵執(zhí)行蛋白，已在人和小鼠AS斑塊中發(fā)現(xiàn)，但其在A(yíng)S形成中的作用機(jī)制尚未明確[19]。

GO功能富集分析結(jié)果提示黃連治療AS可能是通過(guò)調(diào)控酶結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ?qū)D(zhuǎn)錄的正調(diào)控作用、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、對(duì)藥物的反應(yīng)等基因功能有關(guān)。KEGG通路富集分析，發(fā)現(xiàn)靶點(diǎn)主要富集在癌癥信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路、TNF-α信號(hào)通路、乙型肝炎、低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1)信號(hào)通路、病毒性心肌炎、P53信號(hào)通路、甲狀腺激素信號(hào)通路、人嗜T淋巴細(xì)胞病毒I型感染、軍團(tuán)菌病等通路上。KEGG結(jié)果中顯著性最高的癌癥信號(hào)通路較為復(fù)雜，具有多個(gè)下游通路，如：絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路、VGEF信號(hào)通路、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)信號(hào)通路等。MAPK信號(hào)通路具有調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、增殖及凋亡等重要生物學(xué)作用，并且其信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)在A(yíng)S發(fā)病過(guò)程中起重要調(diào)控作用。不同的細(xì)胞外刺激信號(hào)可通過(guò)MAPK信號(hào)通路的多條并行通路調(diào)節(jié)AS斑塊內(nèi)各個(gè)炎癥反應(yīng)及死亡過(guò)程[20]。PPAR的功能與心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展關(guān)系密切，是核受體超家族的重要成員，其中以PPARγ研究最為廣泛。相關(guān)研究[21]顯示PPARγ基因多態(tài)性與冠心病存在一定關(guān)系。PI3K/Akt信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞的各項(xiàng)功能均起到非常重要的調(diào)節(jié)作用，是連接細(xì)胞外信號(hào)與細(xì)胞功能效應(yīng)的重要分子。研究發(fā)現(xiàn)[22-23]，PI3K信號(hào)通路參與AS、高血壓、心衰等心血管疾病的病理生理過(guò)程，且PI3K抑制劑可有效抑制AS、穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣斑塊、保護(hù)心肌收縮力及降低血壓等。

綜上所述，中藥黃連治療AS的關(guān)鍵有效成分為槲皮素、巴馬汀、小檗堿，可能通過(guò)調(diào)節(jié)IL-6、EGFR、CASP3、VEGFA等靶點(diǎn)及癌癥信號(hào)通路、PI3K/Akt信號(hào)通路等達(dá)到防治AS的作用。