吳雪君 應(yīng)栩華 陳曉婷

1浙江中醫(yī)藥大學(xué)，杭州 310000；2浙江省立同德醫(yī)院，杭州 310000

【提要】 液體活檢是一種通過患者液體樣本了解疾病動態(tài)的微創(chuàng)方法，可檢測多種循環(huán)腫瘤生物標(biāo)志物，在癌癥診斷、預(yù)后判斷和監(jiān)測方面等發(fā)揮作用。

胰腺癌因胰腺特殊解剖特征和早期非特異性癥狀，80%～85%的患者在最初評估時就被診斷為轉(zhuǎn)移性或局部進(jìn)展性疾病[1]，失去了手術(shù)機(jī)會。目前胰腺癌的診斷依賴于CA19-9、CA125等腫瘤標(biāo)志物及影像學(xué)檢查，確診時間相對滯后，導(dǎo)致病情延誤。最近的全基因組測序研究表明，胰腺癌中有12個核心信號通路發(fā)生了基因改變，且初始突變可能出現(xiàn)在任何癥狀前近20年，這為臨床醫(yī)師利用精確的手段對胰腺癌進(jìn)行早期檢測帶來可能[2]。液體活檢是指對血液、尿液、唾液等體液進(jìn)行微創(chuàng)取樣和分析，以檢測和量化循環(huán)的癌癥生物標(biāo)志物來進(jìn)行診斷和預(yù)后判斷[3]。液體活檢作為一種通過患者體液樣本了解疾病動態(tài)的微創(chuàng)方法，是精確腫瘤學(xué)領(lǐng)域的一種創(chuàng)新工具，可以克服目前組織活檢的局限性，比組織活檢更快速、更容易重復(fù)，能實時提供有關(guān)癌癥的信息，在癌癥診斷、預(yù)后判斷和監(jiān)測方面越來越受歡迎[4]。胰腺癌受益于早期發(fā)現(xiàn)，所以在體液中尋找新的生物標(biāo)志物有很大的發(fā)展前景。本文就血清、尿液、唾液、胰液、膽汁、十二指腸液液體活檢中的生物標(biāo)志物進(jìn)行綜述。

一、血清

血清中生物標(biāo)志物的相關(guān)研究有很多，主要基于基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域相關(guān)研究進(jìn)展。

1．基因組學(xué)：微小RNAs(microRNAs, miRNAs)是一種長度為20～24個核苷酸的非編碼RNA，具有癌癥特異性表達(dá)模式[5]。有研究表明miR-205聯(lián)合CA19-9優(yōu)于單獨(dú)CA19-9的診斷準(zhǔn)確性，其作為胰腺癌液體活檢標(biāo)志物具有很高的潛力[6]；miRNA-10b的精確定量可以鑒別胰腺癌與慢性胰腺炎[7]。外泌體是一種膜包裹的囊泡，由包括癌細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞不斷大量地分泌并攜帶腫瘤特異性分子，廣泛存在于體液中[8]。由于其相對穩(wěn)定性和組成涵蓋了包括蛋白質(zhì)、代謝物、DNA、DNA修飾、編碼和非編碼RNA在內(nèi)的所有癌癥相關(guān)生物標(biāo)志物，成為一種強(qiáng)大的診斷工具[9]。Li等[10]分析了胰腺癌患者血漿外泌體中CIRC-PDE8A的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)外泌體CIRC-PDE8A與胰腺癌患者的進(jìn)展和預(yù)后相關(guān)，可能是胰腺癌早期診斷或預(yù)測病情進(jìn)展的有用標(biāo)志物。Kitagawa等[11]則發(fā)現(xiàn)外泌體中mRNA WASF2、ARF6及sonRNA SNORA74A和SNORA25可能是早期發(fā)現(xiàn)胰腺癌的有效工具，且WASF2水平與胰腺癌風(fēng)險的相關(guān)性最高。體液中腫瘤來源的循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)臨床應(yīng)用，目前被廣泛應(yīng)用于輔助診療非小細(xì)胞肺癌患者[12-13]。Kinugasa等[14]比較分析了75例胰腺癌患者組織DNA和ctDNA的K-ras基因突變，發(fā)現(xiàn)58例K-ras基因突變率一致，且ctDNA中K-ras突變的患者生存率明顯降低，表明ctDNA 分析是一種新的檢測胰腺癌突變的有效方法。循環(huán)無細(xì)胞DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)是腫瘤衍生部分，其5-羥甲基胞嘧啶信號在胰腺癌中有特異性改變，可用于識別癌癥類型和跟蹤腫瘤分期[15]。血液樣本中cfDNA總量可區(qū)分健康者與胰腺導(dǎo)管內(nèi)乳頭狀黏液瘤(intraductal papillary mocinous neoplasm，IPMN)或胰腺癌患者，且IPMN患者cfDNA中有GNAS突變，而漿液性囊腺瘤或健康者無此突變，故cfDNA分析可用于診斷IPMN患者或監(jiān)測疾病進(jìn)展[16]，有望實現(xiàn)胰腺癌前病變的超早期診斷。超敏液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)二次定量檢測[17]及上皮細(xì)胞黏附分子脂質(zhì)磁性球和質(zhì)體單克隆抗體分離系統(tǒng)[18]捕獲cfDNA的效率高，可為胰腺癌的早期診斷提供強(qiáng)有力的技術(shù)支撐。

2．蛋白質(zhì)組學(xué)： 堿性磷酸酶胎盤樣2蛋白(alkaline phosphatase placental like-2，ALPPL-2)是一種癌胚蛋白。Dua等[19]發(fā)現(xiàn)ALPPL-2在許多胰腺癌細(xì)胞系的mRNA和蛋白水平上均有異常表達(dá)，在胰腺癌早期診斷中具有潛在應(yīng)用價值。腫瘤生物標(biāo)志物的早期檢測敏感性受限于腫瘤內(nèi)生物標(biāo)志物的表達(dá)、脫落率及早期腫瘤的體積。較小的腫瘤可能不會流失足夠數(shù)量的生物標(biāo)志物，但是少量具有突變、過表達(dá)或不完全分區(qū)的腫瘤相關(guān)蛋白可引起體液免疫反應(yīng)，特異性自身抗體很容易被檢測到[20]。腫瘤相關(guān)抗原自身抗體可在診斷前數(shù)月至數(shù)年出現(xiàn)，有望作為早期檢測的生物標(biāo)志物。Bracci等[21]的研究表明胰腺癌相關(guān)宿主免疫反應(yīng)因子可能是診斷篩查工具和預(yù)后指標(biāo)。可溶性iC3b是在自身抗體與腫瘤細(xì)胞結(jié)合后，通過與補(bǔ)體調(diào)控蛋白的相互作用而導(dǎo)致補(bǔ)體級聯(lián)失活后生成的，其診斷胰腺癌相較于CA19-9靈敏度更高，監(jiān)測術(shù)后復(fù)發(fā)可比影像學(xué)診斷早4個月[22]。Wang等[23]發(fā)現(xiàn)血清中巨噬細(xì)胞抑制因子1對早期胰腺導(dǎo)管腺癌診斷及鑒別診斷的靈敏度比CA19-9更好，且可用于術(shù)后復(fù)發(fā)的檢測。此外，血清NGAL[24]、MMP-9[25]、LAMC2、ANXA2、ADAM9[26]等也有可能成為胰腺癌的早期標(biāo)志物。

二、尿液

CA19-9是臨床常用的腫瘤標(biāo)志物，在胰腺癌的早期診斷中，常與其他腫瘤標(biāo)志物如CEA、CA50、CA242等聯(lián)合應(yīng)用。受此啟發(fā)，Szajda等[27]設(shè)想有些標(biāo)志物可能涉及糖結(jié)合物加工過程中的酶，并在初步研究中表明，尿液中的HEX 、GAL 、FUC和MAN等溶酶體外糖苷酶的活性可用于胰腺癌的早期診斷。中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白(neutrophil gelatinase-associated lipocalin, NGAL)是近年來出現(xiàn)的一種在多種腫瘤發(fā)生中起重要作用的蛋白。各種惡性腫瘤的NGAL始終過表達(dá)，與腫瘤大小、分期和侵襲性有關(guān)。這些特征使NGAL成為潛在的惡性腫瘤生物標(biāo)志物[28]。Hogendorf等[29]研究發(fā)現(xiàn)，截斷值為27 ng/ml的尿液NGAL濃度的靈敏度和特異度不遜于甚至略高于CA125和CA19-9，可以準(zhǔn)確鑒別慢性胰腺炎腫塊和胰腺癌。Debernardi等[30]對胰腺癌、慢性胰腺炎患者及健康對照者的尿液樣本中miRNA譜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)miR-143、miR-223、miR-30e在I期胰腺癌顯著過表達(dá)，首次證明了miRNA生物標(biāo)志物在尿液樣本中無創(chuàng)、早期檢測方面的應(yīng)用。除檢測尿液中相對特異、敏感的分子標(biāo)志物，檢測尿液代謝譜也可能成為一種有效的無創(chuàng)篩選手段。Davis等[31]使用OPLS-DA對66種代謝物的光譜進(jìn)行有針對性的定性分析，檢測到胰腺癌與健康對照組和良性胰腺疾病的代謝譜存在明顯差異。Napoli等[32]還將尿液代謝譜和磁共振波譜結(jié)合起來，不僅能識別胰腺癌復(fù)雜的分子特征，還顯示了跟蹤疾病演變和進(jìn)行腫瘤定位的可能性。上述研究表明，尿液的分析有一定的可靠性和可發(fā)展性，其無創(chuàng)和非侵入性可能有助于大規(guī)模的篩查程序，值得更進(jìn)一步的研究。

三、唾液

唾液是一種易于獲取和提供信息的生物液體，是早期發(fā)現(xiàn)多種疾病的理想選擇，包括心血管、腎臟和自身免疫性疾病、病毒和細(xì)菌感染，更重要的是癌癥。Sugimoto等[33]對口腔癌、胰腺癌、乳腺癌等患者的唾液樣本進(jìn)行了全面的代謝產(chǎn)物分析，對比發(fā)現(xiàn)唾液代謝物中含有癌癥特異性特征。循環(huán)腫瘤外泌體含有豐富的腫瘤生物學(xué)信息，已成為腫瘤早期檢測和診斷的重要靶點，唾液中就含有大量的循環(huán)外泌體[34]。有研究表明，唾液外泌體中miR-1246和miR-4644有可能成為胰腺癌的潛在生物標(biāo)志物[35]。Zhang等[36]通過對唾液上清液進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，唾液中K-ras、MBD3L2、ACRV1、DPM1 4個mRNA標(biāo)志物可以將胰腺癌患者與非癌性研究對象區(qū)分開來，特異度和靈敏度高。之前的研究結(jié)果顯示，H19、HOTAIR、HOTTIP、MALAT1、PVT1 5種lncRNA與胰腺癌的關(guān)系最密切，Xie等[37]發(fā)現(xiàn)胰腺癌組唾液中HOTAIR和PVT1的含量明顯高于良性胰腺腫瘤患者和健康對照者唾液中的表達(dá)，顯示出新的非侵入性生物標(biāo)志物檢測胰腺癌的潛力。唾液作為一種無創(chuàng)、安全的來源，在疾病的診斷和預(yù)后判斷中有可能成為血液或其他侵入性診斷替代品。

四、膽汁、胰液、十二指腸液

1．膽汁 ： 膽汁中含有豐富的生物分子，這些分子與肝臟、膽管、膽囊和胰腺密切相關(guān)，可作為肝、膽、胰腺等腫瘤生物標(biāo)志物的豐富來源[38]。Hogendorf等[29]的臨床試驗同時發(fā)現(xiàn)在膽汁樣本中截斷值為27 ng/ml的NGAL在胰腺腺癌鑒別方面具有顯著的準(zhǔn)確性。K-ras密碼子12突變是胰腺癌發(fā)生發(fā)展過程中最早的基因突變之一[39]。Zhou等[40]在大鼠實驗中發(fā)現(xiàn)膽汁的K-ras基因第12外顯子密碼子的點突變具有較高的易變性和特異性，有望成為胰腺癌肝轉(zhuǎn)移早期診斷的一種新元素篩選方法。

2．胰液： Ginesta等[41]發(fā)現(xiàn)腺瘤性息肉病桿菌的甲基化分析對胰腺癌、壺腹癌、IPMN均有較高的敏感性，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。胰液中循環(huán)的miRNAs可作為胰腺癌的候選生物標(biāo)志物，如Wang等[42]認(rèn)為胰液中循環(huán)miR-205、miR-210、miR-492和miR-1247水平升高是胰腺癌患者疾病和不良預(yù)后的候選生物標(biāo)志物。Ateeb等[43]則發(fā)現(xiàn)胰液中miR-155可能是胰腺癌前病變IPMN的臨床生物標(biāo)志物。目前影像學(xué)檢查可以鑒別胰腺腫瘤與囊腫，但不能鑒別顯微鏡下的異型增生。胰液中的突變體T53的檢測可用于提高胰腺癌和高級別異型增生的診斷和篩查[44]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)MMP-9、DJ-1和AIBG是胰腺導(dǎo)管腺癌患者胰液中過表達(dá)的蛋白，在胰腺疾病的診斷和篩選中有進(jìn)一步的應(yīng)用價值[25]。IPMN患者胰腺分泌的胰蛋白酶抑制劑(pancreatic secretory trypsin inhibitor，PSTI)水平明顯高于其他胰腺疾病患者[45]，檢測PSTI水平可能實現(xiàn)胰腺癌前病變的超早期診斷。膽鹽依賴型脂肪酶(bile salt dependent lipase，BSDL)基因11號外顯子編碼可變數(shù)量的串聯(lián)重復(fù)序列參與胰腺病理改變，在胰液中檢測截斷的BSDL對PRAAHGc端序列抗體的反應(yīng)可能是早期診斷胰腺癌的一個新工具[46]。胰液獲取的手段也在發(fā)展，內(nèi)鏡下鼻胰引流管可對胰腺癌患者進(jìn)行重復(fù)胰液細(xì)胞學(xué)檢查，具有較高的診斷率，尤其是對于長徑<20 mm或位于胰頭的腫瘤，具有一定的診斷價值[47]。

3．十二指腸液：Matsunaga等[48]發(fā)現(xiàn)十二指腸液中的S100鈣結(jié)合蛋白P(S100P)濃度診斷0/ⅠA和ⅠB/ⅡA期胰腺導(dǎo)管腺癌的靈敏度和特異度分別為85%和77%，因此聯(lián)合十二指腸液中S100P濃度和常規(guī)篩檢，可促進(jìn)胰腺癌的早期檢測。

膽汁、胰液、十二指腸液的獲取途徑相較于其他體液可能不便利且有微創(chuàng)傷性，但人類膽汁、胰液、十二指腸液成分很大程度上局限于病理來源，循環(huán)的生物標(biāo)志物和分泌物濃度高，相較于血液、尿液等可排除混雜的代謝因素，可能有更高的準(zhǔn)確度、特異度和靈敏度。

綜上所述，雖然關(guān)于胰腺癌生物標(biāo)志物的相關(guān)研究很多，但仍缺乏大樣本的臨床研究和可靠的大數(shù)據(jù)，目前仍沒有新的標(biāo)志物被臨床廣泛應(yīng)用，因此需要將胰腺癌早期診斷中具有潛在應(yīng)用價值的生物標(biāo)志物放到更多大規(guī)模研究中去驗證。影像學(xué)和組織活檢等傳統(tǒng)的篩查手段都有一定的缺點，液體活檢作為臨床需要的輔助診斷技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，但液體中的生物標(biāo)志物相對于組織含量低，需要開發(fā)液體活檢后的相關(guān)檢測技術(shù)來提高檢測率。只有具備了敏感特異的生物標(biāo)志物、簡潔的篩查技術(shù)及高危人群篩查對象后，才能將簡便易行的檢查手段應(yīng)用于體檢篩查中，從而為胰腺癌的早期診斷和疾病監(jiān)測提供更有價值的指導(dǎo)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突