吳學友，陳二虎，王康旭，唐培安

（南京財經(jīng)大學 食品科學與工程學院，糧食儲運國家工程實驗室，江蘇高校糧油質量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

害蟲為害是制約稻谷糧食安全的主要威脅之一，與傳統(tǒng)農(nóng)業(yè)中的化學藥劑防治相比，轉 Bt基因水稻抗蟲殺蟲受到研究者的青睞[1-3]。轉 Bt基因水稻的靶標害蟲主要是農(nóng)田害蟲，然而籽粒中存在Bt蛋白，轉基因稻谷的殺蟲特性在儲藏期間也會對儲糧害蟲產(chǎn)生影響，將導致糧倉生態(tài)系統(tǒng)發(fā)生變化，進而影響儲藏期的稻谷品質[4-5]。印度谷螟Plodia interpunctella（Hübner），隸屬于鱗翅目卷螟科，是世界性的倉儲害蟲之一，其幼蟲喜剝蝕糧食子粒的胚部和表皮，吐絲結網(wǎng)造成糧食結塊變質，其成蟲善飛，易造成儲糧的重復感染[6-8]。因此，開展儲藏期內(nèi)轉基因稻谷對儲糧害蟲印度谷螟生長發(fā)育的影響對加深稻谷安全儲藏認知具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 供試稻谷

轉基因稻谷華恢1號：以pBluescript II KS(+/–)phagemid為載體，通過基因槍法介導，將抗蟲基因Cry1Ab/Cry1Ac導入水稻明恢63獲得轉Bt基因抗蟲水稻，標記為HH/Bt（圖1-1）。非轉基因稻谷明恢63：轉Cry1Ab/Cry1Ac基因水稻華恢1號的非轉基因親本對照，標記為MH/CK（圖1-2）。上述兩種稻谷由華中農(nóng)業(yè)大學作物遺傳改良國家重點實驗室提供。

圖1 -1 轉Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷（HH/Bt）

圖1 -2 非轉基因親本（MH/CK）

1.2 供試蟲源

印度谷螟采自南京財經(jīng)大學儲糧害蟲防控實驗室的模擬糧倉中，后在養(yǎng)蟲室內(nèi)人工飼養(yǎng)數(shù)代。將印度谷螟配對成蟲接種于含有100 g人工飼料的玻璃瓶中（經(jīng)160 ℃干熱滅菌），產(chǎn)卵24 h后移出成蟲，挑取新鮮卵粒置于培養(yǎng)小室（Φ30 mm×15 mm），添加適量人工飼料（大豆粉和酵母粉按質量比20∶1混合而成）。飼養(yǎng)條件為（27±1）℃、75%±5% RH、24 h無光照。

1.3 主要儀器設備

JLGJ4.5型檢驗礱谷機：浙江臺州市糧儀廠；FW80型高速粉碎機：天津泰斯特儀器有限公司；SL1202N型分析天平：Denver公司；PQX-300D型人工氣候箱：寧波東南儀器有限公司；SZM45型體式顯微鏡：寧波舜宇儀器設備有限公司。

1.4 稻谷飼料樣品配制

稻谷HH/Bt和MH/CK樣品分別經(jīng)除雜，礱谷、再除雜，粉碎等處理后獲得MH/CK、HH/Bt糙米粉，隨后向HH/Bt糙米粉中添加MH/CK以制備HH/Bt含量分別為80%、50%、20%、10%、5%和2%的混合糙米粉，以MH/CK（0%）、HH/Bt（100%）糙米粉分別作為陰性對照和陽性對照。

1.5 試蟲處理

取新羽化的印度谷螟成蟲 30只（雌雄比為1∶1），產(chǎn)卵后在卵粒周圍添加適量配制好的稻谷飼料，置于養(yǎng)蟲室（75% RH，24 h無光照）。每24 h觀察一次，記錄卵的孵化數(shù)、蟲齡、死亡數(shù)和羽化數(shù)等信息。待試蟲成蟲羽化后，立即進行雌雄配對，單對觀察并統(tǒng)計產(chǎn)卵數(shù)及成蟲壽命。模擬溫度為：21、24、30、33、36和39 ℃，每個處理200頭重復，對照組飼料為MH/CK糙米粉。

1.6 發(fā)育速率與溫度關系模擬

印度谷螟各蟲態(tài)生長發(fā)育速率與溫度的關系曲線模擬依據(jù)Briere等[9]推導的非線性模型進行，并利用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行回歸方程擬合，計算印度谷螟生長發(fā)育各蟲態(tài)發(fā)育參數(shù)（a、T0、TL），并確定印度谷螟各蟲態(tài)的發(fā)育速率與溫度關系的非線性模型。

Briere等[9]推導的昆蟲種群生長發(fā)育速率與溫度關系的非線性模型為：

其中，R(T)表示平均發(fā)育速率，是昆蟲某一蟲態(tài)發(fā)育所需時間的倒數(shù)，單位為d–1；T表示溫度，T0表示最低發(fā)育溫度，TL表示最高發(fā)育溫度，單位均為℃，在計算之初，可以根據(jù)實驗觀察予以推測大概范圍；a表示經(jīng)驗常數(shù)，某一昆蟲種群各蟲態(tài)的a值在一定范圍內(nèi)。依據(jù)上述非線性模型方程。

1.7 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均設置 3個生物學重復，數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進行方差分析，通過獨立樣本t測驗比較分析轉基因稻谷對印度谷螟發(fā)育的影響，實驗數(shù)據(jù)均為平均值±標準誤表示，顯著差異水平設置為α=0.05。

2 結果與分析

2.1 轉基因稻谷對印度谷螟的致死效應

以不同含量轉基因稻谷糙米粉飼喂印度谷螟初孵幼蟲，觀察記錄1至3齡幼蟲生物學特性以及存活情況。研究發(fā)現(xiàn)，印度谷螟初孵幼蟲即開始取食，對含HH/Bt的飼料并無明顯的趨避行為表現(xiàn)，這一發(fā)現(xiàn)與已有報道相一致[10-11]。幼蟲在取食含轉基因稻谷的飼料后中毒表現(xiàn)為：首先離開飼料，隨之其運動能力減弱，糞便含水狀物，其腹部有明顯凹陷，皺縮，身體蜷縮，干癟發(fā)黃，最后死亡。由此可見，轉Bt基因稻谷對印度谷螟的致死效果，這一研究結果與此前報道類似[10-11]。

致死率統(tǒng)計結果顯示，轉Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷對印度谷螟低齡幼蟲（1至 3齡幼蟲）具有較強的致死效應[10-11]，在HH/Bt含量高于20%時，初孵1齡幼蟲在尚未進入2齡期就已經(jīng)全部死亡。在2%和5%HH/Bt含量時，幼蟲在3齡結束進入 4齡時的死亡率分別為 60.0%和 68.3%（詳見表1）。因此，本研究選取2% HH/Bt作為實驗組飼料來探討轉Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷對印度谷螟生長發(fā)育的影響。

2.2 轉基因稻谷對印度谷螟發(fā)育歷期的影響

在模擬 21～36 ℃試驗溫范圍內(nèi)，轉Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷對印度谷螟的生長發(fā)育均有顯著影響，且整體上呈現(xiàn)發(fā)育歷期延長的趨勢，這一結果與先前研究報道一致[10-11]。在 27 ℃條件下，對照組（MH/CK）試蟲卵至成蟲的發(fā)育歷期為63.20 d，2% HH/Bt糙米粉飼喂的實驗組試蟲延長為75.60 d。各發(fā)育階段試蟲的發(fā)育歷期為：對照組一齡、二齡、三齡和四齡幼蟲發(fā)育歷期均約為5 d左右，而實驗組則均延長為8 d左右；對照組五齡幼蟲發(fā)育歷期為 7.55 d，實驗組則延長為10.22 d；研究還發(fā)現(xiàn)，六齡幼蟲發(fā)育歷期縮短，對照組為16.47 d，實驗組則縮短為12.83 d；化蛹后，對照組蛹期和成蟲期的發(fā)育歷期分別為 8.21和 7.06 d，實驗組蛹期和成蟲期的發(fā)育歷期則分別延長為9.06和8.50 d（表2）。

根據(jù)C. de A. E. Gasparin提出的有效積溫法則，作為變溫動物的昆蟲，其生長發(fā)育須從外界（食物和環(huán)境）獲取一定的熱量，且存在發(fā)育閾溫度和最適發(fā)育溫度。不同模擬溫度條件下，取食MH/CK和2% HH/Bt糙米粉的印度谷螟卵發(fā)育至成蟲所需總時間見圖2。在21～36 ℃條件下，對照組和實驗組試蟲均能完成生長發(fā)育，對照組和實驗組均在 30 ℃條件下發(fā)育歷期達到最小值（分別為53.00 d和67.73 d）。統(tǒng)計分析結果表明，以2% HH/Bt和MH/CK糙米為飼料的印度谷螟在各溫度下發(fā)育歷期差異均極顯著（P<0.05）。

表1 不同含量的轉基因稻谷對印度谷螟的致死率統(tǒng)計 %

表2 不同溫度下轉Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷對印度谷螟生長發(fā)育的影響

圖2 轉Bt基因稻谷對印度谷螟生長發(fā)育（卵至成蟲）的影響

2.3 各蟲態(tài)發(fā)育速率與溫度關系的模擬

昆蟲的生長發(fā)育不但需要在一定的溫度范圍內(nèi)，且在這個適宜昆蟲生長發(fā)育的溫度閾值內(nèi)，昆蟲的生長發(fā)育速度同樣受到溫度的影響。印度谷螟各蟲態(tài)生長發(fā)育速率表明，其生長發(fā)育速率與溫度的關系是非線性的，在21～30 ℃其趨勢為類似對數(shù)增長，在高于 30 ℃之后，該曲線迅速下降，在最高發(fā)育速度的兩側曲線并不對稱。依據(jù) Briere等[9]非線性模型進行回歸方程擬合，印度谷螟生長發(fā)育速率與溫度關系模型參數(shù)如表 3所示：印度谷螟的發(fā)育起點溫度（T0）為 7.40～15.94 ℃，其中，卵、六齡期、蛹的起始溫度分別為15.15、9.92和7.40 ℃，表明印度谷螟六齡幼蟲和蛹對低溫的耐受能力很強；印度谷螟發(fā)育最高溫度（TL）在 37.60～44.11 ℃，其中，卵孵化的溫度上限為 38.71 ℃，本研究在 39 ℃下的印度谷螟卵未能發(fā)育也證實了這一推斷結果。各蟲態(tài)的發(fā)育速率R(T)與溫度T間的擬合非線性曲線模型見圖3。

表3 印度谷螟生長發(fā)育速率與溫度關系模型參數(shù)

2.4 轉Bt基因稻谷對印度谷螟發(fā)育速率的影響

印度谷螟各蟲態(tài)發(fā)育速率與溫度關系的非線性方程各參數(shù)見表4。以2% HH/Bt糙米粉為食的印度谷螟發(fā)育起點溫度（T0）為4.90～17.36 ℃，其中卵孵化的起始溫度為 15.13 ℃，六齡幼蟲和蛹對低溫的耐受能力最強；發(fā)育最高溫度（TL）上限為 37.72～40.33 ℃，其中卵孵化的溫度上限為38.96 ℃。據(jù)此推斷，印度谷螟在轉Bt基因稻谷為飼料的生長環(huán)境中的適應性要高于對照組，與先前轉基因稻谷對鱗翅目倉儲害蟲生長發(fā)育影響結果相同[12-14]。2% HH/Bt糙米粉飼喂印度谷螟各蟲態(tài)發(fā)育速率R(T)與溫度T間的擬合非線性曲線模型見圖4。

圖3 印度谷螟各蟲態(tài)發(fā)育速率與溫度關系模擬

表4 印度谷螟生長發(fā)育速率與溫度關系模型參數(shù)（2% HH/Bt）

通過以上表3與表4數(shù)據(jù)以及印度谷螟各蟲態(tài)3個參數(shù)對比研究發(fā)現(xiàn)，取食轉Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷并沒有顯著改變印度谷螟最高發(fā)育溫度，但印度谷螟各蟲態(tài)發(fā)育最低溫度有所增加，這可能是低溫和Bt蛋白雙重作用的結果。

轉Bt基因稻谷的開發(fā)是抵抗田間害蟲的有效手段[15-18]，同時轉基因稻谷的產(chǎn)后面臨的倉儲環(huán)節(jié)引起諸多糧食儲藏研究人員的諸多關注。趙文娟[10]用轉Cry1Ac+SCK稻谷飼喂印度谷螟的研究表明實驗組印度谷螟存活率、發(fā)育歷期分別為40.8%、62.2 d，而對照組分別為75.2%、53.0 d，兩者存在顯著差異。蔣海燕等[11]通過配制不同比例轉Bt基因稻谷人工飼料測定其對1～3齡幼蟲在72 h內(nèi)的急性毒力實驗表明，取食含10%、30%、50%和70%轉基因稻谷粉飼料72 h后的印度谷螟初孵化幼蟲的死亡率分別為 29.30%、48.50%、54.75%和71.61%。轉基因稻谷開發(fā)時，盡管選取的Bt基因有所不同，但獲得的轉基因稻谷對鱗翅目昆蟲據(jù)均有良好殺滅作用，本文以及類似研究均表明，轉基因稻谷對鱗翅目儲糧害蟲仍表現(xiàn)出良好的抗蟲性。

圖4 印度谷螟各蟲態(tài)發(fā)育速率與溫度關系模擬（2% HH/Bt）

目前關于轉Bt基因稻谷對儲糧害蟲生長發(fā)育的研究表明，轉Bt基因抗蟲稻谷對印度谷螟、麥蛾和米蛾等鱗翅目害蟲顯示出較高的抗蟲性，在存活率、發(fā)育歷期等生物學指標上與對照組都存在差異性。Mcgaughey[19]首次報道了印度谷螟在實驗室條件下對Bt產(chǎn)生抗性。稻谷的儲藏是一個長期持續(xù)的過程，在Bt蛋白的長期脅迫下，將導致害蟲種群中抗性基因及個體的出現(xiàn)或增加，嚴重的甚至會出現(xiàn)“超級害蟲”，這是一個重要的生態(tài)安全問題，糧庫害蟲管理將面臨新的挑戰(zhàn)。為此，我們還對喂食轉基因稻谷后的印度谷螟差異表達基因以及抗氧化酶活性進行研究[20-21]，這對于加強儲糧害蟲抗性管理及抗性風險預測，為轉基因稻谷的安全儲藏提供指導，是十分必要且有意義的。

3 結論

利用轉Bt基因稻谷糙米粉（HH/Bt）飼養(yǎng)印度谷螟，統(tǒng)計不同溫度條件下各蟲態(tài)的發(fā)育歷期和發(fā)育速度，并與非轉基因稻谷糙米粉（MH/CK）飼養(yǎng)的對照組進行比較分析，得到如下結論：

（1）溫度能夠顯著影響印度谷螟各蟲態(tài)的發(fā)育歷期和發(fā)育速度，印度谷螟各蟲態(tài)生長發(fā)育速率R（T）與溫度T的非線性模型擬合曲線顯示，該蟲發(fā)育起點溫度（T0）為7.40～15.94 ℃，其中，卵孵化的起始溫度和最高溫度分別為 15.15 ℃、38.71 ℃。

（2）將印度谷螟卵接入到完全轉Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷的飼料中，孵化的幼蟲全部死亡，這表明儲藏期內(nèi)轉Bt基因稻谷對糧倉印度谷螟具有一定的致死作用。

（3）以轉Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷（2%HH/Bt）飼喂的印度谷螟幼蟲生長發(fā)育所需時間比對照稻谷（MH/CK）顯著增加，說明在亞致死劑量以下時，Bt蛋白可以減緩印度谷螟生長發(fā)育速率。

（4）取食含轉Cry1Ab/Cry1Ac基因稻谷飼料的印度谷螟發(fā)育起點溫度（T0）為4.90～17.36 ℃，溫度范圍較對照組有所擴大，而卵孵化的起始溫度和最高溫度則分別為 15.13 ℃、38.96 ℃，無明顯變化。

備注：本文的彩色圖表可從本刊官網(wǎng)（http://lyspkj.ijournal.cn/ch/index.axpx）、中國知網(wǎng)、萬方、維普、超星等數(shù)據(jù)庫下載獲取。