肖婷婷 林詩(shī)晗 柯志紅 邱在玲 曾建釵 胡雪剛 林雪梅 鄒璐寧 呂紅兵

人牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)的主要功能是分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞，并通過(guò)與上皮干細(xì)胞的相互作用參與牙釉質(zhì)的形成[1-2]，因此DPSCs在牙釉質(zhì)、牙本質(zhì)和牙髓組織再生中具有重要作用。

環(huán)狀RNA(circRNA)是一種含有環(huán)狀結(jié)構(gòu)[3]的內(nèi)源性非編碼RNA。1976年，首次在病毒中發(fā)現(xiàn)circRNAs，與線(xiàn)性RNA相比，該環(huán)狀結(jié)構(gòu)更穩(wěn)定，對(duì)RNase R的抵抗性更強(qiáng)[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動(dòng)物內(nèi)發(fā)現(xiàn)了大量的circRNAs，因其為環(huán)狀，不易被降解，故circRNAs可作為疾病診斷的生物標(biāo)志物[5]。

研究表明，circRNAs參與成骨分化的過(guò)程。Qian等[6]研究發(fā)現(xiàn)，circ19142和circ5846在小鼠MC3T3-E1成骨細(xì)胞成骨分化中具有重要作用。此外，Zheng等[7]發(fā)現(xiàn)，差異性的circRNAs在牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)成骨分化和生物礦化過(guò)程中具有重要作用。而DPSCs作為牙髓再生重要的種子細(xì)胞，其成牙本質(zhì)分化是否受到circRNAs的調(diào)控，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在闡明circRNAs在DPSCs成牙本質(zhì)分化中的作用，為進(jìn)一步探索circRNAs在DPSCs成牙本質(zhì)分化中的調(diào)控機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

胎牛血清(FBS，Hyclone，USA)；10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/ml維生素C、10 mol/L地塞米松、Ⅰ型膠原酶、dispase Ⅱ酶(Sigma，USA)；鼠抗人STRO-1單克隆抗體(R&D systems，USA)；ALP檢測(cè)試劑盒、茜素紅(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；芯片(Arraystar，USA)。

1.2 牙髓細(xì)胞的培養(yǎng)

選取臨床17～23 歲健康的第三磨牙或因正畸需要拔除的牙，在超凈臺(tái)里取出牙髓，CD酶(3 mg/ml I型膠原酶，4 mg/ml dispase Ⅱ酶)消化、終止、離心、重懸后過(guò)細(xì)胞篩，得到單細(xì)胞懸液。加入含10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后換液，10 d后更換半液，14 d后更換全液，標(biāo)記為原代。細(xì)胞生長(zhǎng)的密度至80%～85%時(shí)，用胰酶消化傳代，標(biāo)為第1代，取第2～3代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3 免疫磁珠分選DPSCs

取1×107對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的牙髓細(xì)胞，用鼠抗人STRO-1單克隆抗體50 μg /107cells 標(biāo)記；每107個(gè)細(xì)胞加入80 μl buffer、20 μl免疫磁珠，混勻后于4 ℃冰箱避光孵育15 min；陽(yáng)性細(xì)胞留在磁柱里；取下LS柱，加入5 ml buffer快速推下，收集到的細(xì)胞即為DPSCs。采用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，酶標(biāo)儀檢測(cè)A值(450 nm)，取均值描繪生長(zhǎng)曲線(xiàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.4 DPSCs的礦化能力鑒定

當(dāng)?shù)?代的DPSCs密度達(dá)80%～85%時(shí)，以每孔2×103個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板。細(xì)胞匯合達(dá)70%后，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為2 組，對(duì)照組繼續(xù)采用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)組改用成牙本質(zhì)誘導(dǎo)液(含10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、50 μg/ml維生素C、10 mol/L地塞米松、10% FBS的α-MEM培養(yǎng)液)，培養(yǎng)21 d。取第7天培養(yǎng)的2 組細(xì)胞，采用ALP檢測(cè)試劑盒進(jìn)行ALP活力測(cè)定；取第14天培養(yǎng)的兩組細(xì)胞，進(jìn)行ALP染色(1%多聚甲醛于室溫下固定30 min，加入現(xiàn)配的ALP混合液黑暗處染色30 min，三蒸水快速?zèng)_洗，于顯微鏡下拍照)；取第21天培養(yǎng)的2 組細(xì)胞，進(jìn)行茜素紅染色(1%多聚甲醛于室溫下固定30 min，加入1%茜素紅染色10 min，三蒸水快速?zèng)_洗，于顯微鏡下觀察)，通過(guò)觀察礦化結(jié)節(jié)來(lái)鑒定其礦化能力。

1.5 Arraystar芯片檢測(cè)circRNAs表達(dá)譜

取第3代DPSCs按以上分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，取14 d培養(yǎng)后的兩組細(xì)胞，加入Trizol靜置5 min后提取總RNA。使用Arraystar芯片，樣品標(biāo)記和陣列雜交按照廠家的標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行操作。將原始數(shù)據(jù)掃描圖導(dǎo)入Agilent提取軟件中進(jìn)行原始數(shù)據(jù)提取。

1.6 circRNAs靶基因預(yù)測(cè)及生物信息學(xué)分析

對(duì)于差異表達(dá)的circRNAs，結(jié)合miRanda和TargetScan軟件搜索其靶基因。使用DAVID6.7功能注釋工具對(duì)差異circRNAs的靶基因進(jìn)行GO和KEGG功能富集分析。利用DAVID將GO注釋分成細(xì)胞組成、分子功能和生物過(guò)程3 個(gè)類(lèi)別。GO和KEGG使用的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法是基于超幾何分布的Fisher精確檢驗(yàn)，P<0.05時(shí)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 DPSCs的分離及礦化能力鑒定

細(xì)胞懸液通過(guò)CD酶消化獲得，原代細(xì)胞培養(yǎng)24 h后開(kāi)始貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞呈星形或梭形。約3～4 d后細(xì)胞密度可達(dá)80%～85%。免疫磁珠篩選出STRO-1+的DPSCs，DPSCs的形態(tài)為纖維樣，胞漿突起呈長(zhǎng)梭形(圖 1)。繪制DPSCs生長(zhǎng)曲線(xiàn)，可見(jiàn)DPSCs的生長(zhǎng)曲線(xiàn)呈S型(圖 2)。

圖 1 原代培養(yǎng)的細(xì)胞和DPSCs(P3)的形態(tài)(倒置顯微鏡， ×100)

圖 2 DPSCs的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

DPSCs常規(guī)培養(yǎng)7 d的ALP活力測(cè)定值別為1.38±0.09；成牙本質(zhì)誘導(dǎo)7 d后的DPSCs，ALP測(cè)定值為8.74±0.85，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，表明經(jīng)礦化誘導(dǎo)后的DPSCs具有成牙本質(zhì)細(xì)胞的特性。此外，DPSCs誘導(dǎo)14 d后，用ALP試劑盒染色，細(xì)胞局部增厚，染色明顯加深。誘導(dǎo)21 d后，用茜素紅染色，可見(jiàn)散在橙紅色礦化結(jié)節(jié)(圖 3)。

圖 3 DPSCs誘導(dǎo)分化后ALP和茜素紅染色結(jié)果(倒置顯微鏡， ×40)

2.2 DPSCs成牙本質(zhì)誘導(dǎo)分化中circRNAs表達(dá)譜差異分析

運(yùn)用R語(yǔ)言的limma對(duì)所有表達(dá)的circRNAs進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，在每組數(shù)據(jù)中選取|差異倍數(shù)|>2的circRNAs。與對(duì)照組相比，DPSCs誘導(dǎo)后有42 個(gè)基因上調(diào)，有101 個(gè)下調(diào)。散點(diǎn)圖顯示：DPSCs在成牙本質(zhì)誘導(dǎo)分化中circRNAs的表達(dá)情況，綠線(xiàn)表示差異2 倍的變化線(xiàn)，在軸線(xiàn)上方表示差異倍數(shù)>2的circRNAs，軸線(xiàn)下方表示差異倍數(shù)<-2的circRNAs(圖 4)。

圖 4 DPSCs成牙本質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)后circRNAs的差異表達(dá)

2.3 差異表達(dá)circRNAs靶基因的功能分析

對(duì)差異表達(dá)circRNAs的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，并對(duì)其進(jìn)行GO分類(lèi)和KEGG pathway分析。對(duì)GO結(jié)果(P<0.05)分析可得出：靶基因主要存在于胞漿、核質(zhì)等細(xì)胞內(nèi)；可以定位大分子的位置，調(diào)節(jié)分子載體、核質(zhì)載體等分子的活性；影響核質(zhì)運(yùn)輸，核轉(zhuǎn)運(yùn)，膽固醇代謝等生物學(xué)過(guò)程。KEGG分析結(jié)果(P<0.05)表明：對(duì)差異表達(dá)的circRNAs預(yù)測(cè)的靶基因進(jìn)行Pathway注釋?zhuān)渲兄饕婕胺核亟閷?dǎo)的蛋白質(zhì)水解、病毒、細(xì)菌感染途徑、癌癥途徑、甾體生物合成等途徑，也調(diào)控Wnt、PI3K-Akt和MAPK等多種信號(hào)通路。

3 討 論

目前，對(duì)患有慢性根尖周病的年輕恒牙，一種理想的治療方式是采用牙髓血運(yùn)重建術(shù)，應(yīng)用健康的牙髓組織代替壞死的牙髓組織，以促進(jìn)牙根的繼續(xù)發(fā)育，甚至牙髓再次出現(xiàn)活力[8]。DPSCs參與牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體的形成，使牙髓修復(fù)和再生成為可能[9]。前期課題組研究[10]發(fā)現(xiàn)，DPSCs具有較高的增殖率和礦化潛能，且DPSCs來(lái)源廣，在成年后DPSCs仍較易獲得。研究表明，DPSCs的生物學(xué)特性可以通過(guò)改變來(lái)促進(jìn)牙髓血管再生，Khayat等[11]將含有臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凝膠加入DPSCs中，發(fā)現(xiàn)組織再生能力增強(qiáng)；Chen等[12]將富血小板纖維蛋白加入DPSCs中，發(fā)現(xiàn)其成骨能力增強(qiáng)。

circRNAs是一類(lèi)獨(dú)特的RNA，由特殊的環(huán)剪接形成的穩(wěn)定結(jié)構(gòu)[4]，因此，circRNAs不易受RNase R的降解，由于其豐富、穩(wěn)定和細(xì)胞型特異性表達(dá)[5]，已成為基因調(diào)控和細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要因素，不僅在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中起重要的作用，還在疾病的發(fā)病機(jī)制中作為有效的miRNAs海綿起著關(guān)鍵的作用[6,13]。有研究表明，circRNAs可作為許多疾病診斷的理想生物標(biāo)志物，如動(dòng)脈粥樣硬化性血管性疾病、神經(jīng)紊亂、朊蛋白疾病、癌癥和阿爾茨海默氏病[13-14]。

目前已有大量的研究證實(shí)了circRNAs在牙源性干細(xì)胞向成骨分化中發(fā)揮了重要調(diào)控作用，且較為深入。Gu等[15]發(fā)現(xiàn)，PDLSCs向成骨分化時(shí)，有766個(gè)差異性circRNAs上調(diào)，690個(gè)circRNAs下調(diào)，這些差異表達(dá)的circRNAs的靶基因通過(guò)Wnt和MAPK信號(hào)通路促進(jìn)PDLSCs成骨分化。Li等[16]發(fā)現(xiàn)，Circular RNA CDR1as通過(guò)miR-7/GDF5/SMAD和p38 MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)PDLSCs的成骨分化，CDR1as或GDF 5的下調(diào)可抑制SMAD1/5/8和p38 MAPK的磷酸化，而上調(diào)miR-7則可降低SMAD 1/5/8和p38 MAPK的磷酸化。過(guò)表達(dá)的CircRNA CDR1as通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性的結(jié)合miR-7，上調(diào)GDF5來(lái)促進(jìn)PDLSCs的成骨分化。Du等[17]研究表明，在大鼠牙囊細(xì)胞(rat dental follicle cells rDFCs)成骨分化過(guò)程中，過(guò)表達(dá)的circFgfr2，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-133，激活MAPK和TFG-β信號(hào)通路，靶向上調(diào)BMP6來(lái)促進(jìn)rDFCs成骨。但circRNAs在DPSCs向成牙本質(zhì)分化中的研究尚少，它是如何影響DPSCs干性狀態(tài)的，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究采用磁珠分選技術(shù)分選出hDPSCs，并通過(guò)Arraystar芯片檢測(cè)DPSCs在成牙本質(zhì)向誘導(dǎo)分化過(guò)程中特異性表達(dá)的circRNAs，并探討其在DPSCs向成牙本質(zhì)分化中的作用。與常規(guī)培養(yǎng)的DPSCs相比，circRNAs在成牙本質(zhì)誘導(dǎo)分化中存在明顯差異。|差異倍數(shù)|>2的circRNAs有143 個(gè)，其中，有42 個(gè)circRNAs在成牙本質(zhì)誘導(dǎo)分化中高表達(dá)，提示差異性circRNAs可能在hDPSCs向成牙本質(zhì)誘導(dǎo)分化中發(fā)揮重要作用。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明，差異性的circRNAs主要參與泛素介導(dǎo)的蛋白質(zhì)水解、病毒、細(xì)菌感染途徑、癌癥途徑、甾體生物合成等途徑，也調(diào)控Wnt、PI3K-Akt和MAPK等多種信號(hào)通路。有研究表明，Wnt[10,15]和MAPK[15-17]通路在骨骼發(fā)育，甚至在PDLSCs的成骨分化中至關(guān)重要。研究發(fā)現(xiàn)，這些差異表達(dá)的circRNAs在其他領(lǐng)域中也有相關(guān)的研究，如Zhu等[18]研究發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0081001在骨肉瘤(osteosarcoma，OS)細(xì)胞系、組織和血清中顯著上調(diào)，表明hsa_circ_0081001可以作為OS患者診斷的標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。Lv等[19]研究發(fā)現(xiàn)：在髓母細(xì)胞瘤(medulloblastoma，MB)中，上調(diào)的circ-SKA3(hsa_circ_0029696)和circ-DTL(hsa_circ_0000179)通過(guò)調(diào)節(jié)宿主基因SKA3和DTL的表達(dá)來(lái)促進(jìn)髓母細(xì)胞體外增殖和侵襲，促進(jìn)MB發(fā)生和發(fā)展，可認(rèn)為是診斷MB潛在的生物標(biāo)志物及治療的新靶點(diǎn)。這與本研究中circRNAs調(diào)控癌癥途徑相符。在DPSCs向成牙本質(zhì)分化過(guò)程中，差異表達(dá)的circRNAs有可能激活Wnt、PI3K-Akt和MAPK通路或其他信號(hào)通路，調(diào)控細(xì)胞分化，使DPSCs獲得更強(qiáng)的分化能力，但這種推論有待進(jìn)一步證實(shí)。