李文晉，李健，盧曉軍，2，姜垚如，王靚，靳茜茜，王英元，孫俊紅

（1.山西醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001；2.包頭市公安局刑事偵查支隊，內(nèi)蒙古 包頭 014030）

死后間隔時間又稱死亡時間（postmortem interval，PMI），是指死亡發(fā)生距檢驗尸體的間隔時間。死亡時間推斷一直是法醫(yī)病理學(xué)研究及鑒定的重點和難點。傳統(tǒng)的PMI推斷主要依據(jù)死后尸體現(xiàn)象變化規(guī)律，其主觀性強，結(jié)果易受環(huán)境地域因素的干擾，準(zhǔn)確推斷死亡時間并不理想。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，核酸[1]（DNA、RNA）、代謝組學(xué)技術(shù)、紅外光譜技術(shù)[2-4]等也廣泛應(yīng)用到PMI推斷中。

蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，承擔(dān)著主要的生命活動。生命終止后，蛋白質(zhì)在水解酶以及腐敗細菌的作用下逐漸降解成氨基酸[5]。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的廣泛研究，其在推斷死亡時間方面也有所應(yīng)用。KWAK等[6]利用雙向電泳（two-dimensional electrophoresis，2-DE）和高效液相色譜-質(zhì)譜法（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）研究大鼠死后心肌、肝組織中的多種蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)其降解變化有一定規(guī)律，在法醫(yī)學(xué)PMI推斷中有一定價值。

隨著對蛋白質(zhì)組學(xué)的深入研究，于芯片上進行毛細管電泳在蛋白質(zhì)的分離分析中表現(xiàn)出了顯著優(yōu)勢。2100蛋白芯片技術(shù)集成多個實驗程序，包括樣品處理，分離染色、脫色，檢測和分析，與蛋白芯片試劑盒及2100生物分析儀（美國Agilent公司）結(jié)合使用，可以同時對多種蛋白質(zhì)進行分離和檢測。ZANCOLLI等[7]利用2100生物分析儀結(jié)合蛋白芯片技術(shù)研究了不同的毒蛇毒液，可根據(jù)蛋白質(zhì)譜的變化快速有效地對毒液的變異、毒蛇的類別等進行分類分析。目前，2100蛋白芯片技術(shù)在藥品、臨床檢測以及疾病診斷等[8-10]方面均有應(yīng)用。

本研究收集大鼠死后不同時間點肝組織，采用2100生物分析儀結(jié)合蛋白芯片檢測技術(shù)獲取死后肝組織蛋白質(zhì)表達譜，探索蛋白質(zhì)含量變化與死亡時間的關(guān)系，為推斷死亡時間尋找新的思路和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣本制備

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠8只，10～12周齡，體質(zhì)量250～300 g，由山西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。溫室飼養(yǎng)2 d后，腹腔注射戊巴比妥致死量（350 mg/kg）[11]處死大鼠，死后存放于16℃人工氣候箱。于死后0、1、2、3、5、7、9、12、15、18、21、24、27和30 d分別取每只大鼠肝組織200 mg，放入液氮中保存。每只大鼠肝組織樣本重復(fù)收集，每次收集完后閉合腹腔，并用塑料袋覆蓋，共收集112個樣本。收集的所有樣本保存至-80℃冰箱待檢。

本研究已獲山西醫(yī)科大學(xué)科學(xué)研究倫理審查委員會批準(zhǔn)。

1.2 蛋白質(zhì)提取

將肝組織在液氮中研磨成粉后置入微量離心管，管中加入純水700 μL、蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）7μL，冰上孵育1h，以12000×g離心15min（2-16PK臺式低溫離心機，美國Sigma公司），吸取上清液500μL放于新微量離心管中。從每只大鼠14個時間點的新微量離心管中分別吸取蛋白質(zhì)上清液35.7 μL，混合制成質(zhì)量控制（quality control，QC）樣本，共8個QC樣本。

1.3 蛋白芯片樣本的制備及檢測

根據(jù)Agilent蛋白質(zhì)230試劑盒（美國Agilent公司）說明書，4μL樣本混合2μL含二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）還原劑的樣品緩沖液，把樣本溶液和ladder放置在95℃水浴中加熱5 min（振蕩型恒溫金屬浴，中國奧盛儀器有限公司），加84μL去離子水進一步稀釋，從稀釋后溶液中取6 μL加載到蛋白芯片相應(yīng)的孔道中。

每個芯片加載10個樣本，將加載樣本的芯片置于2100生物分析儀中進行分析，約20～30 min后，得到每個樣本相對分子質(zhì)量在14 000～230 000的水溶性蛋白質(zhì)表達譜數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)預(yù)處理

使用2100生物分析儀自帶的2100 Expert專用軟件獲得蛋白質(zhì)凝膠電泳圖像（條帶）和電泳色譜圖（峰）。通過軟件中“overlap”“comparison”等功能，根據(jù)內(nèi)部標(biāo)記的“l(fā)ower marker”和“upper marker”對電泳色譜峰進行定標(biāo)識別、校正調(diào)整。為消除雜質(zhì)干擾，去除熒光強度在10 FU以下的峰。對所得峰高（蛋白質(zhì)含量）進行歸一化處理。

1.5 統(tǒng)計分析

使用SIMCA 14.1（瑞典Umetrics公司）對歸一化后的QC樣本、各時間點樣本的峰高數(shù)據(jù)進行主成分分析（principal component analysis，PCA），若與其他樣本能夠較好區(qū)分，說明實驗過程中樣本預(yù)處理和儀器分析條件穩(wěn)定，實驗數(shù)據(jù)可靠[12]，同時觀察各時間點樣本數(shù)據(jù)分組趨勢。利用SIMCA 14.1中的偏最小二乘-判別分析[13]（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）對所有樣本進行時間段劃分后，再對各時間段內(nèi)樣本進行PLS-DA分析。檢驗水準(zhǔn)α=0.05。評價PLS-DA模型質(zhì)量的3個指標(biāo)中，RX2表示模型概括X矩陣解釋率，RY2反映模型穩(wěn)定性，Q2反映模型預(yù)測性，若RX2、RY2、Q2的值大于0.5表示模型質(zhì)量良好，越接近1表明模型解釋率、穩(wěn)定性和預(yù)測性越好[14]。對PLS-DA模型進行200次響應(yīng)排序檢驗（response permutation testing，RPT），當(dāng)回歸線（R2）在y軸上的截距＞0，擬合線（Q2）在y軸上的截距＜0，且兩條線相交于第一象限表明模型質(zhì)量良好，未發(fā)生過擬合，且預(yù)測能力良好[15]。使用SPSS 24.0軟件（美國IBM公司）對各時間段及時間段內(nèi)不同死亡時間點的樣本分別進行Fisher判別分析[16]，每個時間點隨機選取6個樣本作為訓(xùn)練集，剩余2個樣本作為測試集，分別計算兩數(shù)據(jù)集的預(yù)測準(zhǔn)確性。Fisher判別結(jié)果采用典則判別評價。

2 結(jié) 果

2.1 蛋白質(zhì)表達譜峰特征

不同時間點的樣本譜峰（圖1A）形狀相近，大多數(shù)峰的位置相同但峰高不同，死后不同時間點同一譜峰的峰高變異系數(shù)大于0.3；同一時間點樣本（圖1C）在相同遷移時間下，色譜峰高相近，且峰高變異系數(shù)小于0.3。依遷移時間先后將識別的22個峰依次命名為P1～P22，每個峰代表相對分子質(zhì)量大小相近的蛋白質(zhì)混合物（表1）。

圖1 大鼠肝組織代表性蛋白芯片電泳色譜峰圖Fig.1 Representative protein chip electrophoresis chromatogram of rats liver tissue

表1 識別的22個峰及對應(yīng)的遷移時間Tab.1 22 peaks identified and corresponding migration time （n=8）

2.2 QC樣本分析

QC樣本單獨聚為一類（圖2），且與其他樣本能夠較好區(qū)分。

圖2 死后樣本與QC樣本PCA散點圖Fig.2 PCA scatter plot of QC samples and postmortem samples

2.3 建立死亡時間推斷模型

2.3.1 PLS-DA

根據(jù)圖2可以看出，0～9d樣本分離明顯，12～30d樣本聚集明顯。由于0 d樣本為大鼠死后立即取材，故將樣本重新分為A組（0 d）、B組（1～9 d）、C組（12～30d）。建立A組、B組、C組的PLS-DA模型，結(jié)果（圖3）顯示，可較好地區(qū)分各組樣本。模型的RX2為 0.859、RY2為0.937、Q2為0.899。

圖3 A組、B組、C組PLS-DA模型的散點圖Fig.3 PLS-DA scatter plot of group A,group B and group C

PLS-DA模型的方差分析顯示，A組、B組、C組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。RPT結(jié)果（圖4）顯示，回歸線（R2）與y軸交點大于0，擬合線（Q2）與y軸交點小于0，且兩條直線相交于第一象限，說明該模型未發(fā)生過擬合，且預(yù)測能力良好。

圖4 A組、B組、C組PLS-DA模型的RPTFig.4 RPT of PLS-DA model of group A,group B and group C

2.3.2 Fisher判別

對重新分組（A組、B組、C組）樣本進行Fisher判別，典則判別結(jié)果（圖5）顯示，各組能較好地區(qū)分。訓(xùn)練集和測試集的預(yù)測準(zhǔn)確率均為100%，訓(xùn)練集的內(nèi)部交叉驗證準(zhǔn)確率為100.0%。

圖5 3組Fisher判別結(jié)果Fig.5 Fisher discriminant result of 3 groups

B組、C組內(nèi)各時間點分別建立Fisher判別模型。B組的典則判別結(jié)果（圖6A）顯示，各時間點能較好地區(qū)分。訓(xùn)練集、測試集和訓(xùn)練集內(nèi)部交叉驗證預(yù)測的準(zhǔn)確率均為100%。C組的典則判別結(jié)果（圖6B）顯示，訓(xùn)練集的42個樣本中有40個樣本被正確分類，2個樣本被錯判，預(yù)測準(zhǔn)確率為95.2%；內(nèi)部交叉驗證中，42個樣本中有5個樣本被錯判，預(yù)測的準(zhǔn)確率為88.1%。測試集的14個樣本中，18 d的2個樣本被錯判到21d、24d，24d的1個樣本被錯判到18d，測試集預(yù)測的準(zhǔn)確率為78.6%。

圖6 B組（A）和C組（B）中各樣本的Fisher判別結(jié)果Fig.6 Fisher discriminant analysis result of each time point of group B（A）and group C（B）

3 討論

蛋白質(zhì)是機體的重要組成部分，機體死亡后，在多種蛋白水解酶及腐敗菌的作用下，機體蛋白質(zhì)成分逐漸分解成為氨基酸和小分子含氮物質(zhì)，含量逐漸減少直至消失[17]。目前，齊麟等[18]利用Western印跡法對蛋白質(zhì)進行定性、定量檢測，發(fā)現(xiàn)死亡后體內(nèi)微管蛋白的變化呈一定規(guī)律性，但傳統(tǒng)凝膠法耗時長，無法大規(guī)模、高通量地對蛋白質(zhì)進行全面篩查及鑒定。另外，KWAK等[6]利用HPLC-MS也發(fā)現(xiàn)了多種蛋白質(zhì)表達與PMI相關(guān)，雖然色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)所得數(shù)據(jù)信息可以更全面地反映死后時序性變化特點，但儀器昂貴、操作復(fù)雜等在一定程度上也限制了其在死亡時間推斷中的應(yīng)用。

2100生物分析儀是一個基于微流體毛細管電泳技術(shù)的完整系統(tǒng)，用于快速和自動化的蛋白質(zhì)分析。Agilent蛋白質(zhì)230試劑盒可用于分離和分析相對分子質(zhì)量在14 000～230 000的蛋白質(zhì)，分辨率為10%，與傳統(tǒng)的十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfonate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）相比有很多優(yōu)點：節(jié)省大量時間，良好的易操作性，出色的可重復(fù)性以及大幅減少危險試劑的使用[7]。此外，Agilent蛋白質(zhì)230試劑盒還具有可以從微量樣品中檢測蛋白質(zhì)、直接用生物樣品（血清、尿液、組織）快速、高通量進行分析的能力?？傊?，2100蛋白芯片技術(shù)高通量、準(zhǔn)確便捷、重復(fù)性好等特性可滿足不同PMI下多組織蛋白質(zhì)表達譜的檢測。

PLS-DA是一種有監(jiān)督的判別分類方法，其原理是在分類明確的條件下，根據(jù)觀察或測量到的若干變量值，對不同處理樣本（如觀測樣本、對照樣本）的特性分別進行訓(xùn)練，從而判斷未知樣本如何分類的常用統(tǒng)計分析方法[19]。本研究基于蛋白質(zhì)含量建立的PCA模型很難將14個時間點全部區(qū)分，結(jié)合法醫(yī)學(xué)實踐將死亡時間劃分為A組、B組、C組，建立的PLSDA模型較好，說明死后蛋白質(zhì)發(fā)生了變化，且隨著時間的推移，蛋白質(zhì)呈現(xiàn)一定的規(guī)律變化。

Fisher判別[20]是利用投影的數(shù)學(xué)思想，將高維的自變量沿一個合適的方向，使得組與組之間在低維空間盡可能分開的一種判別分析方法[21]，其作為經(jīng)典的判別分析，應(yīng)用范圍較廣泛。用Fisher判別驗證上述分組的準(zhǔn)確性，其模型的訓(xùn)練集及測試集的預(yù)測準(zhǔn)確率均為100.0%，訓(xùn)練集的內(nèi)部交叉驗證準(zhǔn)確率為100.0%，說明模型具有良好的可靠性和預(yù)測能力，此時間點劃分較為準(zhǔn)確。出現(xiàn)上述樣本聚集、分離分組情況的原因可能為死亡9d后蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物類型或含量相對穩(wěn)定，使得9 d后組間差異小于9 d前。此外，對B組和C組內(nèi)各時間點建立Fisher判別模型，B組訓(xùn)練集及測試集預(yù)測的準(zhǔn)確率均為100.0%，訓(xùn)練集的內(nèi)部交叉驗證準(zhǔn)確率為100.0%；C組組訓(xùn)練集及測試集預(yù)測的準(zhǔn)確率分別為95.2%、78.6%，訓(xùn)練集的內(nèi)部交叉驗證準(zhǔn)確率為88.1%。結(jié)果顯示，18～24d樣本錯判較多，原因可能是18～24 d內(nèi)蛋白質(zhì)降解產(chǎn)物組分相似，或是表達譜數(shù)據(jù)的個體差異顯現(xiàn)。

綜上所述，2100蛋白芯片技術(shù)可以快速簡捷、高量高效地獲取死后不同時間點大鼠肝組織相對分子質(zhì)量在14 000～230 000的水溶性蛋白質(zhì)表達譜，結(jié)合PLS-DA、Fisher判別等多維統(tǒng)計分析將死亡時間初步分為0 d、1～9 d和12～30 d，在此基礎(chǔ)上可進一步較好地區(qū)分1～9 d、12～30 d內(nèi)各個時間點的大鼠死亡時間，表明多維統(tǒng)計結(jié)合蛋白芯片技術(shù)可用于死亡時間推斷，為法醫(yī)學(xué)死亡時間的推斷提供新思路和方法。本研究目前采用動物模型作為研究對象，根據(jù)實踐需要，在今后的研究中應(yīng)該盡可能模擬并接近實際情況，考慮人類尸體與動物尸體的差異、尸體周圍環(huán)境（溫度、濕度等）、土壤特性等影響因素[22]；結(jié)合更多統(tǒng)計分析方法，建立更加可靠的數(shù)學(xué)模型；收集尸體樣本進行2100蛋白芯片分析，探究尸體樣本死后蛋白質(zhì)降解規(guī)律并探討該項技術(shù)在尸體樣本中的可行性，以提高死亡時間推斷的實踐性。