陳濤，陳鏡樓，黃文濤

(1.武漢市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院藥學(xué)部，武漢 430022； 2.江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)院，武漢 430056)

良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia，BPH)是中老年男性常見疾病，發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)而遞增[1]。WANG等[2]發(fā)現(xiàn)，在50歲以上的男性人群中超過半數(shù)患有不同程度的BPH。BPH涉及前列腺上皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞異常增殖，因此也是導(dǎo)致男性尿潴留、尿頻、排尿緩慢等下尿路癥狀(lower urinary tract symptoms，LUTS)的主要原因[3]。BPH的主要治療藥物包括α-腎上腺素受體阻斷劑和5α-還原酶抑制劑。然而這些藥物的長(zhǎng)期使用不僅會(huì)出現(xiàn)一系列不良反應(yīng)，而且將增加前列腺膠原沉積和纖維化的風(fēng)險(xiǎn)[4]。因此，包括植物源化合物在內(nèi)的植物療法越來越多地受到人們的關(guān)注。例如，在德國(guó)和奧地利，植物療法占所有治療BPH的90%以上[5]。葡萄籽和綠茶的多樣性生物活性已得到廣泛報(bào)道。表兒茶素沒食子酸酯[(-)-epicatechin gallate，ECG]是葡萄籽中的主要黃烷-3-醇單體，同時(shí)也是綠茶中含量第二的茶多酚，具有功能性拮抗雄激素從而抑制前列腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用[6-7]。然而，ECG對(duì)BPH的防治作用和具體藥理作用機(jī)制仍有待闡明，作者擬探討ECG對(duì)BPH大鼠雄激素受體(androgen receptors，AR)、雌激素受體(estrogen receptor，ER)-α/β、促炎細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1試藥 表兒茶素沒食子酸酯[(-)-Epicatechin gallate，ECG，上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)：C1701078，純度>98%]。丙酸睪酮注射液(天津金耀藥業(yè)有限公司，批號(hào)：150822，1 mL:25 mg)。AR一抗(武漢博士德生物工程有限公司，批號(hào)：11D53)。ER-α(批號(hào)：ab32063)和I型膠原(Collagen-I，Col-I，批號(hào)：ab34710)一抗購于英國(guó)abcam公司。ER-β一抗(美國(guó)proteintech公司，批號(hào)：14007-1-AP)。白細(xì)胞介素(IL)-1β(批號(hào)：RA20020)，IL-6(批號(hào)：RA20607)，腫瘤壞死因子(TNF)-α(批號(hào)：RA20035)，環(huán)氧合酶(Cyclooxygenase，COX)-2(批號(hào)：RA20086)，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF，批號(hào)：RA20124)，堿性成纖維細(xì)胞生因子(basic fibroblast growth factor，βFGF，批號(hào)：RA20438 )，胰島素樣生長(zhǎng)因子(insulin-like growth factor，IGF)-I(批號(hào)：RA20613)和表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF，批號(hào)：RA20431 )檢測(cè)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)試劑盒購于武漢貝茵萊生物科技有限公司。PCR 引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2儀器 CFX-Connect 96型熒光定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；JY045-3C型凝膠成像系統(tǒng)(北京君意電泳設(shè)備有限公司)；Icen-24R型離心機(jī)(杭州奧盛儀器有限公司)；RT-6100型酶標(biāo)儀(深圳雷杜生命科學(xué)有限公司)。

1.3動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Wistar大鼠，購于三峽大學(xué)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：42010200000847；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(鄂)2011-0012，180～200 g。飼養(yǎng)環(huán)境為12 h/12 h晝夜節(jié)律、溫度(22±3)℃、相對(duì)濕度(50±10)%。

1.4動(dòng)物分組與造模 大鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，隨機(jī)分為4組(每組各6只)：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、ECG大劑量組和ECG小劑量組。大鼠BPH模型采用文獻(xiàn)[8]報(bào)道的方法建立，大鼠經(jīng)350 mg·kg-1水合氯醛麻醉后切開下腹部，去除睪丸(去勢(shì))并縫合?；謴?fù)3 d后，大鼠每日皮下注射10 mg·kg-1丙酸睪酮(1：3橄欖油)，連續(xù)注射4周。正常對(duì)照組大鼠切開下腹部后隨即縫合(假手術(shù))，并每日皮下注射等體積的橄欖油(丙酸睪酮溶媒)。ECG組同時(shí)連續(xù)4周每日灌胃給予300或100 mg·kg-1的ECG，給藥劑量參考文獻(xiàn)[9]設(shè)定。

1.5前列腺指數(shù) 4周實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束后記錄大鼠體質(zhì)量，收集前列腺組織稱質(zhì)量，分割并計(jì)算前列腺指數(shù)PI。PI(mg·g-1)=前列腺質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.6前列腺形態(tài)學(xué)變化 部分前列腺組織用4%多聚甲醛在4 ℃浸泡固定、石蠟包埋、組織切片，分別采用蘇木精-伊紅(HE)染色觀察形態(tài)學(xué)變化、Masson染色觀察膠原沉積情況、PCNA染色觀察前列腺增殖情況，于200倍顯微鏡下觀察攝相并標(biāo)注標(biāo)尺100 μm。

1.7前列腺組織促炎細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子水平 部分前列腺組織用4℃0.9%氯化鈉溶液制備組織勻漿，用于檢測(cè)前列腺IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、VEGF、βFGF、IGF-I和EGF水平，操作步驟均依照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8前列腺組織Col-1A1、Col-3A1、AR和ER-α/β水平 部分前列腺組織用于免疫組織化學(xué)檢測(cè)前列腺AR和ER-α/β的表達(dá)水平。部分組織用Trizol試劑提取RNA，采用SYBR Green PCR試劑盒于熒光定量PCR儀進(jìn)行。RNA相對(duì)水平采用2-△△Ct公式計(jì)算，GAPDH為內(nèi)參。引物序列見表1。

表1 引物序列表

2 結(jié)果

2.1大鼠前列腺指數(shù) 各組大鼠之間的初始體質(zhì)量和終體質(zhì)量均差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠前列腺相對(duì)質(zhì)量、PI差異均有顯著性上升(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，連續(xù)4周的ECG干預(yù)能夠顯著性降低前列腺PI(P<0.01)。見表2。

2.2大鼠前列腺形態(tài)學(xué)變化 相對(duì)于正常對(duì)照組，模型對(duì)照組大鼠前列腺上皮有明顯增厚和乳頭狀突起。Masson染色顯示BPH大鼠前列腺存在明顯膠原沉積(藍(lán)色)。從PCNA染色可以看出，BPH大鼠前列腺細(xì)胞增殖明顯。相對(duì)于模型對(duì)照組，ECG能夠有效改善在丙酸睪酮誘導(dǎo)的前列腺上皮增生和膠原沉積。見圖1。

表2 4組大鼠體質(zhì)量和PI水平

組別劑量/(mg·kg-1)初體質(zhì)量終體質(zhì)量gPI/(mg·g-1)正常對(duì)照組-190.0±5.5379.2±5.12.13±0.18①模型對(duì)照組-189.3±5.7373.7±6.74.76±0.18 ECG 小劑量組100189.2±6.3375.5±6.03.65±0.22① 大劑量組300190.3±6.6376.3±5.43.27±0.20①F值0.0500.926182.928

2.3大鼠前列腺組織促炎細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子水平 與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠前列腺促炎細(xì)胞因子(IL-1β、IL-6、TNF-α和COX-2)以及生長(zhǎng)因子(VEGF、βFGF、IGF-I和EGF)水平均顯著上升(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，ECG在300和100 mg·kg-1的給藥劑量下均能顯著性降低促炎細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子的水平(P<0.05)。見表3。

圖1 4組大鼠前列腺HE、Masson和PCNA染色(×200)

2.4大鼠前列腺組織Col-I、AR、ER-α/β水平 免疫組化檢測(cè)結(jié)果表明模型對(duì)照組前列腺組織AR和ER-α表達(dá)相對(duì)于正常對(duì)照組增強(qiáng)，而ER-β表達(dá)降低。相對(duì)于模型對(duì)照組，ECG干預(yù)能夠降低前列腺AR和ER-α表達(dá)，提高ER-β表達(dá)。見圖2。

與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠前列腺Col-1A1、Col-3A1、AR和ER-α的mRNA水平均顯著性(P<0.01)上升，而ER-β的mRNA水平明顯(P<0.01)下降。與模型對(duì)照組比較，連續(xù)4周的ECG干預(yù)(300或100 mg·kg-1)能夠顯著性降低大鼠前列腺Col-1A1、Col-3A1、AR和ER-α的mRNA水平(P<0.01)。同時(shí)，ECG能顯著性升高ER-β的mRNA水平(P<0.05)。見表4。

3 討論

BPH的分子機(jī)制仍不清楚，性激素穩(wěn)態(tài)被認(rèn)為與BPH的發(fā)展密切相關(guān)[10]。雄激素和雌激素的水平，以及雄激素/雌激素比例對(duì)維持前列腺的生理功能和腺體生長(zhǎng)至關(guān)重要[11]。丙酸睪酮以及其體內(nèi)代謝產(chǎn)物二氫睪酮通過與AR結(jié)合促進(jìn)前列腺細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活[12]。而雌激素能夠通過與不同類型的ER結(jié)合而發(fā)揮促進(jìn)或抑制前列腺增生的作用[10,13]。ER-α的激活導(dǎo)致細(xì)胞增殖和炎癥。相反，ER-β具有抗增殖和促凋亡的作用[14]。ER-β不僅通過下調(diào)AR信號(hào)抑制性激素介導(dǎo)的前列腺上皮細(xì)胞增殖和分化，而且參與調(diào)控免疫系統(tǒng)功能[15]。而細(xì)胞凋亡和炎癥在控制細(xì)胞生長(zhǎng)和維持前列腺大小方面起著至關(guān)重要的作用[5]。PCNA被認(rèn)為是增殖的組織學(xué)標(biāo)志物，其表達(dá)增加與前列腺增生正相關(guān)[10]。選擇性激動(dòng)ER-β下調(diào)，而激動(dòng)ER-α上調(diào)PCNA的表達(dá)[12]。

表3 4組大鼠前列腺IL-1β、IL-6、TNF-α、COX-2、VEGF、βFGF、IGF-I和EGF水平

Tab.3 The levels of IL-1β，IL-6，TNF-α，COX-2，VEGF，βFGF，IGF-I and EGF in the prostates in four groups of rats

組別劑量/(mg·kg-1)IL-1βIL-6TNF-αCOX-2VEGFβFGFIGF-IEGF正常對(duì)照組-90.20±9.07①46.86±5.69①197.78±16.76①151.98±10.64①24.39±5.92①2.14±0.50①788.00±51.74①55.41±9.13①模型對(duì)照組-175.85±14.24101.01±11.65517.18±41.14296.71±23.1091.10±11.994.98±1.012127.20±190.23162.57±11.08 ECG 小劑量組100145.25±15.98①82.43±11.60②407.33±36.28①243.34±19.62①75.62±8.98①3.66±0.41①1789.16±113.65①127.59±12.68① 大劑量組300133.03±10.32①71.28±7.97①350.68±35.92①232.19±20.23①55.05±8.65②2.99±0.62②1534.17±118.00①97.43±10.91①F值46.74833.57392.71759.51359.71218.757118.212102.189

圖2 4組大鼠前列腺AR、ER-α/β免疫組化檢測(cè)結(jié)果(×200)

表4 4組大鼠前列腺Col-1A1、Col-3A1、AR和ER-α/β的mRNA水平

此外，前列腺促炎細(xì)胞因子可促進(jìn)局部生長(zhǎng)因子的產(chǎn)生和血管生成[16]。有證據(jù)表明，BPH進(jìn)程中雄激素、雌激素和生長(zhǎng)因子之間相互關(guān)聯(lián)。基質(zhì)細(xì)胞通過生長(zhǎng)因子信號(hào)通路激活對(duì)雄激素敏感的基因，從而調(diào)節(jié)前列腺上皮細(xì)胞增殖和凋亡[5]。雄激素也被證明能夠通過結(jié)合AR調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子，進(jìn)而控制前列腺的生長(zhǎng)[12]。雌激素信號(hào)通過促進(jìn)bFGF、EGF和IGF-1的合成，間接影響上皮細(xì)胞增生，刺激前列腺增大[17]。其中，F(xiàn)GF和EGF具有通過促進(jìn)有絲分裂和血管生成活性，而增加前列腺體積的作用[18-19]。IGF由肝臟分泌，能夠誘導(dǎo)包括前列腺上皮細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞增殖、存活和遷移[20]。

基于干預(yù)性激素和生長(zhǎng)因子水平，從天然植物中尋找潛在的防治BPH化合物是可行的研究思路[21]。本研究結(jié)果表明ECG能夠通過抑制前列腺局部炎癥和血管生成、減少AR和ER-α表達(dá)、增加ER-β表達(dá)而改善大鼠BPH和膠原沉積。