石海林，何天基，劉 峰，蔡孟會(huì)，葛 波，*

(1．桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科，廣西 桂林541001；2．桂林醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院泌尿外科，廣西 桂林 541199)

膀胱癌是常見惡性腫瘤之一，據(jù)估計(jì)2020 年美國將新確診81 400 例膀胱癌，同期約有17 980 人死于此疾病[1]，其中肌層浸潤性膀胱癌(muscle-invasive bladder cancer，MIBC)(即T 分期≥T2)占比超過25%，在過去的30 多年里其標(biāo)準(zhǔn)治療方式仍為膀胱癌根治術(shù)，但術(shù)后的生活質(zhì)量差，術(shù)后5 年生存率小于30%[2]，而隨著免疫治療的不斷應(yīng)用，使得部分腫瘤患者生存率得到較大幅度的提高。免疫治療的代表藥物有PD- 1/PD- L1 等免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)，自2016 年至今，F(xiàn)DA 已批準(zhǔn)超過5個(gè)ICIs用于部分MIBC/轉(zhuǎn)移性膀胱癌的免疫治療[3]，臨床上多采用檢測PD-L1/腫瘤比例評分(tumor proportion score，TPS)的表達(dá)來判斷和預(yù)測免疫治療的有效性，但其患者療效反應(yīng)仍小于25%，因此開發(fā)預(yù)測免疫療效的生物標(biāo)志物成為重要的研究熱門方向[4]。腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden，TMB)是在腫瘤樣品中基因的外顯子編碼區(qū)每百萬堿基中發(fā)生置換和插入/缺失突變的總數(shù)[5]，是判斷腫瘤免疫治療療效的新興生物標(biāo)志物，突變總數(shù)越多其被免疫系統(tǒng)識別越高，免疫療效則更佳。研究表明高TMB可提高非小細(xì)胞肺癌和乳腺癌等實(shí)體瘤免疫治療的生存期[6-7]，相關(guān)研究顯示膀胱癌的突變率高居第三，但眾多的基因突變與TMB 和免疫應(yīng)答之間的關(guān)系在MIBC 中尚不明確[8-9]，因此本文通過癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas，TCGA)測序數(shù)據(jù)分析TMB與免疫應(yīng)答預(yù)后的關(guān)系，有望發(fā)現(xiàn)可預(yù)測MIBC 免疫治療療效的生物標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

TCGA 官網(wǎng)(https://cancergenome.nih.gov/)下載膀胱癌測序數(shù)據(jù)(V22.0)，得到414 例膀胱癌測序數(shù)據(jù)和19例正常膀胱組織的數(shù)據(jù)及相關(guān)臨床信息，同樣從TCGA數(shù)據(jù)庫下載膀胱癌的測序突變數(shù)據(jù)。

1.2 MIBC的TMB分析

使用R軟件中的“maftools”包對所下載的突變數(shù)據(jù)進(jìn)行可視化，每個(gè)MIBC 樣本的TMB 表達(dá)量是通過將突變總數(shù)/目標(biāo)編碼區(qū)域的大小來計(jì)算的，通過PERL(https://www.perl.org/get.html)語言提取TMB 的表達(dá)量，結(jié)合患者的生存時(shí)間、生存狀態(tài)及相關(guān)臨床信息進(jìn)行分析；從ImmPort 數(shù)據(jù)庫(https://www.immport.org/)下載參與免疫活動(dòng)過程的免疫相關(guān)基因，結(jié)合利用“Limma”包找出高低TMB 分組后的差異表達(dá)顯著的基因，取兩者交集后得到免疫相關(guān)基因(設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)為log2FC＞2及|log2FC|＞2)；采用“Survival”包對得到的差異表達(dá)的免疫相關(guān)基因進(jìn)行單、多變量COX回歸分析及總生存分析(overall survival，OS)；利用GEPIA2 數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)對差異表達(dá)的免疫基因進(jìn)行無疾病生存分析(disease-free survival，DFS)；將得到COX模型行Kaplan-Meier 生存分析，以曲線下面積(receiver operating characteristic，ROC)判斷模型的準(zhǔn)確性；最后采用oncomine 數(shù)據(jù)(https://www.oncomine.org/resource/main.html)跟HPA(https://www.proteinatlas.org/)數(shù)據(jù)庫對OS及DFS均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3 免疫細(xì)胞與TMB亞型之間的相關(guān)性

應(yīng)用CIBERSORT 算法計(jì)算浸潤免疫細(xì)胞的表達(dá)量，該算法是采用反卷積算法來計(jì)算22種腫瘤中浸潤的免疫細(xì)胞的表達(dá)量[10]，其準(zhǔn)確性已通過流式細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)在肝癌、乳腺癌等癌癥中驗(yàn)證，當(dāng)P值＜0.05時(shí)認(rèn)為免疫細(xì)胞的表達(dá)量差異是有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

我們以總突變頻率數(shù)表達(dá)量的中位值為標(biāo)準(zhǔn)，將患者分為高、低TMB兩組，結(jié)合生存狀態(tài)及時(shí)間進(jìn)行Kaplan-Meier 生存曲線分析，并通過對數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行比較，采用單因素方差分析、Tukey 多重比較檢驗(yàn)和未配對雙尾t檢驗(yàn)分析臨床病理特征與相應(yīng)TMB 的相關(guān)性，單、多因素COX回歸分析差異表達(dá)的基因進(jìn)行預(yù)后分析。通過未配對t檢驗(yàn)評估高TMB 組和低TMB組浸潤免疫細(xì)胞的差異。具體標(biāo)準(zhǔn)為校正后P值(false discovery rate，F(xiàn)DR)＜0.01 和 差 異 倍 數(shù)(fold change，F(xiàn)C)＞2，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 MIBC體細(xì)胞突變特征

我們通過TCGA 數(shù)據(jù)庫官網(wǎng)下載得到414 例膀胱癌及19 例正常組織信息，其中375 例MIBC 患者(已剔除≤T1的5例及T分期未知的34例)信息，將突變數(shù)據(jù)可視化后可知超過97%(364/375)MIBC 患者存在突變(圖1A)，說明MIBC 突變頻率非常高，其中錯(cuò)義突變、無義突變、單核苷酸變異(SNP)和C＞T 突變較多，突變基因排在前10 位的分別為TP53、TTN、KMT2D、MUC16、ARID1A、KDM6A、SYNE1、PIK3CA、RB1、RYR2，見圖1B～G。

2.2 MIBC的TMB生存預(yù)后及臨床相關(guān)性

以375 例MIBC 患者TMB 中位值分為兩組，其中低TMB 組為184 例，高TMB 組191 例，采用R 軟件的Survival 包行Kaplan-Meier 分析評價(jià)TMB 在MIBC 中與生存預(yù)后的相關(guān)性，可知高TMB 組患者生存期較低TMB組更長(P＜0.01)，說明高TMB可能使MIBC患者接受免疫治療效果更佳。MIBC 患者結(jié)合相關(guān)臨床信息進(jìn)行相關(guān)性分析可知，在年齡分組(65 歲為界)、性別、腫瘤組織學(xué)分級(高低級)各組之間的TMB 表達(dá)量差異明顯，均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而TMB 的表達(dá)與MIBC 患者吸煙、TNM 分期、臨床分期等未見明顯相關(guān)關(guān)系(P＞0.05)(圖2A～D)。另外按TMB 表達(dá)量進(jìn)行分組，利用Limma 包進(jìn)行分析，Pheatmap 包進(jìn)行可視化，得到231 個(gè)差異表達(dá)的基因。將差異表達(dá)基因結(jié)合ImmPort 數(shù)據(jù)庫下載得到的2 498 個(gè)免疫功能基因，取交集后得到75 個(gè)具有差異表達(dá)的免疫功能基因，再對預(yù)后因素進(jìn)行單因素COX 回歸分析得到12個(gè)與預(yù)后密切相關(guān)的免疫功能基因(CD1A、IFNG、KIR2DL4、CXCL14、CXCL11、MARCO、CMA1、CRH、NRG1、RLN1、IL1RL1、SSTR5)，然后進(jìn)行多因素COX 回 歸 得 到 高 表 達(dá)SSTR5[95%CI(0.304，0.918)]、KIR2DL4[95%CI(0.481，0.917)]的患者生存預(yù)后更佳，而低表達(dá)IL1RL1[95%CI(1.023，1.436)]的患者預(yù)后更佳(P＜0.05，圖2E～G)。

圖1 MIBC遺傳突變

圖2 TMB預(yù)后分析與臨床信息的相關(guān)性分析

2.3 免疫基因的數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證

GEPIA2 數(shù)據(jù)庫結(jié)果提示高表達(dá)KIR2DL4及低表達(dá)白介素1 受體樣1(IL1RL1)的患者無疾病生存期更長，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖3A 和3B)；以環(huán)狀肽激素生長抑素受體(SSTR5)、KIR2DL4及IL1RL1構(gòu)建的COX 風(fēng)險(xiǎn)模型得到低風(fēng)險(xiǎn)組生存時(shí)間更長(P＜0.001)，ROC為0.71，表明該模型準(zhǔn)確性較好(圖3C和3D)。將KIR2DL4和IL1RL1免疫相關(guān)基因分別在Oncomine及HPA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行驗(yàn)證，KIR2DL4基因及其所編碼的蛋白在腫瘤組織中明顯高表達(dá)，而IL1RL1及其編碼的蛋白在MIBC 染色強(qiáng)度顯著低于癌旁組織，得到IL1RL1在MIBC 組織中的表達(dá)顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3E和3F)。

2.4 TMB富集分析

將所得到的差異表達(dá)基因進(jìn)行富集分析，用“Limma”包分析TMB 相關(guān)的MIBC 差異表達(dá)基因，得到上調(diào)基因83 個(gè)，下調(diào)基因148 個(gè)。通過GO(gene ontology)功能富集分析可知在生物過程(molecular function，BP)中主要為體外配對組織、第二信使介導(dǎo)、淋巴細(xì)胞趨化性、白細(xì)胞正性調(diào)節(jié)等功能；細(xì)胞成分(cellular component，CC)中主要為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔、囊腔等；分子功能(biological process，MF)中主要為受體配體活性、肌動(dòng)蛋白結(jié)合、糖胺聚糖結(jié)合、生長因子活性等功能(圖4A)，表明相關(guān)基因深度參與機(jī)體的免疫反應(yīng)。在KEGG 富集分析中確定差異表達(dá)基因最豐富的途徑，包括細(xì)胞因子細(xì)胞蛋白受體內(nèi)含子、趨化因子信號通路、鈣信號通路、cGMP-PKG 信號通路、腫瘤相關(guān)通路等(圖4B)。

圖3 免疫基因的數(shù)據(jù)庫驗(yàn)證

圖4 TCGA數(shù)據(jù)庫中MIBC基因富集圖

2.5 TMB與免疫細(xì)胞相關(guān)性

在腫瘤突變過程中往往形成更多的新抗原，使腫瘤具有更高的免疫原性。GO 富集分析表明差異表達(dá)基因參與腫瘤微環(huán)境的免疫過程，但腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞眾多，我們可以采用CIBERSORT 算法計(jì)算浸潤免疫細(xì)胞的分?jǐn)?shù)，結(jié)果表明，與正常膀胱組織比較，高TMB 組的腫瘤CD8+T 細(xì)胞、活化的CD4+T 細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)較高，而在低TMB 組中記憶B細(xì)胞及未活化的肥大細(xì)胞表達(dá)比例較高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖5)。

圖5 高、低TMB組與浸潤免疫細(xì)胞的相關(guān)性

3 討 論

腫瘤的發(fā)生是體細(xì)胞突變不斷積累的結(jié)果，突變的類型主要包括非同義突變、同義突變、插入或刪除和堿基錯(cuò)配，實(shí)際上在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中基本都具有非同義突變，在不同的腫瘤類型中遺傳改變的頻率有明顯的差異，由于突變后會(huì)增加免疫原性，但為避免被免疫系統(tǒng)檢測并清除，因此腫瘤往往上調(diào)免疫檢查點(diǎn)[11]。而驅(qū)動(dòng)基因突變可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，使大量的體細(xì)胞突變可以產(chǎn)生新抗原，新抗原可以激活CD8+的細(xì)胞毒性T 細(xì)胞，從而發(fā)揮T 細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)。因此，當(dāng)基因變異數(shù)目累積增多時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生更多的新抗原，進(jìn)而被免疫系統(tǒng)識別的可能性就越大，對于免疫治療，癌細(xì)胞TMB越高，可能產(chǎn)生的新抗原越多，腫瘤的抗原免疫原性越高，T 細(xì)胞反應(yīng)和抗腫瘤反應(yīng)越強(qiáng)，更加適合免疫治療[12]；既往研究顯示，在接受PD-1/PD-L1 免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的患者，與TMB密切相關(guān)的非同義突變數(shù)量與腫瘤的客觀緩解率(ORR)、持續(xù)臨床獲益時(shí)間及無進(jìn)展生存期(PFS)的改善均呈正相關(guān)；TMB 最初是在使用Ipilimumab 或Tremelimumab 治療晚期黑色素瘤患者時(shí)作為預(yù)測療效的生物標(biāo)記物，發(fā)現(xiàn)擁有高水平TMB的黑素色瘤和非小細(xì)胞肺癌患者對PD-1/PD-L1 免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療效往往高于低水平TMB 表達(dá)的患者[13]。當(dāng)前研究大多只將TCGA 膀胱癌數(shù)據(jù)粗略進(jìn)行分析，但尚未有單獨(dú)進(jìn)行MIBC的研究，TCGA數(shù)據(jù)庫在TNM 分期上以MIBC 患者占大多數(shù)，因此MIBC 與TMB 的關(guān)系尚不清楚[14-15]。本次研究375 例MIBC 患者中97%患者存在突變，說明MIBC 患者中突變頻率非常高，其中錯(cuò)義突變、無義突變、單核苷酸變異(SNP)和C＞T 突變占較多，最常見的5 個(gè)突變基因是TP53、TTN、KMT2D、MUC16和ARID1A。TP53是 抑 癌 基因，通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期從而抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展[16]；TTN為編碼肌節(jié)的肌聯(lián)蛋白基因，與擴(kuò)張型心肌病可能存在關(guān)聯(lián)，但在腫瘤發(fā)生過程的作用尚有待進(jìn)一步研究[17]；KMT2D是一種調(diào)節(jié)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的相關(guān)蛋白，在膀胱癌中，KMT2D作為腫瘤抑制因子，其突變可導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的存活、遷移和侵襲[18]；MUC16是一種跨膜蛋白，可能參與腫瘤的轉(zhuǎn)移[19]；ARID1A(AT 豐富結(jié)合域1A)基因，是染色質(zhì)重塑復(fù)合物SWI/SNF 的核心亞基，參與DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、修復(fù)等過程，并和組蛋白共價(jià)修飾復(fù)合物等進(jìn)行染色質(zhì)重塑，與抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，有研究數(shù)據(jù)表明，當(dāng)ARID1A 發(fā)生失活變異時(shí)，可導(dǎo)致錯(cuò)配修復(fù)(MMR)蛋白功能被削弱，具有致癌作用，ARID1A 失活突變可導(dǎo)致TMB 升高，促進(jìn)CD8+T 細(xì)胞浸潤和PD-L1 表達(dá)，提示失活突變所導(dǎo)致的免疫微環(huán)境變化更利于免疫治療[20]。因此，TMB水平高的患者產(chǎn)生新抗原多，腫瘤會(huì)被大量特異性T細(xì)胞攻擊，抗PD-1治療可以使腫瘤T細(xì)胞反應(yīng)得以更充分的發(fā)揮，因此高水平TMB的腫瘤患者對抗PD-1 治療更敏感，TMB 已經(jīng)被證明與ICIs 治療黑色素瘤、肺癌等的臨床療效相關(guān)，被認(rèn)為是各種類型免疫治療反應(yīng)的獨(dú)立預(yù)測因子，相關(guān)臨床指南也推薦TMB可作為預(yù)測免疫治療的標(biāo)志物[21]。

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)375例MIBC患者中高水平TMB 會(huì)影響MIBC 的預(yù)后，可增強(qiáng)免疫治療效能，高TMB可能反映了存在突變相關(guān)的新抗原，可增加淋巴細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境中的浸潤，從而提高免疫抗腫瘤效應(yīng)，這與靶向藥物的有效性和臨床結(jié)果密切相關(guān)[22]。隨著年齡的增長、男性患者及腫瘤分級較高的MIBC患者TMB 較高；年齡增長導(dǎo)致體細(xì)胞突變頻率更高，而男性患者可能因較多雄激素而出現(xiàn)TMB升高，但還有待進(jìn)一步研究。另外我們還在低TMB組和高TMB組之間鑒定出了231 個(gè)差異表達(dá)基因(83 個(gè)上調(diào)和148 個(gè)下調(diào))，其中高表達(dá)SSTR5、KIR2DL4的患者生存預(yù)后更佳，而低表達(dá)IL1RL1的患者預(yù)后可能較佳，并進(jìn)行GO跟KEGG富集分析，發(fā)現(xiàn)許多基因涉及免疫應(yīng)答和趨化因子信號通路，這些結(jié)果表明，TMB及這些TMB相關(guān)基因與腫瘤微環(huán)境的變化密切相關(guān)[23-24]。SSTR5廣泛分布于人體的所有組織中，通過改變第二信使(如cAMP)的水平，或通過激活離子通道，改變細(xì)胞內(nèi)鈣水平來實(shí)現(xiàn)抗增殖作用，從而導(dǎo)致蛋白酪氨酸磷酸酶誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯或凋亡抑或通過抑制生長因子的釋放來實(shí)現(xiàn)腫瘤抑制，當(dāng)SSTR5 高表達(dá)時(shí)可抑制腫瘤生長[25]。自然殺傷(NK)細(xì)胞表面的免疫球蛋白樣受體2DL4(KIR2DL4)，抑制其與配體人白細(xì)胞抗原G 的結(jié)合增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷功能從而抑制細(xì)胞增殖[26-27]。白介素1 受體樣1(IL1RL1)由328 個(gè)氨基酸組成，可被促炎因子刺激誘導(dǎo)，并可能參與輔助T 細(xì)胞的功能，與白細(xì)胞介素1受體I型(IL1R1)、II型(IL1R2)和白細(xì)胞介素1受體樣2(IL1RL2)在2q12染色體上形成細(xì)胞因子受體基因簇，該基因的可變剪接導(dǎo)致多個(gè)轉(zhuǎn)錄本變異，參與機(jī)體多種炎性免疫反應(yīng)，與腫瘤的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，通過影響腫瘤免疫微環(huán)境，并可能直接在腫瘤細(xì)胞表面表達(dá)而直接影響細(xì)胞的生物學(xué)行為，其在腫瘤中的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究[28]。

腫瘤中免疫細(xì)胞浸潤是腫瘤的一個(gè)特征，許多惡性腫瘤都有一個(gè)復(fù)雜的趨化因子網(wǎng)絡(luò)，影響這種免疫細(xì)胞的程度和表型，以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、轉(zhuǎn)移[27]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，與正常膀胱細(xì)胞相比，高TMB組的MIBC中CD8+T細(xì)胞、活化的CD4+T細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)較高，而在低TMB組中記憶B 細(xì)胞及未活化的肥大細(xì)胞表達(dá)比例較高，這與目前相關(guān)研究基本一致，但需大規(guī)模實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證[28]。這些結(jié)果表明TMB能影響免疫細(xì)胞的浸潤，新抗原可吸引免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞；因此，建立一個(gè)癌癥-免疫系統(tǒng)平衡對機(jī)體保持健康至關(guān)重要。CD8+T細(xì)胞在特定條件下可分化為裂解效應(yīng)細(xì)胞，增加γ-干擾素(IFNγ)、Fas 配體(FASL)、顆粒B 的表達(dá)，抑制腫瘤細(xì)胞增殖[29]。腫瘤微環(huán)境中T淋巴細(xì)胞的高浸潤與MIBC患者生存呈正相關(guān)，嗜酸性粒細(xì)胞參與介導(dǎo)組織損傷修復(fù)，維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定等多種功能，其所分泌的多種細(xì)胞因子與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[30-31]；而肥大細(xì)胞可能有助于腫瘤血管生成，在腫瘤生長中起重要作用，低TMB組肥大細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，但高TMB 中產(chǎn)生新的抗原可能干擾腫瘤增殖[32]，這些研究表明TMB的水平高低與免疫微環(huán)境變化密切相關(guān)。

本研究通過TCGA 數(shù)據(jù)庫分析表明免疫治療在高TMB 的MIBC 患者中可能具有較好的預(yù)后，存在較大的潛在臨床應(yīng)用價(jià)值；發(fā)現(xiàn)了可能影響免疫細(xì)胞浸潤的TMB 相關(guān)基因，初步解析免疫細(xì)胞在MIBC 腫瘤微環(huán)境中的差異表達(dá)，以此為MIBC 的免疫治療在臨床上的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)，但尚需更大規(guī)模、前瞻性、多中心的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步證實(shí)。