羅濱林，張軒龍，姚剛

(南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院整形燒傷外科，南京 210029)

皮膚外傷所引起的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)分泌是瘢痕修復(fù)的主要病理特征。正常情況下，瘢痕修復(fù)的病理過程處于平衡狀態(tài)，一旦平衡被打破，則會導(dǎo)致成纖維細(xì)胞的過度激活及膠原纖維的過度堆積。目前，瘢痕修復(fù)是臨床瘢痕治療的難題之一，主要采用外科手術(shù)、藥物注射(激素或抗腫瘤藥物)、硅凝膠或硅酮貼等方法進(jìn)行瘢痕修復(fù)，但這些手段具有一定的局限性，且治療后仍有復(fù)發(fā)可能[1-4]。微RNA(microRNA，miRNA/miR)是一類在細(xì)胞代謝、分化、增殖和凋亡過程中起重要調(diào)控作用的非編碼小分子單鏈RNA，其異常轉(zhuǎn)錄常能夠改變正常細(xì)胞功能[5-6]。而近年來研究發(fā)現(xiàn)，瘢痕作為一種特殊的良性 “皮膚腫瘤”亦受到miRNA的影響。瘢痕組織中特定miRNA的異常轉(zhuǎn)錄，不僅能夠直接誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞中膠原基因的轉(zhuǎn)錄而引起ECM的過度沉積，還可通過激活/抑制下游信號通路、蛋白或基因而改變成纖維細(xì)胞的細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞凋亡，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖與侵襲能力[7]。部分下游通路甚至可以通過“負(fù)反饋”機(jī)制影響上游miRNA的功能[8]。由此可見，miRNA在增生性瘢痕中的調(diào)節(jié)機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，現(xiàn)就miRNA在瘢痕增生過程中的調(diào)節(jié)作用予以綜述，以期為瘢痕基礎(chǔ)研究和臨床治療提供新思路。

1 與增生性瘢痕有關(guān)的miRNA

miRNA在瘢痕增生中起重要作用[9-10]。miR-21/494/1224/29/205/31/155/152及長鏈非編碼RNA-H19可以通過調(diào)節(jié)下游的轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)/Smad、磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase，PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B，PKB/Akt)、胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular regulated kinase，ERK)、缺氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor，HIF)-1α/血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及胱天蛋白酶(caspase)等信號通路影響成纖維細(xì)胞的凋亡、浸潤、遷移以及膠原蛋白的表達(dá)，見表1。

表1 miRNA及其信號通路

1.1miR-21/miR-494 TGF-β作用于細(xì)胞受體后可上調(diào)miR-21的轉(zhuǎn)錄，從而激活下游Smad蛋白家族，并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的過度增殖及ECM的過量表達(dá)[11-12]。miR-21同樣能夠直接下調(diào)人凋亡相關(guān)因子配體的轉(zhuǎn)錄水平，影響caspase的活性，最終抑制線粒體中細(xì)胞色素C的釋放，從而削弱線粒體所介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞凋亡途徑[13]。此外，人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten gene，PTEN)具有使Akt去磷酸化而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用[14]。miR-21/miR-494也可通過下調(diào)PTEN/Akt通路抑制成纖維細(xì)胞的凋亡，從而誘發(fā)瘢痕形成[15-17]。

caspase信號通路與PTEN均可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，瘢痕組織中兩者的過度下調(diào)則會導(dǎo)致成纖維細(xì)胞凋亡的抑制與過度增殖，進(jìn)而引起ECM的堆積。而miR-21/miR-494及TGF-β作為上述通路的上游位點(diǎn)，其過表達(dá)同樣在瘢痕增生中起到?jīng)Q定性作用。因此，如何調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)miRNA與TGF-β序列的轉(zhuǎn)錄可能是瘢痕增生基礎(chǔ)研究的新方向。

1.2miR-1224-5p 細(xì)胞凋亡途徑中，除caspase蛋白家族外，B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)家族也參與其中。有研究發(fā)現(xiàn)，miR-140-5p對瘢痕的調(diào)控作用通過Bcl-2基因介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑實(shí)現(xiàn)[18]。Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)和Bcl-2均屬于Bcl-2，但它們在細(xì)胞凋亡途徑中的作用不同，其中Bax可增加線粒體的通透性，促使細(xì)胞色素C進(jìn)入胞質(zhì)，最終引起細(xì)胞凋亡，而Bcl-2能夠抑制并阻斷caspase蛋白和Bax基因的功能[19]。miR-1224-5p的過表達(dá)可激活細(xì)胞內(nèi)Bax的表達(dá)，從而拮抗Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的作用?？梢姡珺cl-2、Bax與caspase均屬于細(xì)胞凋亡通路中的調(diào)節(jié)蛋白，但其作用卻不同，caspase和Bax蛋白可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制瘢痕增生，而Bcl-2可誘發(fā)成纖維細(xì)胞的過度增殖。增生性瘢痕組織呈“低caspase/Bax，高Bcl-2”狀態(tài)，因此進(jìn)一步研究成纖維細(xì)胞內(nèi)凋亡蛋白的表達(dá)水平以及凋亡信號的傳導(dǎo)方式具有重要的指導(dǎo)意義。

1.3miR-29a/miR-29b及長鏈非編碼RNA-H19/miR-29a軸 miR-29的轉(zhuǎn)錄異?？蓪?dǎo)致纖維化疾病的發(fā)生和發(fā)展[20-21]。miR-29a/b在瘢痕化進(jìn)程中同樣也發(fā)揮著不可忽視的作用。上調(diào)的miR-29a/miR-29b能夠降低瘢痕組織中TGF-β的水平，并通過減弱成纖維細(xì)胞中TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式抑制瘢痕增生，而TGF-β/Smad通路同樣能夠通過“負(fù)反饋”的方式調(diào)節(jié)miR-29a/miR-29b的轉(zhuǎn)錄[22-23]。這表明，在瘢痕增生的過程中TGF-β與miR-29a/miR-29b之間處于平衡的狀態(tài)。長鏈非編碼RNA-H19/miR-29a軸在促瘢痕化進(jìn)程中也同等重要，成纖維細(xì)胞中的H19可通過抑制下游的miR-29a的轉(zhuǎn)錄，從而削弱后者抗瘢作用，從而刺激膠原纖維的過度分泌[24]。瘢痕組織的微環(huán)境中miRNA同樣存在“自穩(wěn)態(tài)”調(diào)節(jié)。此外，miR-29b還可直接下調(diào)靶基因——熱激蛋白47(heat shock protein 47，HSP47)的轉(zhuǎn)錄，從而抑制后者促進(jìn)瘢痕增生的作用[25]。其他促炎細(xì)胞因子(白細(xì)胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α)及其下游的核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信號通路同樣可以調(diào)控miR-29b的轉(zhuǎn)錄[26]。

1.4miR-152-5p/miR-152-3p miR-152是miR-148/152家族的成員之一，位于人第18號常染色體長臂上第21號染色區(qū)間中的第32條帶中(17q21.32)，其中5p片段通過下調(diào)靶基因Smad3轉(zhuǎn)錄減弱ERK1/2和Akt信號通路，抑制成纖維細(xì)胞的增殖、遷移[27]。此外，在成纖維細(xì)胞中叉頭框蛋白F1(forkhead box protein F1，F(xiàn)OXF1)基因的高表達(dá)對瘢痕增生起抑制作用，而3P片段的過表達(dá)可負(fù)向調(diào)節(jié)FOXF1，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖[28]。miR-152-5p/miR-152-3p是存在于miR-152中的兩種不同的成熟序列，它們在瘢痕組織中的表達(dá)水平及調(diào)控模式存在很大差異。

瘢痕組織微環(huán)境中的“平衡穩(wěn)態(tài)”系統(tǒng)的調(diào)節(jié)機(jī)制不僅涉及miRNA及其相關(guān)通路，還存在于同一基因之間。正常情況下，該系統(tǒng)內(nèi)各組分處于平衡狀態(tài)，而其他病理刺激下所引起的一方過度激活會影響另一方的表達(dá)抑制，最終引起成纖維細(xì)胞的異常增殖。因此，深入研究瘢痕成纖維細(xì)胞中信號通路或基因等各組分之間的穩(wěn)態(tài)環(huán)節(jié)能夠促進(jìn)對增生性瘢痕的認(rèn)識，而該“平衡穩(wěn)態(tài)”系統(tǒng)也能為未來增生性瘢痕的研究提供新的理念。

1.5miR-205/miR-31 PI3K通過活化下游Akt的方式促進(jìn)細(xì)胞增殖。miR-205的過表達(dá)可降低VEGF水平，后者抑制PI3K/Akt磷酸化通路的激活，并加速成纖維細(xì)胞凋亡，降低遷移活性[29]。HIF-1α抑制劑(hypoxia-inducible factor 1α inhibitor，HIF1AN)作為一種天冬氨酸羥化酶，是HIF1AN基因的產(chǎn)物，可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)HIF-1的穩(wěn)定性；促瘢痕形成的miR-31可抑制HIF1AN的活性，上調(diào)細(xì)胞內(nèi)HIF-1水平，激活HIF/VEGF通路，以實(shí)現(xiàn)其功能[30]。有學(xué)者認(rèn)為，VEGF與增生性瘢痕之間存在重要的聯(lián)系，其能夠誘導(dǎo)組織中血管的形成，為成纖維細(xì)胞的增殖和遷移提供充足的血運(yùn)及養(yǎng)分[31]。增生性瘢痕組織中常表現(xiàn)為較高水平的VEGF表達(dá)，而VEGF不僅能夠通過抑制成纖維細(xì)胞凋亡的方式促進(jìn)瘢痕組織的增生，還可促進(jìn)細(xì)胞外血管的生成。因此，減少瘢痕組織中血運(yùn)與VEGF也可起到抑制瘢痕增生的作用。

1.6miR-155/hsa-miR-31-5p miR-155的過表達(dá)可引起成纖維細(xì)胞的增殖以及膠原纖維表達(dá)[32-35]。上調(diào)細(xì)胞內(nèi)miR-155可直接引起HIF-1α轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)，從而影響下游Akt信號通路的正常傳導(dǎo)，抑制成纖維細(xì)胞的增殖，減少ECM的表達(dá)。hsa-miR-31-5p的促瘢痕增生作用需要HIF的參與。細(xì)胞內(nèi)的HIF抑制因子(factor-inhibiting hypoxia inducible factor，F(xiàn)IH)可抑制HIF的表達(dá)，而高表達(dá)hsa-miR-31-5p通過下調(diào)FIH-1使HIF-1α水平升高，進(jìn)而激活HIF/Akt通路，最終誘發(fā)瘢痕組織的過度增生[36]。

HIF作為VEGF的上游序列在增生性瘢痕中起重要作用。HIF的過表達(dá)不僅能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞的增殖浸潤，還可促進(jìn)下游VEGF的過表達(dá)，為瘢痕組織增生提供血運(yùn)，可見VEGF與HIF之間存在“協(xié)同”關(guān)系。進(jìn)一步探究HIF/VEGF的“協(xié)同”關(guān)系可能成為未來瘢痕基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)；此外，下調(diào)HIF表達(dá)的藥物開發(fā)亦可能有助于更好地抑制瘢痕的作用。

1.7miR-188-5p/miR-192 PI3K/Akt通路及其下游的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloprotein，MMP)的異常激活可直接影響成纖維細(xì)胞的增殖分化[37-38]。由于成纖維細(xì)胞中miR-188-5p表達(dá)量較低，導(dǎo)致下游PI3K/Akt/MMP-2/9信號通路異常激活，從而加重了瘢痕組織的增生[39]。此外，組織中miR-192上調(diào)能夠減少下游靶標(biāo)Smad相互作用蛋白1(Sma-dinteracting protein 1，SIP1)的表達(dá)，使Ⅰ型膠原蛋白及α-平滑肌肌動蛋白等瘢痕相關(guān)基因的作用增強(qiáng)，導(dǎo)致皮膚等組織器官的異常纖維化[40-41]。

2 miRNA下游信號通路及蛋白

2.1TGF-β/Smad信號通路 TGF-β及其受體蛋白在增生性瘢痕中的表達(dá)水平明顯升高，表明瘢痕增生過程中存在TGF-β/Smad通路的異常激活[42-43]。過表達(dá)TGF-β刺激成纖維細(xì)胞表面受體，使miR-21上調(diào)，從而抑制Smad7對Smad2/3的保護(hù)作用。隨后Smad2/3被磷酸化激活，最終誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞過度增殖及瘢痕組織增生[44]。TGF-β/Smad在腫瘤疾病的各階段起重要的調(diào)控作用。近年來研究證實(shí)，TGF-β抑制劑——Galuniserb具備抗腫瘤特性[45]。由于增生性瘢痕受到TGF-β信號通路的影響，因此各類抑制劑衍生的各類靶向抗腫瘤藥物可能成為未來研究與治療增生性瘢痕的熱點(diǎn)。

2.2PTEN/PI3K/Akt通路 PTEN/PI3K/Akt信號通路的異常表達(dá)在多種疾病的發(fā)展中起重要作用[46]。PI3K由一個(gè)調(diào)節(jié)亞基(p85)和一個(gè)催化亞基(p110)構(gòu)成，兩個(gè)亞基結(jié)合后可活化PI3K，PI3K可使磷脂酰肌醇-4,5-磷酸發(fā)生磷酸化，從而激活成為磷脂酰肌醇-3,4,5-磷酸，磷脂酰肌醇-3,4,5-磷酸可活化下游絲氨酸-蘇氨酸激酶，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞增殖分化的作用。PTEN通過其包含的脂質(zhì)和蛋白磷酸酶的活性抑制細(xì)胞生長及遷移，主要通過減少磷脂酰肌醇-3,4,5-磷酸生成抑制Akt的激活。近年來，有腫瘤學(xué)家提出了通過使用靶向正負(fù)PTEN調(diào)節(jié)劑或PTEN替代劑的“個(gè)體化誘導(dǎo)PTEN”治療策略治療多種疾病的觀點(diǎn)[47]。對于增生性瘢痕，組織中低表達(dá)PTEN無抗瘢痕化功能，因此該治療策略可能應(yīng)用于增生性瘢痕的治療或研究中。通過協(xié)調(diào)/替代劑的作用上調(diào)成纖維細(xì)胞高表達(dá)PTEN，從而抑制其過度增殖和遷移也是一種新的治療理念。

2.3HIF/VEGF通路 在正常情況下，由細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄的HIF可在HIF1AN的作用下發(fā)生羥基化而失活，或直接被FIH-1抑制[48-49]。HIF生成與分解處于動態(tài)平衡，但瘢痕組織中HIF呈高水平，VEGF作為HIF下游轉(zhuǎn)錄因子亦被上調(diào)。VEGF與其受體結(jié)合后，導(dǎo)致該受體細(xì)胞內(nèi)殘基片段發(fā)生磷酸化，并激活Src。Src是一類具有酪氨酸激酶活性的蛋白質(zhì)，Src的活化可以激活PI3K，從而引發(fā)PI3K/Akt下游通路的傳導(dǎo)，最終導(dǎo)致瘢痕增生[50-51]。此外，HIF還可誘導(dǎo)血管緊張素Ⅱ的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致瘢痕中血管緊張素Ⅱ的過度堆積，使瘢痕組織血供減少，組織缺氧加重，引起HIF的進(jìn)一步堆積[48]。HIF不僅是缺氧反應(yīng)的中心效應(yīng)因子，也是瘢痕過度增生過程中的重要起始因子。既往研究表明，HIF介導(dǎo)的下游通路在胃癌等疾病中也發(fā)揮重要作用[52]。因此，HIF抑制劑等靶向藥物可能成為增生性瘢痕新的治療方向。

2.4細(xì)胞凋亡信號通路 caspase家族誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞異常凋亡(過度增殖、凋亡率降低)同樣在增生性瘢痕中起重要作用[53]。caspase家族屬于半胱氨酸蛋白酶，caspase-8/9分別處于死亡受體途徑或線粒體途徑的上游位置。凋亡相關(guān)因子配體FasL與其受體Fas結(jié)合，并激活細(xì)胞中caspase-8/9、Bax及凋亡蛋白酶激活因子1，從而啟動受體途徑誘導(dǎo)的外源性細(xì)胞凋亡途徑[54-55]?；罨腸aspase-8能夠誘導(dǎo)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放，后者與凋亡蛋白酶激活因子1結(jié)合形成復(fù)合體并激活caspase-9，從而誘發(fā)內(nèi)源性細(xì)胞凋亡[56]。瘢痕組織中，上調(diào)的miR-21與凋亡相關(guān)因子配體的信使RNA序列結(jié)合直接下調(diào)caspase-8表達(dá)水平，從而抑制凋亡途徑的正常傳導(dǎo)?？梢姡?xì)胞凋亡途徑對增生性瘢痕的調(diào)節(jié)尤為重要，該通路中起主導(dǎo)作用的caspase-8/9還可通過相互刺激增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究表明，caspase-9激活劑能夠抑制腫瘤細(xì)胞的異常增殖浸潤[57]。因此，對caspase-8/9激活劑的深入研究與優(yōu)化不僅對增生性瘢痕的基礎(chǔ)研究有指導(dǎo)意義，而且還有望成為未來瘢痕治療新藥物。

2.5HSP HSP是應(yīng)激條件下細(xì)胞產(chǎn)生的一類蛋白質(zhì)，主要功能是維護(hù)蛋白質(zhì)正常的空間結(jié)構(gòu)，并在膠原合成過程中起重要作用[58]。在膠原蛋白合成過程中，HSP47與膠原中的疏水基團(tuán)結(jié)合可防止前膠原在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生聚集沉淀，起保護(hù)前膠原的作用；隨后，HSP47與賴氨酰羥化酶2、FK506結(jié)合蛋白65、免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白結(jié)合，形成蛋白質(zhì)復(fù)合物，調(diào)節(jié)賴氨酰羥化，繼而膠原蛋白在HSP47輔助下，通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體途徑運(yùn)輸和分泌。研究表明，HSP47在誘導(dǎo)膠原折疊的過程中需要FK506結(jié)合蛋白65的協(xié)同作用[59]。FK506結(jié)合蛋白65是一種存在于粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的肽-脯氨酰順/反式異構(gòu)酶，發(fā)揮保護(hù)HSP47的功能，并可防止HSP47形成聚集體而失活。miR-29b通過抑制HSP47的轉(zhuǎn)錄抑制膠原蛋白的合成及瘢痕組織的增生。由于成纖維細(xì)胞低表達(dá)miR-29b，導(dǎo)致miR-29b下游的HSP47發(fā)生過轉(zhuǎn)錄，最終出現(xiàn)膠原的過度合成和分泌。HSP相當(dāng)于機(jī)體應(yīng)激所產(chǎn)生的保護(hù)性蛋白質(zhì)，在瘢痕發(fā)生過程中，該機(jī)制是誘發(fā)膠原纖維過度表達(dá)的因素。HSP拮抗劑的使用能夠抑制正常細(xì)胞癌變[60]。因此，HSP拮抗劑的優(yōu)化也能夠?yàn)轳：壑委熖峁┬碌姆较蚺c思路。

2.6ERK信號通路 ERK是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，ERK1和ERK2是此途徑的兩個(gè)重要成員[61]，ERK信號通路在細(xì)胞增殖凋亡過程中起重要作用。此外，Ras蛋白、Raf激酶、促分裂原活化的蛋白激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase，MEK)1/2等分子亦在ERK信號通路中起關(guān)鍵作用，其中MEK1/2是一種雙特異性激酶，可以使ERK發(fā)生磷酸化?；罨腞as蛋白可與Raf激酶結(jié)合，并激發(fā)Raf激酶的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性；隨后活化的Raf激酶催化MEK發(fā)生磷酸化，活化后的MEK1/2可以激活ERK，磷酸化的ERK進(jìn)入細(xì)胞核并調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖分化，最終促進(jìn)瘢痕的增生[62]。

2.7FOXF1、SIP1、MMP FOXF1是含有FOX的轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，其基因位于染色體16q24.1上，起到調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和組織修復(fù)的作用[63]。FOXF1作為抑癌基因可以抑制腫瘤細(xì)胞的增生，敲低瘢痕組織中FOXF1基因可促進(jìn)纖維細(xì)胞增生，加重瘢痕增生[64]。SIP1的功能主要集中在腫瘤的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，其過表達(dá)可抑制成纖維細(xì)胞中膠原基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制瘢痕的發(fā)生[65]。MMP-2/9主要分布于瘢痕組織中，在瘢痕侵襲中起重要作用[66]。PI3K/Akt途徑的異常激活則會增加MMP-2和MMP-9的表達(dá)，并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞的過度增殖。

3 小 結(jié)

miRNA及其相關(guān)的信號通路在瘢痕的發(fā)病機(jī)制中起重要作用，主要通過作用于TGF-β/Smad、PI3K/Akt、ERK、HIF/VEGF及細(xì)胞凋亡等蛋白或信號通路，實(shí)現(xiàn)對成纖維細(xì)胞的影響，同時(shí)miRNA與信號通路之間也存在著“協(xié)同、抑制、負(fù)反饋”等關(guān)系。瘢痕形成是一個(gè)復(fù)雜的過程，而miRNA是強(qiáng)大的基因調(diào)控者，單個(gè)miRNA的調(diào)節(jié)就可能產(chǎn)生強(qiáng)大的效應(yīng)。瘢痕組織中存在明顯的miRNA表達(dá)異常，這與瘢痕的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。隨著對miRNA在瘢痕中作用的不斷研究，發(fā)現(xiàn)miRNA具有調(diào)節(jié)多個(gè)靶向基因的能力，這為實(shí)現(xiàn)在分子水平上對瘢痕的發(fā)生發(fā)展進(jìn)行調(diào)控開拓了思路。針對miRNA的靶向藥物可能會成為未來整形美容領(lǐng)域具有革命性意義的安全療法。