王洪芹，徐茶，宋東坡，呂亞囡，孫英梅，陳艷萍

1青島婦女兒童醫(yī)院，山東青島266034；2德州市婦幼保健院

3-甲基戊烯二酸(3-MGA)尿癥是由于亮氨酸代謝途徑異常引起的以尿中3-MGA排出增多為特征的一組遺傳代謝病[1]。3-MGA尿癥主要包括5種類型[2]：Ⅰ型為AUH基因突變所致3-甲基戊烯二酰輔酶A水解酶(3-MGH)缺乏的常染色體隱性遺傳??；Ⅱ型又稱Barth綜合征，是TAZ基因突變所致線粒體膜蛋白tafazzin功能缺陷的X連鎖隱性遺傳??；Ⅲ型又稱Costeff視神經(jīng)萎縮綜合征，是線粒體膜蛋白OPA3基因突變所致的常染色體隱性遺傳??；Ⅳ型為排除其他類型的異常原因的3-MGA尿癥[3]；Ⅴ型又稱擴張型心肌病伴共濟失調(diào)綜合征，為DNAJC19基因突變所致的DNAJC19蛋白改變的常染色體疾病。3-MGA尿癥Ⅰ型(MGA1)是一種常染色體隱性遺傳病[4]，臨床罕見，國內(nèi)尚無相關(guān)報道；自1978年以來，只有38例MGA1病例文獻(xiàn)報道[1～20]。該病早期可能無癥狀，因此通過新生兒疾病篩查發(fā)現(xiàn)此病尤為重要。2016～2019年，本研究對1例新生兒疾病篩查發(fā)現(xiàn)的MGA1患兒及其父母的AUH基因進(jìn)行檢測，應(yīng)用生物信息學(xué)軟件預(yù)測突變位點致病性和突變可能導(dǎo)致的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)及功能的變化。現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 患兒男，3歲，因新生兒疾病篩查串聯(lián)質(zhì)譜甲基丙二酰基肉堿(C4DC+C5OH)高于正常參考范圍于2016年10月9日來我院就診?；純合档?胎，第2產(chǎn)，足月順產(chǎn)出生，出生體質(zhì)量為3 600 g，圍生期正常。患兒父母健康，否認(rèn)近親結(jié)婚，無類似疾病家族史，患兒有一同胞姐姐，表型正常。患兒自出生以來，分別于出生時、1個月、3個月、6個月、9個月、1歲、2歲、3歲時進(jìn)行保健查體，身高、體質(zhì)量、頭圍等各項生長發(fā)育指標(biāo)與同齡幼兒無明顯差異，無小頭畸形，無痙攣性四肢麻痹性精神運動遲緩，無癲癇和肌張力障礙，無語言發(fā)育遲緩，無低血糖，無代謝性酸中毒等。實驗室檢查結(jié)果無明顯異常?；純貉?lián)質(zhì)譜篩查顯示，出生1個月、3個月、6個月、9個月、1歲、3歲時C4DC+C5OH分別為1.0、0.8、0.81、1.38、1.74、2.21 μmol/L，明顯高于正常參考范圍(0.05～0.45 μmol/L)?；純河?歲時進(jìn)行尿液有機酸氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析檢測顯示，3-羥基異戊(3-HIVA)21.2 mmol/mol肌酐(正常參考范圍：0～2.3 mmol/mol肌酐)，3-MGA 222.98 mmol/mol肌酐(正常參考范圍：0～4.2 mmol/mol肌酐)。其中3-MGA為正常均值的202.71倍(正常均值為1.1 mmol/mol肌酐)，初步診斷為3-MGA尿癥。

1.2 AUH基因測序及測序驗證

1.2.1 高通量測序 征得患兒父母的知情同意，采集患兒及其父母的外周血各2 mL，送杭州甄元醫(yī)學(xué)檢驗實驗室，對致病基因AUH基因的10個外顯子進(jìn)行基因捕獲及第二代高通量測序。

1.2.2 Sanger測序驗證 用Sanger測序法對患兒及父母AUH基因可疑突變位點進(jìn)行驗證，結(jié)果與參考序列比較。

1.3 突變位點生物學(xué)信息分析 采用Mutation Taster和PolyPhen-2軟件、CRYP-SKIP軟件、人類剪接查找服務(wù)器(HSF)預(yù)測突變位點致病性和突變可能導(dǎo)致的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的變化。Mutation Taster可預(yù)測突變位點氨基酸保守性。PolyPhen-2可預(yù)測氨基酸替換對人蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的影響。CRYP-SKIP隱蔽剪接位點激活-外顯子跳躍預(yù)測器，可預(yù)測因剪接突變導(dǎo)致的隱蔽剪接位點激活(PCR-E)和外顯子跳躍(1-PCR-E)的可能性大小，PCR-E的值介于0和1，較高的值表示密碼子的隱蔽位點激活，較低的值表示外顯子跳躍。HSF可預(yù)測隱蔽剪接位點及基因突變對剪接位點的改變[5]。HSF得分范圍為0～100，MaxEnt得分范圍為-20～20。當(dāng)突變發(fā)生時，若同時滿足野生型HSF得分大于65、MaxEnt得分大于3、野生型與突變型之間HSF得分變化率小于-10%、野生型與突變型之間MaxEnt得分變化率小于-30%，則HSF軟件預(yù)測為該突變破壞了剪接位點。

2 結(jié)果

2.1 基因測序及驗證結(jié)果

2.1.1 高通量測序結(jié)果 基因捕獲及第二代高通量測序顯示患兒AUH基因存在c.894+5G>A雜合突變和c.677G>A雜合突變。c.894+5G>A突變?yōu)榧艚油蛔?，?94+5號核苷酸由鳥嘌呤變?yōu)橄汆堰?，是未報道過的新突變，在ESP6500、千人基因組計劃及ExAC數(shù)據(jù)庫中均未檢索到。c.677G>A為錯義突變，位于第7外顯子，第677號核苷酸由鳥嘌呤變?yōu)橄汆堰?，在ESP6500、千人基因組計劃中也均未檢索到，ExAC數(shù)據(jù)庫曾報道過，在dbSNP數(shù)據(jù)庫中檢索到其收錄ID為rs752044125，為已報道過的突變。

2.1.2 Sanger測序驗證結(jié)果 Sanger測序驗證結(jié)果顯示患兒母親攜帶AUH基因c.894+5G>A剪接突變，患兒父親攜帶AUH基因第7外顯子c.677G>A錯義突變。見圖1?；純旱腁UH基因c.894+5G>A剪接突變和第7外顯子c.677G>A錯義突變分別來自于母親和父親。

2.2 基因突變致病性預(yù)測情況 采用CRYP-SKIP軟件和HSF分析c.894+5G>A剪接突變，預(yù)測結(jié)果為突變使外顯子跳躍，其中CRYP-SKIP預(yù)測顯示，突變后外顯子隱蔽剪接位點激活(PCR-E)的可能性為0.08，外顯子跳躍(1-PCR-E)的可能性為0.92；經(jīng)HSF預(yù)測軟件顯示，野生型供體區(qū)域的生物保守性HSF得分為89.9，突變后HSF得分為77.73，野生型與突變型之間變異程度為-13.54%，5′剪接位點野生型MaxEnt得分為9.65，野生型與突變型之間變化率為-37.41%；由以上數(shù)據(jù)可知，此突變一定程度上破壞了相鄰第8外顯子的供體區(qū)域，影響剪接。采用Mutation Taster、PolyPhen-2軟件對c.677G>A錯義突變進(jìn)行生物信息學(xué)分析，被替代的堿基為高度保守序列(圖2)，此突變可能致病；PolyPhen-2軟件對c.677G>A錯義突變預(yù)測得分為1，得分越接近1，突變越可能導(dǎo)致蛋白功能改變而致病。

注：A為患兒c.677G>A突變；B為患兒c.894+5G>A突變；C為患兒母親未測出c.677G>A突變；D為患兒母親c.894+5G>A突變；E為患兒父親c.677G>A突變；F為患兒父親未檢測到c.894+5G>A突變。

圖2 Mutation Taster軟件分析c.677G>A突變位點保守性結(jié)果

3 討論

3-MGA尿癥是一組以尿中3-MGA排出增多為特征的遺傳代謝病。正常人尿液中3-MGA含量小于20 mmol/mol肌酐，而3-MGA尿癥患者尿中3-MGA含量可間歇性超過1 000 mmol/mol肌酐[3，6]。本例患兒屬于MGA1，尿中3-MGA明顯增高，為正常均值的202.71倍。研究顯示，3-MGH在小鼠腎臟、骨骼肌、心臟和大腦中高度表達(dá)，定位于線粒體內(nèi)[7]。3-MGH具有RNA結(jié)合功能和烯酰輔酶A水合酶活性兩種功能。甲基戊二酰輔酶A水合酶催化水合作用，將3-甲基戊烯二酰輔酶A催化形成3-羥基-3甲基戊二酸，這是亮氨酸降解途徑中的關(guān)鍵步驟。3-MGA尿癥主要是由于3-MGH缺乏，使3-甲基戊烯二酰輔酶A不能水解為3-羥基-3甲基戊二酸，導(dǎo)致前體代謝產(chǎn)物3-MGA和3-HIVA排出增多[8]。通常，MGA1患者尿中3-MGA水平高于其他幾種類型，此外，MGA1患者尿中3-HIVA排泄增加，可以此作為區(qū)別3-MGH缺乏癥和其他類型3-MGA尿癥的一個重要參數(shù)[9]。MGA1患者尿液中3-MGA順式和反式兩種異構(gòu)體的比例為2∶1，腦脊液中只有順式異構(gòu)體，而在其他類型3-MGA尿癥中，尿液順式和反式3-MGA比例約為1∶1[10]。亮氨酸負(fù)荷試驗可以鑒別由AUH基因突變導(dǎo)致的MGA1[11]。

3-MGH由AUH基因編碼，該基因定位于9號染色體9q22.31，包含10個外顯子，編碼339個氨基酸[12]。目前，文獻(xiàn)中已有11種不同的突變被報道，其中最常見的突變類型是錯義和無義突變[1]。經(jīng)預(yù)測，這其中許多突變將導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能的完全喪失[13]。本例患兒未表現(xiàn)出3-MGA尿癥相關(guān)癥狀，為出生后進(jìn)行新生兒疾病篩查串聯(lián)質(zhì)譜檢測C4DC+C5OH高于正常參考范圍所發(fā)現(xiàn)，隨后進(jìn)行患兒尿液分析，符合3-MGA尿癥的診斷，基因檢測顯示存在AUH基因c.894+5G>A突變和第7外顯子c.677G>A復(fù)合雜合突變。經(jīng)Sanger測序驗證，c.894+5G>A剪接突變來自母親，c.677G>A錯義突變來自父親。通過CRYP-SKIP軟件和HSF對c.894+5G>突變預(yù)測，發(fā)現(xiàn)在外顯子-內(nèi)含子結(jié)合點(5′剪接位點)發(fā)生突變，此突變一定程度上破壞了相鄰第8外顯子的供體區(qū)域，導(dǎo)致外顯子跳躍，造成剪切位點改變，影響正常RNA在該位點的剪接，推測可能導(dǎo)致編碼蛋白的結(jié)構(gòu)改變從而影響蛋白功能。通過Mutation Taster、PolyPhen-2軟件對c.677G>A錯義突變進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)被替代的堿基為高度保守序列，c.677G>A突變導(dǎo)致第226位精氨酸被組氨酸替代，蛋白質(zhì)發(fā)生p.R226H改變，可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能改變，從而可能致病。然而，上述2種基因新突變的致病性僅通過軟件預(yù)測得出，尚需體外蛋白功能表達(dá)研究進(jìn)行證實。

MGA1的發(fā)病起始年齡可從嬰兒期到成人[4]。該型臨床表現(xiàn)差異較大，可從無癥狀到廣泛的輕度異質(zhì)性神經(jīng)功能障礙、語言發(fā)育遲緩、四肢癱瘓、肌張力障礙、舞蹈動作、嚴(yán)重腦病、精神運動遲緩、嬰兒期或兒童期基底神經(jīng)節(jié)受累和成人腦MRI示腦白質(zhì)腦病變、共濟失調(diào)和痙攣狀態(tài)[1]。2008年Leipnitz等[14]研究發(fā)現(xiàn)，3-MGA的毒性影響僅作用于大鼠的大腦皮層，3-HIVA可聚集在患者的腦脊液中，具有神經(jīng)毒性。2010年Wortmann等[15]曾報道過2例兒童MAG1患者M(jìn)RI顯示有基底神經(jīng)節(jié)病變和腦萎縮，而另外2例患者腦部MRI顯示正常。MGA1是一種典型的有機酸尿癥，目前沒有針對該病的特異性治療方法。由于MGA1患者在進(jìn)行高亮氨酸飲食或高蛋白質(zhì)飲食后尿液中3-MGA含量會明顯增多，因此，目前比較常用的治療方法為限制亮氨酸或蛋白質(zhì)飲食[16，17]。本例患兒自出生以來，常規(guī)兒童保健查體與同齡兒童相比未見明顯異常，建議進(jìn)一步行腦MRI檢查，排除腦白質(zhì)病變。由于該病發(fā)病起始年齡不定且臨床表現(xiàn)差異大，建議患兒定期檢查，長期隨訪。

綜上所述，本例3-MGA尿癥患兒通過高通量測序及Sanger驗證，檢測到患兒AUH基因c.894+5G>A和c.677G>A復(fù)合雜合突變。經(jīng)軟件預(yù)測分析，此2種突變很有可能致病，為該患兒的遺傳學(xué)病因。其中，c.894+5G>A剪接突變是未報道過的新突變，c.677G>A錯義突變?yōu)橐褕蟮肋^的突變。本例c.894+5G>A剪接突變和c.677G>A錯義突變的檢出豐富了AUH基因譜，為3-MGA尿癥的診斷和產(chǎn)前咨詢提供了依據(jù)。