徐寧 孫曉慧 曹娜 王闖 李光亞 薛淼云

摘? ? 要：為了探討外源褪黑素調(diào)控番茄幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)抵御硝酸鹽脅迫的生理機(jī)制，選用主栽番茄品種‘紅粉冠軍為試驗(yàn)材料，采用灌根法研究不同濃度外源褪黑素對硝酸鹽脅迫下番茄幼苗生長和葉片H2O2含量、O2-產(chǎn)生速率、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響。結(jié)果表明，75 mmol·L-1硝酸鹽處理的番茄幼苗株高、莖粗、根長及幼苗地上部、地下部生物量均低于對照，脅迫處理下番茄幼苗葉片H2O2含量和O2-產(chǎn)生速率一直比對照高，50、100、150 μmol·L-1外源褪黑素降低了H2O2含量和O2-產(chǎn)生速率，顯著緩解番茄幼苗膜脂過氧化，加速了番茄幼苗的生長。外源褪黑素處理的番茄幼苗葉片中脯氨酸、游離氨基酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量顯著提高，番茄幼苗滲透調(diào)節(jié)能力提升。綜合分析表明，外源褪黑素提高了番茄幼苗葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，有效緩解了硝酸鹽對番茄幼苗細(xì)胞質(zhì)膜的傷害，提升了番茄幼苗對硝酸鹽脅迫的抗性，100 μmol·L-1外源褪黑素處理效果最顯著。

關(guān)鍵詞：番茄;褪黑素;硝酸鹽脅迫;滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

中圖分類號：S641.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2020）09-023-05

Absract： In order to explore the physiological mechanism of exogenous melatonin regulate osmotic adjustment substance on alleviating nitrate stress in tomato seedlings， the main tomato variety ‘Hongfen Champion was used as the test material， the effects of different concentrations of exogenous melatonin on the tomato seedling growth and tomato seedling leaf H2O2 content， O2- production rate， osmotic adjustment substance content under nitrate stress through irrigation root method. The results showed that the plant height， stem diameter， root length， shoot biomass and root biomass of tomato seedlings were all lower than the control under the stress of 75 mmol·L-1 nitrate. The H2O2 content and O2- production rate in tomato seedling leaves under stress were higher than that of control. The 50， 100 and 150 μmol·L-1 exogenous melatonin reduced the H2O2 content and O2- production rate， significantly alleviated the membrane lipid peroxidation of tomato seedlings and accelerated the growth of tomato seedlings. The content of soluble sugar， soluble protein， proline and free amino acid in tomato leaves can be significantly increased by exogenous melatonin， and the osmotic regulation ability of tomato seedlings can be effectively enhanced. According to the comprehensive analysis， the addition of exogenous melatonin increased the content of osmotic regulatory substances in tomato seedling leaves， effectively alleviated the damage of nitrate to the cytoplasmic membrane of tomato seedlings， and improved the resistance of tomato seedlings to nitrate stress， the effect of exogenous melatonin at 100 μmol·L-1 was the most significant.

Key words： Tomato; Melatonin; Nitrate stress; Osmotic adjustment substance

番茄（Lylopersicon esculentum）是溫室主栽蔬菜種類之一，果品營養(yǎng)豐富且口感佳，種植面積和產(chǎn)量居世界首位[1]。番茄種植過程中，在高溫高濕且缺少自然雨水淋溶的溫室環(huán)境中，單一性大量化肥施入及連作種植模式等原因易引起耕層土壤次生鹽漬化，嚴(yán)重制約其生長發(fā)育[2]。番茄次生鹽漬化耕層土壤中，NO3-占陰離子總量的67%～76%[3]。硝酸鹽的累積，破壞土壤理化及養(yǎng)分環(huán)境平衡，根際土壤微生物種群結(jié)構(gòu)失調(diào)[4]，番茄植株活性氧傷害累積，損傷細(xì)胞結(jié)構(gòu)及代謝，打破常規(guī)光合速率，番茄產(chǎn)量及果品質(zhì)量受到嚴(yán)重影響[5-7]。

褪黑素（N-乙?；?5-甲氧基色胺，Melatonin，MT）是色氨酸吲哚類衍生物，為新型植物生長調(diào)節(jié)劑[8-9]，近幾年作為新型激素研究備受關(guān)注。前期研究表明，外源褪黑素可激活低溫弱光、高溫、硝酸鹽等多種非生物脅迫下黃瓜幼苗的抗氧化系統(tǒng)[10-13]，促進(jìn)黃瓜生長發(fā)育，進(jìn)而提高產(chǎn)量。外源褪黑素也可以緩解番茄低溫[9，14]、干旱[9，15]、中性鹽[16]、堿性鹽[17]、鎘[18]等非生物脅迫。筆者前期研究表明，硝酸鹽脅迫下，外源褪黑素處理可有效激活番茄幼苗抗氧化系統(tǒng)，提高其抗性[19]。園藝植物葉片滲透物質(zhì)調(diào)節(jié)是其適應(yīng)次生鹽漬化脅迫的重要機(jī)制之一[20]。筆者采用番茄試材，在硝酸鹽脅迫下，利用不同濃度外源褪黑素溶液進(jìn)行灌根處理，檢測番茄生長發(fā)育指標(biāo)及葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量等，探討外源褪黑素調(diào)控滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、抵御硝酸鹽脅迫的生理機(jī)制，為外源褪黑素在設(shè)施番茄生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2019年在聊城職業(yè)技術(shù)學(xué)院日光溫室試驗(yàn)基地內(nèi)進(jìn)行。供試品種為魯西北地區(qū)番茄主栽品種‘紅粉冠軍，褪黑素（Melatonin，MT）購自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)處理和設(shè)計(jì)

試驗(yàn)選取健康狀況一致的番茄主栽品種‘紅粉冠軍，常規(guī)方法浸種、催芽，選飽滿且大小一致的種子播于裝有專用基質(zhì)（V椰糠∶V菇渣∶V珍珠巖=2∶2∶1）的穴盤中。試驗(yàn)處理設(shè)置如表1。NO3-脅迫濃度在預(yù)備試驗(yàn)中確定，對照處理（CK）灌根等量去離子水。試驗(yàn)中NO3-由Ca（NO3）2·4H2O 和 KNO3提供，各占50%。每處理120株，3次重復(fù)，完全隨機(jī)區(qū)組排列。

幼苗長至3葉1心時(shí)，選用不同濃度MT溶液，17：00對番茄幼苗進(jìn)行灌根處理，2 d澆灌1次，每穴10 mL，處理4次。最后一次MT處理后第2天17：00進(jìn)行硝酸鹽灌根處理，4 d 后再處理1次，每穴10 mL。最后一次硝酸鹽處理后，0、2、4、6、8 d分別取生長點(diǎn)下第3片葉，用于葉片H2O2含量和O2-產(chǎn)生速率測定;0、4、8 d分別取生長點(diǎn)下第4片葉，用于葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量測定。15 d后取出番茄幼苗，測量其生長指標(biāo)。

1.3 測定項(xiàng)目和方法

番茄株高和根長采用直尺測量，株高為根莖結(jié)合部到植株生長點(diǎn)的距離（cm），根長為番茄主根長度（cm）;莖粗采用游標(biāo)卡尺測量，莖粗為高于基質(zhì)面1 cm處的莖部粗度（cm）;植株干鮮質(zhì)量采用電子天平稱量，將整個(gè)植株用去離子水清洗干凈，吸水紙拭干，從根莖結(jié)合部將地上部和地下部分開，電子天平稱其鮮質(zhì)量（g），然后置于105 ℃殺青15 min后，于75 ℃烘干至恒重，稱其干質(zhì)量（g）。

H2O2含量采用TiCl4沉淀法[21]測定;O2-產(chǎn)生速率參照Tian等[22]的方法測定;可溶性糖含量采用蒽酮比色方法測定;可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250方法測定;脯氨酸、游離氨基酸含量采用茚三酮比色方法測定[23]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，利用Excel 2003和DPS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源褪黑素處理對硝酸鹽脅迫下番茄幼苗生長的影響

由表2可以看出，硝酸鹽脅迫處理（T1～T4）下番茄幼苗的株高、莖粗和根長均低于對照，硝酸鹽脅迫抑制了番茄幼苗生長。外源褪黑素處理（T2～T4）的番茄幼苗生長指標(biāo)均高于單一硝酸鹽脅迫處理（T1）的幼苗，外源褪黑素顯著緩解硝酸鹽脅迫，加速番茄幼苗的生長。T1處理的株高、莖粗和根長比對照分別低17.07%、20.00%和16.89%，顯著抑制幼苗生長;T3處理的株高、莖粗和根長比T1高19.66%、20.45%和14.84%，100 μmol·L-1外源褪黑素處理緩解作用最顯著。

由圖1可以看出，硝酸鹽脅迫抑制番茄幼苗的生長，地上部及地下部的干鮮質(zhì)量均顯著低于對照。外源褪黑素處理可顯著緩解硝酸鹽脅迫下番茄的生長，其中100 μmol·L-1外源褪黑素處理緩解作用最顯著，50和150 μmol·L-1外源褪黑素處理緩解作用其次，T2和T4處理之間差異不顯著。

2.2 外源褪黑素處理對硝酸鹽脅迫下番茄幼苗葉片中H2O2含量和O2-產(chǎn)生速率的影響

由圖2可以看出，隨著硝酸鹽脅迫時(shí)間的延長，番茄幼苗葉片H2O2含量持續(xù)上升，O2·-產(chǎn)生速率呈先增高后降低的趨勢。硝酸鹽脅迫處理葉片H2O2含量和O2-產(chǎn)生速率一直比對照高，番茄幼苗膜脂過氧化作用嚴(yán)重。外源褪黑素降低了H2O2含量和O2-產(chǎn)生速率，顯著緩解番茄幼苗膜脂過氧化。脅迫處理8 d，硝酸鹽脅迫處理T1番茄葉片H2O2含量和O2-產(chǎn)生速率比對照高195.43%和81.42%，50、100、150 μmol·L-1外源褪黑素處理番茄幼苗葉片H2O2含量和O2-產(chǎn)生速率比T1分別低13.98%、30.73%、15.72%和26.09%、35.90%、32.68%。外源褪黑素處理緩解了番茄幼苗葉片H2O2含量和O2-產(chǎn)生速率的上升趨勢，100 μmol·L-1外源褪黑素處理最顯著。

2.3 外源褪黑素處理對硝酸鹽脅迫下番茄幼苗葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的影響

由圖3可以看出，硝酸鹽脅迫0 d，5個(gè)處理的脯氨酸和游離氨基酸含量差異不顯著;脅迫處理8 d，對照處理的脯氨酸和游離氨基酸相對脅迫0 d時(shí)變化較小，硝酸鹽脅迫處理（T1～T4）的脯氨酸和游離氨基酸含量上升，這表明硝酸鹽脅迫刺激番茄幼苗葉片滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)釋放。試驗(yàn)處理中，添加外源褪黑素處理的葉片脯氨酸和游離氨基酸含量顯著高于T1，其中100 μmol·L-1外源褪黑素處理效果顯著。

由圖4可知，硝酸鹽脅迫8 d，對照處理的葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量相對脅迫0 d時(shí)變化較小，硝酸鹽脅迫處理的上述2個(gè)指標(biāo)上升，均高于對照。外源褪黑素處理試驗(yàn)，番茄幼苗葉片中可溶性糖、可溶性蛋白含量均顯著高于T1。脅迫處理8 d，50、100、150 μmol·L-1外源褪黑素處理的番茄幼苗葉片可溶性糖和可溶性蛋白含量比T1分別高3.05%、14.50%、-0.76%和8.45%、19.64%、6.11%，可見100 μmol·L-1 褪黑素處理效果最顯著，50 μmol·L-1次之。

3 討論與結(jié)論

硝酸鹽累積是影響設(shè)施番茄可持續(xù)發(fā)展的重要環(huán)境因子之一。土壤中累積的硝酸鹽對番茄植物體細(xì)胞膜完整性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)平衡均具有顯著影響[24]。細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，導(dǎo)致植物體電解質(zhì)滲透率提高，細(xì)胞膜穩(wěn)定指數(shù)越來越低，活性氧代謝加強(qiáng)，H2O2含量積累和O2-產(chǎn)生速率提升[25-26]。試驗(yàn)結(jié)果表明，硝酸鹽脅迫處理下番茄幼苗的株高、莖粗、根長、地上部及地下部生物量均低于對照，脅迫處理下番茄幼苗葉片H2O2含量和O2-產(chǎn)生速率一直比對照高，硝酸鹽脅迫處理番茄幼苗膜脂過氧化嚴(yán)重，顯著抑制番茄幼苗的生長發(fā)育，這與何明明等[27]、陳珣等[28]在番茄上的研究結(jié)果一致。硝酸鹽積累還導(dǎo)致小白菜[25]、黃瓜[29]、櫻桃番茄[30]等作物膜脂過氧化，引起園藝植物葉片中H2O2和O2-含量的增加，各種作物生長受到抑制。外源褪黑素作為一種新型植物生長調(diào)節(jié)劑，抗氧化能力是維生素E和谷胱甘肽的2～4倍，甘露醇的14倍[11]。大量研究表明，外源褪黑素可直接清除·OH和H2O2[31-32]，緩解O2-產(chǎn)生速率，顯著抑制番茄幼苗膜脂過氧化，加速番茄幼苗的生長發(fā)育。

設(shè)施番茄次生鹽漬化脅迫時(shí)，為維持水分平衡、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)滲透勢，植物細(xì)胞內(nèi)會積累可溶性糖、可溶性蛋白、脯氨酸等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)[27-28]。硝酸鹽脅迫處理下，黃瓜[29]、櫻桃番茄[30]葉片可溶性糖、脯氨酸含量顯著增加，這與本研究結(jié)果一致。滲透調(diào)節(jié)是園藝植物適應(yīng)設(shè)施次生鹽漬化環(huán)境動態(tài)變化的重要機(jī)制之一，硝酸鹽作為主體次生鹽漬化陰離子，大量累積會脅迫設(shè)施園藝植物合成并積累一些有機(jī)小分子物質(zhì)，以提升植物自身滲透調(diào)節(jié)能力，保證植物細(xì)胞正常生理功能運(yùn)轉(zhuǎn)[33]。

硝酸鹽脅迫處理下，番茄幼苗葉片中可溶性糖、可溶性蛋白以及脯氨酸、游離氨基酸含量顯著增加，以緩解硝酸鹽累積脅迫。褪黑素親水性顯著，進(jìn)入細(xì)胞過程通暢，添加外源褪黑素處理可進(jìn)一步顯著提高番茄葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，其吸附在細(xì)胞膜上維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能的穩(wěn)定，進(jìn)一步提高了葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的運(yùn)輸能力[34]，也有效增強(qiáng)了番茄幼苗的滲透調(diào)節(jié)能力。

綜上分析表明，硝酸鹽脅迫下，番茄幼苗灌根添加外源褪黑素，提高了番茄幼苗葉片中滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量，緩解了硝酸鹽對番茄幼苗細(xì)胞質(zhì)膜的傷害，增強(qiáng)了番茄幼苗對硝酸鹽脅迫的抗性。在本試驗(yàn)條件下，外源添加100 μmol·L-1褪黑素緩解番茄幼苗受硝酸鹽脅迫的效果最好。

參考文獻(xiàn)

[1] 廖興其.世界番茄的生產(chǎn)與消費(fèi)[J].中國果菜，2000（5）：42.

[2] 谷端銀，焦娟，高俊杰，等.設(shè)施土壤硝酸鹽積累及其對作物影響的研究進(jìn)展[J].中國蔬菜，2017（3）：22-28.

[3] 薛繼澄，畢德義，李家金，等.保護(hù)地栽培蔬菜生理障礙的土壤因子與對策[J].土壤肥料，1994（1）：4-9.

[4] 余海英，李廷軒，周健民.設(shè)施土壤次生鹽漬化及其對土壤性質(zhì)的影響[J].土壤，2005，37（6）：581-586.

[5] 楊鳳娟，王秀峰，魏珉，等.NO3-脅迫下K+、Ca2+對黃瓜幼苗膜質(zhì)過氧化及活性氧清除酶系統(tǒng)的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2005，21（S2）：155-158.

[6] 高麗紅.保護(hù)地土壤次生鹽漬化對主要蔬菜生長發(fā)育的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，12（3）：69-71.

[7] 袁凌云，汪承剛，黃興學(xué)，等.油菜素內(nèi)酯對Ca（NO3）2脅迫下黃瓜葉綠體AsA-GSH循環(huán)及葉黃素穩(wěn)態(tài)的影響[J].園藝學(xué)報(bào)，2017，44（5）：881-890.

[8] 鞏彪，史慶華.園藝作物褪黑素的研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，50（12）：2326-2337.

[9] 丁飛.褪黑素緩解番茄低溫與水分脅迫機(jī)理研究[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2017.

[10] 高青海，王亞坤，陸曉民，等.低溫弱光下外源褪黑素對黃瓜幼苗生長及抗氧化系統(tǒng)的影響[J].西北植物學(xué)報(bào)，2014，34（8）：1608-1613.

[11] 徐向東，孫艷，郭曉芹，等.褪黑素對高溫脅迫下黃瓜幼苗抗壞血酸代謝系統(tǒng)的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，21（10）：2580-2586.

[12] 徐向東，孫艷，孫波，等.高溫脅迫下外源褪黑素對黃瓜幼苗活性氧代謝的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2010，21（5）：1295-1300.

[13] 王偉香，張銳敏，孫艷，等.外源褪黑素對硝酸鹽脅迫條件下黃瓜幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響[J].園藝學(xué)報(bào)，2016，43（4）：695-703.

[14] 包宇，羅慶熙，黃娟，等.外源褪黑素對低溫脅迫下番茄幼苗生理指標(biāo)的影響[J].西南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2013，38（10）：57-61.

[15] 楊小龍，須暉，李天來，等.外源褪黑素對干旱脅迫下番茄葉片光合作用的影響[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2017，50（16）：3186-3195.

[16] 杜天浩.外源褪黑素對NaCl脅迫下番茄幼苗生理代謝和產(chǎn)量及品質(zhì)的影響[D].陜西楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2016.

[17] 劉娜.外源褪黑素和一氧化氮及其互作對番茄幼苗堿脅迫緩解效應(yīng)的研究[D].山東泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015.

[18] KAMRUL HASAN.褪黑素調(diào)控番茄鎘脅迫抗性及解毒作用機(jī)制[D].杭州：浙江大學(xué)，2016.

[19] 徐寧，曹娜，王闖，等.外源褪黑素對硝酸鹽脅迫下番茄幼苗抗氧化系統(tǒng)的影響[J].北方園藝，2019（3）：1-5.

[20] 童輝，孫錦，郭世榮，等.等滲Ca（NO3）2和NaCl脅迫對黃瓜幼苗生長及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響[J].西北植物學(xué)報(bào)，2012，32（2）：306-311.

[21] VELIKOVA V，YORDANOV I，EDREVA A.Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated bean plants： protective role of exogenous polyamines[J].Plant Science，2000，151（1）：59-66.

[22] TIAN M，GU Q，ZHU M.The involvement of hydrogen peroxide and antioxidant enzymes in the process of shoot organogenesis of strawberry callus[J].Plant Science，2003，165（4）：701-707.

[23] 趙世杰，史國安，董新純.植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社，2002.

[24] FLOWERS T J，MUNNS R，COLMER T D.Sodium chloride toxicity and the cellular basis of salt tolerance in halophytes[J].Annals of Botany，2015，115（3）：419-431.

[25] 龐強(qiáng)強(qiáng)，孫光聞，蔡興來，等.硝酸鹽脅迫下黃腐酸對小白菜活性氧代謝及相關(guān)基因表達(dá)的影響[J].分子植物育種，2018，16（17）：5812-5820.

[26] 聶文婧，王碩碩，荊鑫，等.外源表油菜素內(nèi)酯對NaHCO3脅迫下黃瓜幼苗生長及氧化還原平衡的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2018，29（3）：899-908.

[27] 何明明，王秀峰，谷端銀，等.硝普鈉對缺鐵和硝酸鹽脅迫下番茄幼苗生長及生理特性的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2017，28（4）：1246-1254.

[28] 陳珣，楊鎮(zhèn)，曹君，等.人參內(nèi)生菌提取物對硝酸鹽脅迫下番茄幼苗生長及氮代謝相關(guān)指標(biāo)的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2017，33（5）：1111-1116.

[29] 楊全勇，王秀峰，韓宇睿，等.硝普鈉對黃瓜幼苗缺鎂和硝酸鹽脅迫的緩解效應(yīng)[J].植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報(bào)，2015，21（5）：1269-1278.

[30] 李順，龍娟，徐慧妮.櫻桃番茄幼苗對硝酸鹽脅迫的生長和生理響應(yīng)[J].西北植物學(xué)報(bào)，2014，34（2）：0332-0340.

[31] PIERI C，MARRA M，MORONI F，et al.Melatonin：a preoxyl radical scavenger more effective than vitamin E[J].Life Sciences，1994，55（15）：271-276.

[32] PIERI C，MORONI F，MAFFA M，et al.Melatonin is an efficient antioxidant [J].Archives of Gerontology and Geriatrics，1995，20：159-165.

[33] 付晴晴，譚雅中，翟衡，等.葡萄中褪黑素對NaHCO3脅迫的響應(yīng)及外源褪黑素緩解NaHCO3脅迫的作用機(jī)制[J].植物生理學(xué)報(bào)，2017，53（12）：2114-2124.

[34] TURK H，ERDAL S，GENISEL M，et al.The regulatory effect of melatonin on physiological， biochemical and molecular parameters in cold-stressed wheat seedlings[J].Plant Growth Regulation，2014，74（2）：139-152.