賀 然 崔 夏 應(yīng) 玥 曲良建 王瑞珍 張永安

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 國(guó)家林業(yè)和草原局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091；2.北京市植物園 北京市花卉園藝工程技術(shù)研究中心 北京 100093；3.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院華北林業(yè)實(shí)驗(yàn)中心 北京 102300)

松褐天牛(Monochamusalternatus)隸屬于天?？?Cerambycidae)墨天牛屬，主要危害馬尾松(Pinusmassoniana)、油松(Pinustabulaeformis)、黑松(Pinusthunbergii)等，不但蛀干危害樹木，還傳播松材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)，每年都給林業(yè)生產(chǎn)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(李建慶等，2006)。對(duì)媒介昆蟲松褐天牛的防控是目前防控松材線蟲病的主要的有效途徑之一(楊忠岐等，2018；史先慧等，2017)?，F(xiàn)已從昆蟲中分離了超過1 000種病原體，并且許多病原體有潛力發(fā)展成無公害的有效殺蟲劑。到目前為止，昆蟲病原真菌的 13 個(gè)種或亞種已經(jīng)配制并登記為真菌殺蟲劑(Mycoinsecticides)，主要是子囊菌的金龜子綠僵菌(Metarhiziumanisopliae)和球孢白僵菌(Beauveriabassiana)(王瑞珍，2017；Rodriguesetal.,2017；Farajietal.，2016)。白僵菌(Beauveria)是自然界常見的蟲生真菌之一，具有廣泛的昆蟲寄生域，可侵染15個(gè)目149個(gè)科521個(gè)屬的707種昆蟲及13種蜱螨類(米紅霞等，2010)。白僵菌是目前被廣泛研究和應(yīng)用于林業(yè)害蟲防治的一種無公害微生物殺蟲劑(lvarez-Bazetal.，2015；Petersen-Silvaetal.，2015；Koirietal.，2017)。林業(yè)上多采用噴灑白僵菌的方法進(jìn)行害蟲防治。球孢白僵菌對(duì)寄主的毒力具有較大的專一性,來自同一寄主不同蟲尸的分離株的毒力也有一定差異，因此，選擇對(duì)靶標(biāo)害蟲具有高毒力的菌株已成為防治害蟲的關(guān)鍵(吳正愷等，1988；丁俊男等，2017)。利用白僵菌防治松褐天牛來控制松樹線蟲病的發(fā)生發(fā)展是一條重要途徑，而篩選對(duì)松褐天牛具有強(qiáng)毒力的優(yōu)良菌株是成功進(jìn)行生產(chǎn)防治的前提(馬良進(jìn)等，2006)?，F(xiàn)有的研究多以松褐天牛幼蟲作為測(cè)試對(duì)象(Shimazuetal.，2003；1992；劉洪劍等，2009；王曦茁等，2014；詹偉君等，2013)，而且蟲齡越小越容易感病(詹偉君等，2013)。盡管白僵菌對(duì)松褐天牛幼蟲較為有效(Shimazu，2004)，但在生產(chǎn)實(shí)踐中，由于隱蔽生活的習(xí)性，白僵菌孢子很難接觸到松褐天牛幼蟲蟲體而防效較差(陽飛等，2014)。成蟲期是松褐天牛暴露時(shí)期，白僵菌對(duì)松褐天牛成蟲的敏感性很低，需要較長(zhǎng)的時(shí)間才能將其殺死，較長(zhǎng)的致死周期會(huì)導(dǎo)致松褐天牛成蟲繼續(xù)產(chǎn)卵并傳播松材線蟲(Maeharaetal.，2007；Shimazu，1983)。白僵菌若能對(duì)松褐天牛成蟲也具有較好的防治效果，將減少松褐天牛危害，并減少化學(xué)殺蟲劑的使用(Shimazu，2004)。本研究通過一組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，室內(nèi)篩選出適合生物防治松褐天牛成蟲的白僵菌菌株，并進(jìn)行形態(tài)和分子鑒定，為用球孢白僵菌野外防治松褐天牛成蟲提供優(yōu)秀菌株。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx與菌株

供試菌株分離自被病原真菌感染的松褐天牛幼蟲，采集地點(diǎn)為浙江富陽。菌株保存在中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所昆蟲病毒研發(fā)中心。25 ℃條件下PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)分離到的病原真菌菌株。松褐天牛成蟲為中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所昆蟲病毒研發(fā)中心飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：25 ℃，相對(duì)濕度60%，光周期16 L∶8D，選擇羽化5～10天的健壯成蟲，供生物測(cè)定使用。

1.2 生物測(cè)定

在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得病原真菌孢子，分別溶于0.05%的吐溫80溶液中，配制成終濃度分別為1×106～3×106或者1×107～3×107個(gè)·mL-1的孢子懸浮液，0.05%的吐溫80溶液作為空白對(duì)照。采用涂枝法和噴灑法2種方法接種。噴灑法：1×106～3×106或者1×107～3×107個(gè)·mL-1的孢子懸浮液(處理)和0.05%的吐溫80溶液(對(duì)照)10 mL，分別噴灑至整理箱內(nèi)的松枝上。涂枝法：分別用1×107個(gè)·mL-1的孢子懸浮液(處理)和0.05%的吐溫80溶液(對(duì)照)10 mL完全涂抹至整理箱內(nèi)的黑松松枝上，接種松褐天牛。每個(gè)整理箱的大小為560 mm×400 mm×320 mm，每箱放1個(gè)木段，1個(gè)潮濕的棉球，5～6個(gè)細(xì)枝條。以上3種方法各組有10頭成蟲，重復(fù)3次。每天觀察、記錄各個(gè)處理的成蟲死亡情況，及時(shí)移出死亡的天牛成蟲。為確認(rèn)是否為白僵菌感染，棉球保濕2周，查看蟲體，觀察是否為白僵菌的死亡癥狀。最后，統(tǒng)計(jì)各對(duì)照組和處理組的不同時(shí)間死亡數(shù)。

1.3 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)生物測(cè)定數(shù)據(jù)，分別計(jì)算不同處理的死亡(侵染)率，并以Abbott公式進(jìn)行校正，即：死亡率=處理死亡數(shù)/處理總蟲數(shù)×100%。校正死亡率=(處理死亡率-對(duì)照死亡率)/(1-對(duì)照死亡率)×100%。侵染率=受侵染蟲數(shù)/處理總蟲數(shù)×100%。

利用R軟件(ver.3.5.0)(R Core Team，2014)中的“aov”函數(shù)進(jìn)行方差分析，并利用F-test檢驗(yàn)各個(gè)主因素及交互的顯著性。若主因素及交互作用不顯著，則將其剔除并重新分析。折線圖由R包“ggplot2”繪制。

1.4 DNA提取、PCR擴(kuò)增及連接轉(zhuǎn)化

DNA提取用TakaraDNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit，貨號(hào)9768)。擴(kuò)增引物采用ITS1 5′-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3′和ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3′引物對(duì)。

PCR反應(yīng)體系為參照Takara Ex Taq使用說明書：50 μL反應(yīng)體系:Takara Ex Taq(5U·μL-1)0.25 μL、引物0.2～ 1.0 μmol·L-1、10×Ex Taq Buffer(Mg2+plus)(20 mmol·L-1)5 μL、dNTP Mixture(各2.5 mmol·L-1)4 μL、DNA模板<500 ng，補(bǔ)滅菌水至50 μL。

PCR反應(yīng)條件如下：變性5 min，94 ℃ 30 s、50 ℃ 45 s和72 ℃ 1 min 30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物大小，用TaKaRa膠回收試劑盒(MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.4.0，貨號(hào)9762)，回收PCR產(chǎn)物，克隆至pMD20-T載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌(Escherichiacoli)JM109感受態(tài)細(xì)胞，擴(kuò)繁提取質(zhì)粒，送至美吉公司進(jìn)行測(cè)序。

1.5 系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將ITS序列提交至NCBI，下載相似度最高的36條序列，采用軟件muscle(Edgar，2004)進(jìn)行序列比對(duì)。采用MEGA軟件(ver 7.0)(Kumar，2016)中的最大似然法(maximum likelihood，ML)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定該菌株所在分支。ML法采用的統(tǒng)計(jì)模型為GTR+I，bootstrap值設(shè)為1 000。B9菌株的GenBank登錄號(hào)為MN623376。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離純化和初步毒力測(cè)試

從感染的23頭松褐天牛幼蟲中共分離出23株白僵菌，分別標(biāo)記為B1—B23。分別在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，收集孢子并配制成106個(gè)·mL-1的孢子懸浮液，進(jìn)行各菌株的毒力測(cè)試。先對(duì)松枝噴灑白僵菌孢子懸浮液，再放入松褐天牛成蟲，每天觀察松褐天牛成蟲的死亡情況。處理9天時(shí)，松褐天牛成蟲開始死亡。觀察至18天，共有B6、B7、B9、B10、B11、B19共6株菌株累計(jì)校正死亡率在30%以上，分別為30.0%±10.0%、33.3%±15.3%、36.7%±15.3%、30.0%±20%、30.0%±10%和33.3%±20.8%，而其他菌株處理組沒有死亡。生物測(cè)定結(jié)果表明，松褐天牛成蟲被白僵菌感染初期，活動(dòng)能力逐漸減弱并且行動(dòng)遲緩。將死亡的松褐天牛成蟲蟲體經(jīng)過保濕培養(yǎng)，圖1a、b顯示蟲體背腹部呈現(xiàn)出白色菌絲，菌絲逐漸遍布全身，直至產(chǎn)生粉狀的白色孢子，該癥狀是白僵菌感染的典型癥狀，保濕培養(yǎng)2、4和6天的癥狀見圖2，保濕培養(yǎng)4天蟲體上長(zhǎng)滿白色的菌絲，6天開始大量產(chǎn)生孢子。

圖1 白僵菌感染松褐天牛成蟲癥狀Fig.1 Symptoms of M.alternatus adults infected by Beauveria sp.a.背部Back；b.腹部Abdomen.

圖2 松褐天牛成蟲死亡后棉花保濕2、4、6天的癥狀(浸漬法)Fig.2 Symptoms of cotton moisturizing for 2,4,6 d after death of adult M.alternatus (dipping method)

2.2 菌株篩選和涂枝法毒力測(cè)試

將上述6株白僵菌進(jìn)行PDA固態(tài)培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，B7和B92個(gè)菌株產(chǎn)孢量大，生長(zhǎng)至14天時(shí)的產(chǎn)孢量在108·cm-2，大于其他4株白僵菌的產(chǎn)孢量(107·cm-2)。因此，選取B7和B92個(gè)菌株再次進(jìn)行毒力測(cè)試。以107個(gè)·mL-1共10 mL的孢子懸浮液、采用涂枝法進(jìn)行毒力測(cè)試。隨侵染時(shí)間的累計(jì)校正死亡率如圖3所示：B9菌株的致死速率顯著高于B7菌株；B9菌株在12天的累計(jì)校正死亡率即可達(dá)到100%，而B7菌株在12天時(shí)的累計(jì)校正死亡率約為50%±10%，在16天的累計(jì)校正死亡率可以達(dá)到100%。因此確定B9為23株白僵菌中對(duì)松褐天牛成蟲致死效果最好的白僵菌生防菌株。

圖3 B7和B9菌株的涂枝法毒力測(cè)試Fig.3 Virulence test of B7 and B9 strains based on method of applying spore suspension to branch

2.3 B9菌株噴灑法毒力測(cè)試

將B9菌株孢子配置成107個(gè)·mL-1的孢子懸浮液，用噴灑的方法測(cè)試對(duì)松褐天牛成蟲的毒力效果，結(jié)果如圖4所示：隨時(shí)間的延長(zhǎng)，累計(jì)校正死亡率逐漸增高。12天的累計(jì)校正死亡率為23.3%±5.7%，20和24天的累計(jì)校正死亡率均約為70%±10%，使用同樣濃度和體積的孢子懸浮液，該方法的效果不如涂枝法的效果(圖3)。

圖4 B9菌株的噴灑法毒力測(cè)試Fig.4 Virulence test of B9 strain based on spraying method

2.4 菌株鑒定

B9菌株菌落正面白色(圖5a)，后期粉末狀，背面稍微偏黃(圖5b)，分生孢子著生在產(chǎn)孢細(xì)胞延伸而成的“之”字形狀結(jié)構(gòu)上，分生孢子為球形(圖5c)，直徑為2.0～4.0 μm。以B9菌株基因組DNA為模板，用通用引物ITS1和ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增、回收和克隆，測(cè)序結(jié)果獲得570 bp的擴(kuò)增產(chǎn)物。NCBI中Blast比對(duì)發(fā)現(xiàn)與球孢白僵菌的同源性為99%。選用36株與之相似度高的真菌序列，利用最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖6所示。從圖中可以看出，B9菌株與球孢白僵菌聚為同一分支上。因此，從形態(tài)、NCBI Blast比對(duì)結(jié)果和系統(tǒng)發(fā)育樹共同確定該B9菌株為球孢白僵菌。

圖5 白僵菌菌落和分生孢子形態(tài)Fig.5 Morphology of Beauveria colonies and conidiophores

3 討論

近年來，利用白僵菌防治松褐天牛的研究，很多以松褐天牛幼蟲為試驗(yàn)對(duì)象。葉斌等(2011)于2010年7月上中旬在山林中釋放攜帶白僵菌的蚤蠅(Phoridae)，松褐天牛低齡幼蟲校正死亡率為35%。當(dāng)釋放攜帶白僵菌的管氏腫腿蜂(Sclerodermaguani)時(shí)，松褐天牛4齡幼蟲的死亡率可高達(dá)94.4%(劉洪劍等，2007)。成蟲期是松褐天牛一生中的暴露生活時(shí)期，篩選對(duì)松褐天牛成蟲有效的白僵菌菌株在防治該害蟲上尤為重要。筆者從野外獲得的白僵菌感染的松褐天牛幼蟲蟲體中分離出23株白僵菌菌株，通過不同的毒力測(cè)試方法研究對(duì)松褐天牛成蟲的致死效果，從中篩選出1株對(duì)松褐天牛成蟲毒力較強(qiáng)的菌株并進(jìn)行了鑒定。

本研究以白僵菌孢子懸浮液，采用涂枝法、噴灑法2種方法進(jìn)行毒力測(cè)試。研究結(jié)果顯示：涂枝法中B9菌株在12天時(shí)的累計(jì)校正死亡率即可達(dá)到100%。Tomimoto等(2007)用白僵菌無紡布菌條方法15天時(shí)成蟲死亡率可達(dá)20%～52%，該試驗(yàn)使用的是白僵菌無紡布菌條，而且用的是木段，筆者試驗(yàn)使用的是松褐天牛取食的部位——帶有松針的小枝條。B9菌株噴灑法24天時(shí)的累計(jì)校正死亡率約為70%±10%。雖然2種方法采用的孢子懸浮液濃度和體積相同，但利用噴灑法將白僵菌孢子懸浮液噴灑至整個(gè)整理箱內(nèi)，松樹枝條單位空間的孢子含量必然低于涂枝法，噴灑法中松褐天牛實(shí)際上接觸到的白僵菌濃度低、數(shù)量少，幾率低。可能筆者使用的孢子懸浮液體積太少導(dǎo)致噴灑方法的致死中時(shí)間較長(zhǎng)，但該方法更利于野外操作，野外實(shí)際應(yīng)用時(shí)可以加大噴灑孢子懸浮液的體積和濃度。

我國(guó)松林深受松材線蟲病危害(楊寶君等，1988)，控制傳播媒介松褐天牛就顯得尤為重要(馮益明等，2009)。蟲生真菌的控制效果，首先在于獲得目標(biāo)害蟲的高毒力優(yōu)良菌株(詹偉君等，2013)?？蓮亩矫嬲归_工作：一是以松樹不同部位為基質(zhì)對(duì)白僵菌進(jìn)行培養(yǎng)馴化，并研究白僵菌是否能在松樹中定植，從而作為松樹內(nèi)生真菌控制松褐天牛幼蟲；二是繼續(xù)以松褐天牛成蟲馴化白僵菌，以期獲得更快速致病、殺蟲時(shí)間更短的菌株。通過逐步對(duì)白僵菌進(jìn)行馴化，使其在野外對(duì)松褐天牛有更高的致死率和致死速度，從而更好地控制松材線蟲的傳播，保護(hù)黑松、赤松(P.densiflora)等重要的林木資源。

4 結(jié)論

本研究篩選得到對(duì)松褐天牛成蟲具有高毒力的白僵菌菌株，并對(duì)其進(jìn)行了形態(tài)和分子鑒定，為利用球孢白僵菌野外防治松褐天牛成蟲提供了一個(gè)優(yōu)秀的菌株。