郭濤弦 范紅松 羅勤

四川省眉山市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科620010

肺癌大多起源于支氣管黏膜上皮,隨著病情不斷進(jìn)展,腫瘤可向支氣管腔內(nèi)和/或鄰近的肺組織生長,且可經(jīng)支氣管、血行、淋巴轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。在所有肺癌病例中,非小細(xì)胞肺癌 (non-s mall-cell l ung cancer,NSCLC)約占85%,相比小細(xì)胞肺癌而言,其擴(kuò)散轉(zhuǎn)移相對(duì)較晚、癌細(xì)胞生長分裂較慢,但多數(shù)患者因無典型的早期癥狀,故診斷時(shí)常處于中晚期,早期確診率較低,5 年生存率較低[1]。分子生物學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在腫瘤的發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移等一系列病理過程中,腫瘤細(xì)胞的某些基因活性表達(dá)發(fā)揮著重要作用[2-3]。因此,需積極尋找一種新的非侵入性血清生物標(biāo)志物,以促進(jìn)NSCLC的早期診斷、早治療,改善患者預(yù)后?；|(zhì)金屬蛋白酶 (matrix metalloproteinases,MMPs)屬于一組鈣和鋅依賴性酶,可降解細(xì)胞外基質(zhì)中諸多成分,與腫瘤等多種疾病發(fā)生、進(jìn)展息息相關(guān)[4]。S100蛋白家族包括25 個(gè)鈣結(jié)合蛋白,在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細(xì)胞侵襲及分化過程中均發(fā)揮重要作用,且其多個(gè)成員與細(xì)胞周期進(jìn)程及炎癥反應(yīng)有關(guān)[5]。鑒于此,本研究就非小細(xì)胞肺癌患者血清S100鈣結(jié)合蛋白A8/鈣粒蛋白A (ser u m S100 cal bindin A8,S100 A8)、S100 A9、MMP-9 的 表達(dá)及意義進(jìn)行如下分析,旨在指導(dǎo)臨床合理診治。具體信息如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 將2017年1月至2020年1月于四川省眉山市人民醫(yī)院就診的16例NSCLC 患者納入NSCLC組進(jìn)行回顧性研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合《肺癌篩查與管理中國專家共識(shí)》[6]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)并經(jīng)病理學(xué)(手術(shù)后病理標(biāo)本或細(xì)針穿刺標(biāo)本)確診為原發(fā)性NSCLC 患者;國際抗癌聯(lián)盟TNM 分期為Ⅰ～Ⅲ期;未接受過任何放化療、免疫治療等;凝血功能正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：伴有其他惡性腫瘤;肝腎功能不全。其中男10例,女6例;年齡(61.23±4.98)歲,年齡范圍為42～82歲;組織學(xué)類型：腺癌9例,鱗癌7例;TNM 分期：Ⅰ期5例,Ⅱ期7例,Ⅲ期4例;組織分化：低分化6例,中高分化10例;淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移7例,淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移9例;腫瘤大小直徑：≥3 c m 6例,<3 c m 10例。將同期20 例肺部良性疾病患者作為良性組,其中男13 例,女7例;年齡 (60.76±4.47)歲,年齡范圍為40～83歲。另選同期20名健康受試者作為對(duì)照組,其中男14 名,女6 名;年齡(61.15±4.82)歲,年齡范圍為39～81歲。3 組受試者年齡、性別分布均衡性良好 (P值均>0.05),可對(duì)比。本研究通過四川省眉山市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(HC20160097),且所有受試者均于知情書上簽字。

1.2 方法 于所有受試者入院當(dāng)天取其清晨空腹外周血5 ml,室溫下,以轉(zhuǎn)速為3 000 r/min、半徑為6 c m 進(jìn)行10 min的離心,離心機(jī)為北京白洋醫(yī)療器材有限公司生產(chǎn)的BY-600C 型醫(yī)用離心機(jī)。取上清液,置于-80 ℃冰箱中 [型號(hào)SANYO MDF-382E (N)冰箱,日本三洋公司]待測。通過酶聯(lián)免疫吸附法測定3 組血清S100 A8、S100 A9、MMP-9水平,其中S100 A8、S100 A9試劑盒購自上海將來實(shí)業(yè)股份有限公司,MMP-9試劑盒購自廣州市安杰生物技術(shù)有限公司。所有操作均嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行,且遵循無菌操作。

1.3 觀察指標(biāo) 對(duì)比健康組、良性組、NSCLC組的血清S100A8、S100 A9、MMP-9 表達(dá)差異,經(jīng)受試者工作特征曲線 (receiver operating characteristic cur ve,ROC)分析血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表達(dá)預(yù)測NSCLC 的診斷價(jià)值;對(duì)比NSCLC 不同病理特征患者的血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表達(dá)差異,并進(jìn)一步分析各指標(biāo)與不同病理特征的相關(guān)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,計(jì)量資料以±s表示,多組間比較采用單因素方差分析,采用SNK-q行組間兩兩檢驗(yàn)。繪制ROC 得到曲線下面積 (area under the curve,AUC),檢驗(yàn)血清S100 A8、S100 A9、MMP-9 表達(dá)預(yù)測NSCLC的診斷價(jià)值：AUC<0.5無價(jià)值,≥0.5且<0.7診斷價(jià)值較低,≥0.7且≤0.9診斷價(jià)值中等,>0.9診斷價(jià)值高。相關(guān)性采用Spear man等級(jí)相關(guān)性分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表達(dá) NSCLC組血清S100A8、S100 A9 及MMP-9 水平均>良性組>健康組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P值均<0.05),見表1。

2.2 血 清S100 A8、S100A9、MMP-9 表 達(dá) 預(yù) 測NSCLC的診斷價(jià)值 繪制ROC 結(jié)果顯示,血清S100A8、S100 A9預(yù)測NSCLC的AUC分別為0.953、0.977,診斷價(jià)值高;血清MMP-9預(yù)測NSCLC的AUC為0.846,診斷價(jià)值中等。見表2、圖1。

表2 血清S100 A8、S100 A9、MMP-9的受試者工作特征曲線結(jié)果

圖1 血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表達(dá)預(yù)測非小細(xì)胞肺癌的受試者工作特征曲線圖

2.3 不同特征非小細(xì)胞肺癌患者血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表達(dá) 不同組織分化、TNM 分期的S100 A8、S100A9、MMP-9 表達(dá)相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05);淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移的MMP-9 相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=2.321,P<0.05),見表3。經(jīng)Spear man 等級(jí)相關(guān)分析法發(fā)現(xiàn),S100 A8、S100 A9、MMP-9 表達(dá)與組織分化程度均呈負(fù)相關(guān) (r= -0.585、-0.421、-0.684,P值均<0.001),與各TNM分期均呈正相關(guān) (r=0.532、0.712、0.683,P值均<0.001);且MMP-9表達(dá)與有無淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)(r=0.811,P<0.001)。

3 討論

肺癌是臨床上常見的肺部惡性腫瘤。近年來我國NSCLC發(fā)病率呈總體上升趨勢,而浸潤、轉(zhuǎn)移是造成NSCLC患者死亡的主要原因之一。腫瘤的浸潤、轉(zhuǎn)移屬于一個(gè)多步驟、多因素的連續(xù)化復(fù)雜過程,諸多基因參與其中,且與基因的調(diào)控、表達(dá)息息相關(guān)[7]。故積極探討一種敏感度高、非侵入性的腫瘤標(biāo)志物在臨床診治惡性腫瘤中意義重大。

細(xì)胞基質(zhì)及細(xì)胞基膜是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的天然屏障,此過程會(huì)激發(fā)機(jī)體釋放蛋白酶類,以促進(jìn)細(xì)胞基質(zhì)降解。而MMPs在腫瘤轉(zhuǎn)移期間發(fā)揮重要作用,其是降解細(xì)胞外基因不可或缺的酶,且表達(dá)水平可作為判斷NSCLC 患者不良預(yù)后的指標(biāo)[8-9]。MMP-9參與腫瘤血管網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及延伸過程中,作為MMPs家族中分子量最大的酶,其主要功能在于降解及破壞Ⅳ、Ⅴ型膠原及明膠等細(xì)胞外基因中最主要的組分,且可降解基底膜,降低腫瘤細(xì)胞穿透基底膜浸潤結(jié)締組織基質(zhì)的難度,進(jìn)而對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移、浸潤等過程產(chǎn)生一定的影響[10-11]。本研究中,NSCLC組血清MMP-9水平最高,其次為良性組,最低為健康組,預(yù)測NSCLC 的AUC>0.8,診斷價(jià)值中等,且不同組織分化、TNM 分期及淋巴轉(zhuǎn)移是否轉(zhuǎn)移患者的MMP-9 水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,從而可推斷MMP-9與NSCLC的發(fā)生、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、高低分化等密切相關(guān),可作為病情惡化的潛在標(biāo)志。

表1 3組血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表達(dá)對(duì)比 (±s)

表1 3組血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表達(dá)對(duì)比 (±s)

注：S100 A8為S100鈣結(jié)合蛋白A8;S100 A9為S100鈣結(jié)合蛋白A9;MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶9

組別 例數(shù) S100 A8 (μg/L) S100 A9 (ng/L) MMP-9 (μg/L)健康組 20 2.09±0.26 171.08±17.03 131.70±16.68良性組 20 4.02±0.48 203.87±23.06 160.28±17.62 NSCLC組 16 6.13±0.75 261.97±28.85 180.62±20.12 F 值 273.116 69.954 33.589 P 值 <0.001 <0.001 <0.001

表3 不同特征非小細(xì)胞肺癌患者血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表達(dá) (±s)

表3 不同特征非小細(xì)胞肺癌患者血清S100 A8、S100 A9、MMP-9表達(dá) (±s)

注：S100A8為S100鈣結(jié)合蛋白A8;S100 A9為S100鈣結(jié)合蛋白A9;MMP-9為基質(zhì)金屬蛋白酶9

項(xiàng)目 例數(shù) S100A8 (μg/L)S100 A9 (ng/L)MMP-9 (μg/L)水平 統(tǒng)計(jì)值 P 值水平 統(tǒng)計(jì)值 P 值水平 統(tǒng)計(jì)值 P 值性別 t=0.397 0.697 t=0.267 0.793 t=0.173 0.865男10 6.24±0.76 264.16±29.13 179.34±19.65 女 6 6.09±0.68 260.09±30.24 181.16±21.57年齡 t=0.379 0.710 t=0.060 0.953 t=0.288 0.777 ≥60歲 12 6.19±0.81 262.24±30.46 183.45±20.07 <60歲 4 6.02±0.64 261.18±31.47 180.07±21.17組織學(xué)類型 t=0.833 0.418 t=0.132 0.897 t=0.212 0.835 腺癌 9 6.31±0.74 260.46±29.86 182.24±20.07 鱗癌 7 5.99±0.79 262.47±30.75 180.04±21.27 TNM 分期 F =8.947 0.004 F =8.269 0.005 F =4.683 0.029 Ⅰ期 5 5.01±0.61 211.21±26.67 158.86±18.84 Ⅱ期 7 5.97±0.76 259.75±30.04 181.16±20.75 Ⅲ期 4 7.11±0.85 289.97±32.37 201.04±22.76組織分化 t=2.949 0.010 t=3.680 0.002 t=3.682 0.002 低分化 6 6.89±0.78 291.46±33.12 207.16±21.49 中高分化 10 5.76±0.72 231.87±30.34 169.46±18.84淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移 t=0.687 0.505 t=0.244 0.811 t=2.321 0.039 是 7 6.31±0.79 263.34±30.21 191.61±21.17 否 9 6.02±0.72 259.27±29.75 164.52±20.75腫瘤直徑 t=0.238 0.815 t=0.441 0.666 t=1.193 0.251 ≥3 c m 6 6.19±0.72 264.24±29.94 186.64±20.45 <3 c m 10 6.10±0.74 257.34±30.49 174.32±19.74

S100家族屬于鈣離子結(jié)合蛋白,共包含23個(gè)成員,且含有可與鈣離子高親和性、高選擇性結(jié)合的14個(gè)氨基酸序列,與鈣離子結(jié)合后可參與細(xì)胞分化、增殖、凋亡及基因表達(dá)、分泌、肌肉收縮等過程[12]。其中S100A8 定位于人染色體1q21,該區(qū)具有穩(wěn)定性差及易發(fā)生染色體重疊、缺失等特點(diǎn)。該蛋白表達(dá)于肥大細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等骨髓來源的細(xì)胞中,于淋巴細(xì)胞中未見表達(dá)。臨床推測,S100 A8 濃度在20～250 mg/L (較高濃度)時(shí),可誘導(dǎo)腫瘤的凋亡,而在<20 mg/L(較低濃度)時(shí)可進(jìn)一步加快腫瘤細(xì)胞增殖[13]。S100 A9屬于一種神經(jīng)系統(tǒng)特異性蛋白混合物,多與S100 A8通過鈣離子依賴性形式而組成二聚體(四聚體),常于單核-巨噬細(xì)胞系、中性粒細(xì)胞等中表達(dá),且可抑制酪蛋白激酶的活性[14-15]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),NSCLC 組血清S100 A8、S100 A9水平均>良性組>健康組,二者預(yù)測NSCLC 的AUC均>0.9,診斷價(jià)值較高,且S100 A8、S100 A9水平與NSCLC的組織學(xué)類型、TNM 分期密切相關(guān),進(jìn)一步證實(shí)S100 A8、S100 A9 蛋白家族參與了NSCLC的發(fā)病及進(jìn)展等病理生理過程。在腫瘤微環(huán)境中,S100 A8、S100 A9功能多樣且表達(dá)具有差異性,可通過多種機(jī)制發(fā)揮促腫瘤及抗腫瘤的雙重作用：(1)抗腫瘤。經(jīng)線粒體-細(xì)胞色素C 旁路途徑,S100 A8、S100 A9蛋白復(fù)合物可促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-XL、Bcl-2 表達(dá)下調(diào),誘導(dǎo)線粒體釋放Smac/DIABLO 及Omi/Htr A2,進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤效果;經(jīng)Zn2+與S100 A8、S100 A9 結(jié)合,促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Zn2+含量降低,啟動(dòng)凋亡程序,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16-17]。(2)促腫瘤。S100 A8、S100 A9與遷移能力及細(xì)胞活力息息相關(guān),參與腫瘤的轉(zhuǎn)移及浸潤過程,且與遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移灶轉(zhuǎn)移前環(huán)境形成相關(guān)。S100 A8、S100 A9 可 經(jīng)RAGE 對(duì)JNK 及MAPK信號(hào)通路產(chǎn)生作用,促進(jìn)核因子KB因子激活,進(jìn)而可加快腫瘤細(xì)胞的分裂過程,激活癌基因[18]。髓源性抑制細(xì)胞是一群缺乏淋巴系成熟標(biāo)志的異質(zhì)細(xì)胞,具有免疫抑制功能及多向分化潛能,在腫瘤微環(huán)境的免疫抑制細(xì)胞中,其執(zhí)行著負(fù)向免疫調(diào)控作用,可一定程度上造成免疫抑制,阻礙宿主的積極免疫治療[19-20]。而S100A8、S100A9 能夠促進(jìn)髓源性抑制細(xì)胞的免疫抑制及聚集,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。但本研究仍存在一定不足,如納入病例數(shù)較少,未分析S100 A8、S100 A9及MMP-9三者間相關(guān)性,未分析不同時(shí)間點(diǎn)的血清指標(biāo)水平等,故后期尚需要開展多中心、大樣本、前瞻性研究,以證實(shí)本研究結(jié)果。

綜上所述,NSCLC 患者血清中S100 A8、S100 A9及MMP-9水平均呈高表達(dá),且與組織分化程度、TNM 分期等病理特征密切相關(guān),可作為診斷NSCLC及評(píng)估預(yù)后的潛在分子標(biāo)志物。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突