何 迪，耿麗平，郭 佳，陸秀君，劉文菊，李博文

草酸青霉菌HB1溶磷能力及作用機(jī)制

何 迪1，耿麗平1，郭 佳1，陸秀君2，劉文菊1※，李博文1

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，河北省農(nóng)田生態(tài)環(huán)境重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北省蔬菜產(chǎn)業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，保定 071001；2. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，保定 071001）

一些功能微生物具有溶磷能力且同一菌株對(duì)不同難溶性磷酸鹽的溶解能力存在差異。該研究以草酸青霉菌HB1為研究對(duì)象，通過(guò)固體平板培養(yǎng)試驗(yàn)、搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)和土壤培養(yǎng)試驗(yàn)系統(tǒng)研究了不同磷源（磷酸鈣、磷礦粉、磷酸鐵、磷酸鋁）與氮源（銨態(tài)氮、硝態(tài)氮）供應(yīng)下HB1溶磷能力及其作用機(jī)制，并驗(yàn)證了其在高、低不同磷水平土壤中的溶磷能力。結(jié)果表明，接種HB1的不同磷源培養(yǎng)基上均有溶磷圈出現(xiàn)，根據(jù)溶磷圈直徑/菌落直徑初步確定HB1溶解磷酸鈣的能力較強(qiáng)；搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)表明供試磷源為磷酸鈣、磷酸鐵時(shí)HB1發(fā)酵液中有效磷含量為884、265 mg/L（銨態(tài)氮），或945、206 mg/L（硝態(tài)氮），其溶磷能力不受氮源形態(tài)影響；磷礦粉為磷源時(shí)，HB1發(fā)酵液中有效磷含量可達(dá)199 mg/L（供應(yīng)銨態(tài)氮），為硝態(tài)氮供應(yīng)的7.14倍；而磷酸鋁為磷源時(shí)，HB1發(fā)酵液中有效磷含量為120 mg/L（供應(yīng)硝態(tài)氮），為銨態(tài)氮供應(yīng)的3.29倍；此外，供應(yīng)銨態(tài)氮條件下，HB1對(duì)難溶性磷酸鹽的溶解能力與介質(zhì)中pH值呈顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系。HB1接種于不同磷水平的土壤中培養(yǎng)21 d，在低磷和高磷土壤中HB1均能有效定殖且增加了土壤有效磷含量，比不接菌對(duì)照分別增加45.00%和14.17%。綜上，草酸青霉菌HB1對(duì)磷酸鈣和磷礦粉的溶磷效果較好，并通過(guò)分泌氫質(zhì)子酸解含磷礦物實(shí)現(xiàn)溶磷作用，且HB1在低磷土壤中溶磷能力較強(qiáng)。

磷；土壤；菌；難溶性磷源；土壤定殖；革酸青霉菌HB1

0 引 言

磷作為植物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的營(yíng)養(yǎng)元素之一[1]，在土壤中儲(chǔ)量豐富，但95%是難以被植物直接吸收利用的無(wú)效態(tài)[2-3]。上個(gè)世紀(jì)80年代，中國(guó)約74%的農(nóng)田土壤存在磷貧瘠現(xiàn)象[4]。因此，化學(xué)磷肥成為當(dāng)時(shí)促進(jìn)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要磷素來(lái)源。然而，化肥磷素進(jìn)入土壤后會(huì)因土壤本身的理化特性和磷酸鹽的化學(xué)行為而轉(zhuǎn)化為難溶性磷酸鹽，使磷肥的當(dāng)季利用率降低，造成大量未被植物利用的磷素殘留在土壤中。近年來(lái)，固定在表層土壤中的大量磷素也會(huì)徑流進(jìn)入地表水體而產(chǎn)生富營(yíng)養(yǎng)的環(huán)境問(wèn)題[4-6]。因此，探索土壤中難溶態(tài)磷活化的途徑和方法至關(guān)重要[2]。土壤中存在大量的微生物具有將難溶態(tài)含磷化合物轉(zhuǎn)化為有效態(tài)的能力，其數(shù)量約為土壤微生物總量的十分之一，且種類(lèi)多樣[7]，這些微生物統(tǒng)稱(chēng)為溶磷微生物或溶磷菌。長(zhǎng)期以來(lái)，研究者一直致力于挖掘自然環(huán)境介質(zhì)中存在的具有溶磷作用的功能微生物或功能菌的研究，以促進(jìn)作物生育期內(nèi)土壤磷素的釋放，提高土壤磷素利用率，從而減少大量施用含磷化肥造成的水體富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題等[8]。

礦物態(tài)磷在中國(guó)土壤中的存在形式不一，在北方石灰性土壤中主要以磷酸鈣鹽的形式存在[9]；在南方酸性土壤中，主要以粉紅磷鐵礦、藍(lán)鐵礦和閉蓄態(tài)磷酸鐵、鋁鹽形式存在[7]。溶磷菌可活化難溶磷酸鹽，但同一菌株對(duì)不同磷酸鹽的溶解能力存在差異。另外，有研究表明，同一溶磷菌株在生長(zhǎng)過(guò)程中供試氮源條件不同其溶磷效果也存在差異[10]。Whitelaw 等[11]研究證實(shí)青霉菌（）對(duì)Ca-P、Al-P的溶解能力較高，而對(duì)Fe-P的溶解能力很差。Reddy 等[12 ]研究了曲霉菌對(duì)不同磷礦石的溶解作用，發(fā)現(xiàn)不同曲霉菌菌株選擇不同的磷源作為其生長(zhǎng)物質(zhì)。趙小蓉等[13]研究表明，真菌的溶磷能力高于細(xì)菌，大多數(shù)真菌對(duì)Ca3(PO4)2的溶解能力較強(qiáng)，對(duì)Fe-P的溶解能力較低，并且有些菌株（如歐文氏菌4TCRi 22）完全不能溶解Fe-P和Al-P?；诖?，本研究以研究小組自主篩選的草酸青霉菌HB1[14]為供試菌株，通過(guò)固體平板和液體搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)研究草酸青霉菌HB1溶解不同礦物態(tài)磷的能力及作用機(jī)制；通過(guò)土壤培養(yǎng)試驗(yàn)明確其活化土壤磷的能力，以期提供一株可用于微生物肥料開(kāi)發(fā)利用的優(yōu)良菌株。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1）供試菌株：草酸青霉菌（） HB1，本課題組自主篩選并保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏號(hào)為CGMCC No. 4842。

2）供試磷源：磷酸鈣、磷礦粉、磷酸鐵、磷酸鋁。

3）供試培養(yǎng)基：

① PDA固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，蔗糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH=7.0；

② PDA液體培養(yǎng)基：去除PDA固體培養(yǎng)基中的瓊脂，其他成分不變；

③無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.50 g，NaCl 0.30 g，KCl 0.30 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，酵母粉0.40 g，磷源10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH=7.0；

④無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基-銨態(tài)氮：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.50 g，NaCl 0.30 g，KCl 0.30 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，酵母粉0.40 g，磷源10 g，蒸餾水1 L，pH=7.0；

⑤無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基-硝態(tài)氮：葡萄糖10 g，NaNO30.64 g，NaCl 0.30 g，KCl 0.30 g，MgSO4·7H2O 0.30 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.03 g，酵母粉0.40 g，磷源10 g，蒸餾水1 L，pH=7.0。

4）供試土壤：試驗(yàn)用土取自河北省永清縣大青垡村（39°12′47″N，116°30′20″E），分別在黃瓜溫室的棚內(nèi)和棚外（2個(gè)溫室間的空地）取有效磷含量差異較大的土壤，取土?xí)r棚內(nèi)種植越冬一大茬黃瓜，棚外種植玉米。棚內(nèi)和棚外土壤質(zhì)地相同，其他基本理化性狀見(jiàn)表1，土壤酸堿度（pH）、電導(dǎo)率（EC）、堿解氮、全磷、速效磷、速效鉀、有機(jī)質(zhì)含量采用常規(guī)方法測(cè)定[15]。

表1 供試土壤的基本化學(xué)性質(zhì)

由表1可以看出，棚內(nèi)土壤養(yǎng)分含量高，棚外土壤養(yǎng)分含量低，與其他指標(biāo)相比，2種土壤有效磷含量差異最大，因此棚內(nèi)高養(yǎng)分含量土壤簡(jiǎn)稱(chēng)高磷土，棚外低養(yǎng)分含量土壤簡(jiǎn)稱(chēng)低磷土。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 固體平板培養(yǎng)試驗(yàn)

1）草酸青霉菌HB1菌株的活化：從保存的HB1斜面菌種上挑取一環(huán)轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)48～72 h，待長(zhǎng)滿整個(gè)平板。再?gòu)呐囵B(yǎng)好的平板上挑取菌種，轉(zhuǎn)接到PDA固體培養(yǎng)基上，于30 ℃培養(yǎng)72 h，待長(zhǎng)滿整個(gè)平板，備用。

2）試驗(yàn)步驟：分別將20 mL含不同磷源的無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基倒入已滅菌的培養(yǎng)皿中，晾干備用。在PDA液體培養(yǎng)基中接入1環(huán)（直徑1.50 mm）活化好的HB1菌，搖床培養(yǎng)18 h（200 r/min），然后吸取20L分別放在4種磷源的無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基培養(yǎng)皿的中心，水分吸收后倒置于30 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)8 d[12]。每個(gè)處理6次重復(fù)。

1.2.2 液體搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)

1）草酸青霉HB1菌株活化：同1.2.1（1）。

2）草酸青霉HB1菌液的制備：將活化好的HB1菌株用無(wú)菌水制成孢子懸浮液，制成其孢子數(shù)量約為1×108cfu/mL。

3）試驗(yàn)步驟：將50 mL無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基分裝于150 mL三角瓶中，再按固液比1∶100的比例稱(chēng)取不同礦物態(tài)磷源，調(diào)節(jié)pH值至7.0，121 ℃，滅菌20 min。冷卻后，按1%的接種量接入HB1孢子菌懸液，30 ℃，200 r/min，培養(yǎng)7 d。同時(shí)以接入等量無(wú)菌水和等量滅活HB1菌液做對(duì)照。

共設(shè)置3個(gè)處理：CK（等量無(wú)菌水）、HB1（等量含HB1的孢子菌懸液）、滅活HB1（等量滅活HB1菌液）。每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。

1.2.3 土壤培養(yǎng)試驗(yàn)

1）草酸青霉HB1菌株活化：同1.2.1（1）。

2）草酸青霉HB1菌液的制備：同1.2.2（2）。

3）試驗(yàn)步驟：分別稱(chēng)取兩種磷水平風(fēng)干土壤各30 g于離心管中，先加入6 mL的滅菌水潤(rùn)濕土壤，再加入4 mL的HB1孢子菌懸液，接種后的起始濃度為1.33×107cfu/g，同時(shí)以加入等量的滅菌水為對(duì)照，保持土壤濕度30%～50%，用封口膜將離心管封口，放入生化培養(yǎng)箱中，于30 ℃下培養(yǎng)40 d[16]。

設(shè)置4個(gè)處理：低磷土+HB1、低磷土+滅菌水、高磷土+HB1、高磷土+滅菌水，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 固體平板培養(yǎng)試驗(yàn)

從第3天開(kāi)始，每天測(cè)定菌落直徑、溶磷圈直徑，并計(jì)算溶磷圈直徑/菌落直徑[10]。

1.3.2 液體搖瓶培養(yǎng)試驗(yàn)

1）上清液中有效磷、pH測(cè)定：選擇HB1菌在兩種氮源供應(yīng)下取樣，氮源為銨態(tài)氮的處理分別于該菌在供應(yīng)銨態(tài)氮的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期內(nèi)的72、108和132 h取樣；氮源為硝態(tài)氮的處理分別于該菌在供應(yīng)硝態(tài)氮的生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期內(nèi)的84、120和144 h取樣。取樣時(shí)將三角瓶?jī)?nèi)發(fā)酵液全部倒入離心管中，10 000 r/min，離心10 min，再將全部上清液保存至50 mL離心管中，備用。采用鉬藍(lán)比色法[15]測(cè)定上清液中磷的含量，同時(shí)測(cè)定上清液pH。

2）有機(jī)酸種類(lèi)的測(cè)定：試驗(yàn)步驟同1.2.2 1）～3），氮源為硫酸銨，設(shè)置2個(gè)處理：CK（等量滅活HB1菌液）、HB1（等量含HB1的孢子菌液），每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。在培養(yǎng)72 h后，將三角瓶中發(fā)酵液全部倒入離心管中，10 000 r/min，離心10 min。用10 mL的注射器取2 mL上清液，過(guò)0.22 μm濾膜后，通過(guò)HPLC-MS來(lái)測(cè)定上清液中有機(jī)酸的種類(lèi)[17]。

1.3.3 土壤培養(yǎng)試驗(yàn)

分別在加入孢子菌懸液后第1、3、5、7、10、14、21、37天隨機(jī)取3份土樣，用打孔器取部分土壤用于測(cè)定菌株定殖情況，剩下的土壤風(fēng)干過(guò)1 mm篩后用于測(cè)定土壤pH及有效磷含量。

菌株的定殖情況測(cè)定采用稀釋平板法[18-20]：取1 g新鮮土壤溶于10 mL無(wú)菌水（含0.01%吐溫80）中，振蕩4 min后靜置1 min，做105倍的濃度梯度稀釋?zhuān)?00L的1×105稀釋梯度液涂布于PDA固體培養(yǎng)基（含100g/mL氯霉素，100g/mL卡那霉素，100g/mL鏈霉素），涂6個(gè)板。置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每天觀察菌落形態(tài)并計(jì)數(shù)。

土壤pH值、有效磷含量采用常規(guī)方法測(cè)定[15]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2007和SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 草酸青霉菌HB1溶磷能力的初步鑒定

試驗(yàn)結(jié)果顯示，草酸青霉菌HB1在這4種難溶性磷源的固體培養(yǎng)基上均生長(zhǎng)良好（圖1），其溶磷圈和菌落直徑測(cè)定結(jié)果如表2所示。

供試磷源為磷酸鈣時(shí)，HB1菌培養(yǎng)8 d時(shí)其溶磷圈和菌落直徑分別比第3天時(shí)極顯著增加了199%和236%（<0.05），其溶磷圈直徑/菌落直徑為1.10～1.23；磷礦粉為磷源時(shí)，HB1菌培養(yǎng)8 d時(shí)其溶磷圈和菌落直徑分別比第3 天時(shí)極顯著增加了184%和234%（<0.05），其溶磷圈直徑/菌落直徑的范圍為1.01～1.22；磷酸鐵為磷源時(shí)，HB1菌培養(yǎng)8 d時(shí)其溶磷圈和菌落直徑分別比第3天時(shí)極顯著增加了114%和125%（<0.05），其溶磷圈直徑/菌落直徑為1.03～1.09；磷酸鋁為磷源時(shí)，HB1菌培養(yǎng)8 d時(shí)其溶磷圈和菌落直徑分別比第3天時(shí)極顯著增加了85%和93%（<0.05），溶磷圈直徑/菌落直徑為1.03～1.07。同時(shí)，在3～8 d的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，HB1在含有磷酸鈣的固體培養(yǎng)基上其菌落直徑和溶磷圈直徑/菌落直徑均顯著高于磷礦粉、磷酸鐵、磷酸鋁（<0.05）（表2）。綜上，按其溶磷圈直徑/菌落直徑初步鑒定HB1溶解磷酸鈣中磷的能力較大。

表2 草酸青霉菌HB1在固體培養(yǎng)基上的溶磷能力初步鑒定

注：表中不同的小寫(xiě)字母代表相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)不同磷源條件下其溶磷圈直徑、菌落直徑、溶磷圈直徑：菌落直徑差異顯著性比較（<0.05）。

Note: Different lowercase letters indicate significant differences between phosphate solubilizing zone, bacterial colony, the ratio of phosphate solubilizing zone and bacterial colony at the same time (< 0.05) .

圖1 草酸青霉菌HB1在4種難溶性磷源固體培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況

2.2 草酸青霉菌HB1對(duì)4種難溶性磷源的溶磷能力

2.2.1 草酸青霉菌HB1溶解磷酸鈣的能力

1）溶磷能力

在液體培養(yǎng)條件下對(duì)HB1溶解磷酸鈣的能力進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，與CK（無(wú)菌水）、滅活菌液相比，接種HB1孢子菌懸液其發(fā)酵液中有效磷含量均顯著增加（圖2）。

NH4+-N為氮源條件下（圖2a），接種HB1菌的發(fā)酵液中有效磷含量在132 h達(dá)到最大值，為884 mg/L；相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，HB1發(fā)酵液中有效磷含量均顯著高于對(duì)照和HB1滅活菌液（<0.05），分別增高了19.29%和20.92%、68.39%和61.07%、69.47%和61.01%。

NO3--N為氮源時(shí)（圖2b），接種HB1菌的發(fā)酵液有效磷含量在144 h達(dá)到最大值，為945 mg/L；相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，HB1發(fā)酵液中有效磷含量均顯著高于對(duì)照和滅活菌液（<0.05），分別增高68.15%和71.32%、76.96%和64.27%、85.91%和76.14%。

2種氮源對(duì)HB1溶解磷酸鈣的能力影響不顯著（圖 2）。

2）HB1溶解磷酸鈣的作用機(jī)制

分別以硫酸銨、硝酸鈉為氮源，接種草酸青霉菌HB1，測(cè)定了各處理培養(yǎng)液pH值的變化（各處理培養(yǎng)前pH調(diào)到7.0）（表3）和分析了HB1發(fā)酵液中是否存在有機(jī)酸。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HB1在難溶性磷酸鈣作為磷源的情況下，培養(yǎng)72 h后發(fā)酵液中沒(méi)有檢測(cè)到有機(jī)酸，以下其他難溶性磷源存在相同的情況。供應(yīng)NH4+-N時(shí)，培養(yǎng)72 、108 和132 h后，HB1發(fā)酵液的pH值顯著降低（<0.05），分別比對(duì)照和HB1滅活菌液降低了12.89%和7.27%、18.95%和14.19%、17.77%和11.65%，且培養(yǎng)液pH值與有效磷含量之間存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（=―0.89**，=27）；供應(yīng)NO3--N時(shí)，培養(yǎng)84 、120 和144 h，接種HB1菌后溶液的pH值分別比無(wú)菌水對(duì)照降低了2.97%、3.15%和3.18%，差異顯著（<0.05），但與滅活菌液相比差異不顯著（>0.05），且無(wú)菌水對(duì)照與HB1處理發(fā)酵液pH值和有效磷含量之間呈顯著的負(fù)相關(guān)（=-0.83**，=18）。這說(shuō)明無(wú)論是供應(yīng)NH4+-N還是NO3--N，接種HB1菌后，其在生長(zhǎng)和發(fā)育過(guò)程中分泌氫質(zhì)子，從而使發(fā)酵液pH降低，低pH促進(jìn)了培養(yǎng)液中磷酸鈣的溶解與磷的釋放，即溶磷能力增強(qiáng)。

注：不同小寫(xiě)字母表示同時(shí)間不同處理間的差異顯著（P<0.05），下同。

表3 磷酸鈣為磷源時(shí)各處理培養(yǎng)液中pH值的變化

注：同列數(shù)據(jù)后不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著（<0.05），下同。

Note: Different lowercase letters in the same column showed significant differences among different treatments (< 0.05), the same below.

2.2.2 草酸青霉菌HB1溶解磷礦粉的能力

1）溶磷能力

供試菌株草酸青霉HB1在以磷礦粉為唯一磷源的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，能夠有效溶解、轉(zhuǎn)化磷礦粉中的難溶態(tài)磷為自身所用（圖3）。

供試氮源為NH4+-N時(shí)（圖3a），接種HB1菌的發(fā)酵液中有效磷含量在132 h達(dá)到最大值199 mg/L。相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，接種HB1菌的發(fā)酵液有效磷含量均顯著高于對(duì)照和滅活菌液（<0.05），分別增加了77.63和42.68、350和98.01倍、189和900倍。

供試氮源為NO3--N時(shí)（圖3b），HB1菌的發(fā)酵液有效磷含量在144 h達(dá)到最大值27.86 mg/L。相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，接種HB1菌的發(fā)酵液有效磷含量均顯著高于對(duì)照和滅活菌液（<0.05），分別增加了23.07和9.95倍、52.18和12.23倍、161和12.02倍。

在兩種氮源條件下，HB1均能不同程度地溶解磷礦粉，但氮源為銨態(tài)氮條件下HB1的溶磷能力要顯著高于硝態(tài)氮，前者為后者的7.14倍（<0.01）。

2）HB1溶解磷礦粉的作用機(jī)制

供應(yīng)NH4+-N時(shí)，培養(yǎng)72 、108和132 h，接種HB1菌后溶液的pH值分別比對(duì)照和滅活菌液降低了32.19%和30.12%、35.24%和34.37%、36.04%和35.35%，差異顯著（<0.05）；供應(yīng)NO3--N時(shí)，培養(yǎng)84、120和144 h，接種HB1菌后溶液的pH值分別比對(duì)照和滅活菌液降低了20.00%和18.87%、21.18%和19.30%、21.48%和19.61%，差異顯著（<0.05）。此外，在培養(yǎng)后期供應(yīng)銨態(tài)氮使生長(zhǎng)介質(zhì)pH下降的幅度大于硝態(tài)氮供應(yīng)（表 4）。

表4 磷源為磷礦粉時(shí)各處理液體培養(yǎng)基中pH值的變化

圖3 草酸青霉菌HB1溶解磷礦粉的能力

同時(shí)，供應(yīng)NH4+-N時(shí)或供應(yīng)NO3--N時(shí)，3個(gè)處理的培養(yǎng)液pH值與其有效磷含量之間均存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（=-0.89**,=27；=-0.95**,=27）。這說(shuō)明在磷礦粉為供應(yīng)磷源的情況下，HB1菌在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中可分泌氫質(zhì)子使生長(zhǎng)介質(zhì)中的pH降低，通過(guò)酸解作用將磷礦粉中的磷釋放出來(lái)。

2.2.3 草酸青霉菌HB1溶解磷酸鐵的能力

1）溶磷能力

在中國(guó)南方，大部分土壤的pH都較低，土壤中的有效磷多被Fe、Al等金屬離子吸附固定，以鐵鋁磷酸鹽的形式存在。因此，針對(duì)此類(lèi)現(xiàn)象，探究了HB1菌對(duì)磷酸鐵的溶解能力（圖4）。

結(jié)果表明，供應(yīng)NH4+-N時(shí)（圖4a），在72 h接種HB1菌的發(fā)酵液中有效磷含量達(dá)到最高，為265 mg/L，比132 h的有效磷含量高出46.96%，差異達(dá)到顯著水平（<0.05）。在相同培養(yǎng)期間內(nèi)，接種HB1菌的發(fā)酵液有效磷含量分別高于對(duì)照和滅活菌液2.56和2.01倍、1.97和2.49倍、1.84和2.32倍，差異顯著（<0.05）；供應(yīng)NO3--N時(shí)（圖4b），HB1菌的發(fā)酵液有效磷含量在84 h達(dá)到最高，為206 mg/L，比120 h顯著高出11.61%（<0.05）。在相同培養(yǎng)期間內(nèi)，接種HB1菌處理的有效磷含量分別高于對(duì)照和滅活菌液1.78和1.25倍、1.82和2.00倍、1.84和1.80倍，差異顯著（<0.05）。

圖4 草酸青霉菌HB1溶解磷酸鐵的能力

2種氮源對(duì)HB1溶解磷酸鐵的能力影響不顯著。

2）HB1溶解磷酸鐵的作用機(jī)制

供應(yīng)NH4+-N時(shí)，培養(yǎng)72、108和132 h，接種HB1菌后溶液的pH值最低（3.05～3.60）分別比對(duì)照和滅活菌液顯著降低33.55%和27.38%、21.92%和17.19%、2.41%和14.89%（<0.05）；供應(yīng)NO3--N時(shí)，培養(yǎng)84、120和144 h，接種HB1菌后溶液的pH值最高（5.51～5.75），分別比對(duì)照和滅活菌液顯著升高了21.63%和33.09%、25.95%和35.99%、25.82%和38.55%（<0.05）。這是因?yàn)榧蛹兯幚淼呐囵B(yǎng)液初始培養(yǎng)液pH 7.0，培養(yǎng)3 d后培養(yǎng)液pH降為4.38～4.59，說(shuō)明磷酸鐵在溶解過(guò)程中，該礦物中包裹的H+得以釋放（表5）。

供應(yīng)NH4+-N時(shí)，對(duì)照、接種HB1菌、HB1滅活菌液3個(gè)處理培養(yǎng)液pH值與其有效磷含量之間存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（=-0.85**，=27），這與HB1分泌氫質(zhì)子溶解磷酸鈣的作用機(jī)制相同；然而，供應(yīng)NO3--N時(shí)，3個(gè)處理的發(fā)酵液pH值和有效磷含量之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（=0.93**,=27），這與磷酸鈣為磷源的趨勢(shì)不同，分析原因是HB1吸收硝態(tài)氮后釋放出OH-，與沒(méi)有接菌的處理相比一定程度上升高了培養(yǎng)液pH，且菌的活性越強(qiáng)，吸收的硝態(tài)氮就越多，pH提升的幅度就越大，溶解磷酸鐵的能力就越強(qiáng)，從而發(fā)酵液中有效磷含量就越高。

表5 磷源為磷酸鐵時(shí)各處理液體培養(yǎng)基中pH值的變化

2.2.4 草酸青霉菌HB1溶解磷酸鋁的能力

1）溶磷能力

供試氮源為NH4+-N時(shí)（圖5a），相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，接種HB1菌的發(fā)酵液有效磷含量均顯著高于對(duì)照和滅活菌液（<0.05），分別增加了2.10和3.87倍、2.17和4.00倍、2.06和3.69倍。供試氮源為NO3--N時(shí)（圖 5b），相同培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，接種HB1菌的發(fā)酵液有效磷含量均顯著高于對(duì)照和滅活菌液（<0.05），分別增加了3.69和8.01倍、4.07和3.89倍、3.99和6.84倍。

HB1溶解磷酸鋁的能力在NO3--N條件下大于NH4+-N條件下（<0.01），有效磷含量最大為120 mg/L，前者為后者的3.29倍。由此可見(jiàn)，當(dāng)磷源為磷酸鋁時(shí)，最適宜的供試氮源為硝態(tài)氮。

2）HB1溶解磷酸鋁的作用機(jī)制

供應(yīng)NH4+-N時(shí)，培養(yǎng)72、108和132 h，接種HB1菌后溶液的pH值分別比對(duì)照和滅活菌處理降低43.26%和38.02%、42.65%和35.83%、40.73%和32.22%，差異均顯著（<0.05）；供應(yīng)NO3--N時(shí)，培養(yǎng)84、120和144 h，接種HB1菌后溶液的pH值分別比對(duì)照和滅活菌處理降低了22.14%和16.17%、23.99%和18.57%、23.22%和17.06%，差異顯著（<0.05）（表6）。

供應(yīng)NH4+-N或供應(yīng)NO3--N時(shí)，3個(gè)處理的培養(yǎng)液pH值與其有效磷含量之間均存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（=-0.84**,=27；=-0.88**,=27），說(shuō)明HB1菌也是通過(guò)“酸解”作用來(lái)促進(jìn)磷酸鋁溶解的，從而獲取自身生長(zhǎng)和繁殖所需要的磷素。

圖5 草酸青霉菌HB1溶解磷酸鋁的能力

表6 磷源為磷酸鋁時(shí)各處理液體培養(yǎng)基中pH值的變化

2.3 草酸青霉菌HB1在高、低2種磷水平土壤中的溶磷能力研究

為了進(jìn)一步明確草酸青霉菌HB1溶磷的能力，研究了HB1在高磷和低磷土壤中的定殖情況及其活化土壤磷的能力。

2.3.1 草酸青霉菌HB1在土壤中的定殖情況

菌株在土壤中的定殖情況直接影響著菌株在土壤中發(fā)揮溶磷作用，其中溶磷菌能否在作物根際土壤成功定殖至關(guān)重要[21-22]。一般而言，溶磷菌株在土壤中的定殖能力越強(qiáng)，代謝分泌物越多，其功能就越顯著。菌株在土壤中的定殖能力是衡量菌株溶磷能力的一種有效方法[23]。因此，本研究采用了平板計(jì)數(shù)法來(lái)探究草酸青霉菌HB1在不同磷水平土壤中的定殖情況，將菌株HB1接種到兩種不同有效磷水平土壤中，結(jié)果表明菌株HB1在土壤中均能很好的定殖（圖6）。

在低磷土壤中（圖6a），培養(yǎng)到第3 d時(shí)，HB1菌的菌落數(shù)達(dá)到最大，為1.30×108cfu/g，是初始菌落數(shù)的9.77倍，之后開(kāi)始逐漸下降，到第37天時(shí)，菌落基本全部消亡。

在高磷土壤中（圖6b），HB1菌接入土壤后的第一天菌落數(shù)迅速增加，達(dá)到1.60×108cfu/g，是初始菌落數(shù)的12.03倍。雖然在之后的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)菌落數(shù)開(kāi)始呈下降的趨勢(shì)，在第37天時(shí)菌落數(shù)達(dá)到最低值，但其仍舊高于初始菌落數(shù)，為初始菌落數(shù)的1.19倍。

綜上所述，說(shuō)明HB1菌均可很好的在低磷土壤和高磷土壤中定殖。

圖6 草酸青霉菌HB1在土壤中的定殖情況

2.3.2 草酸青霉菌HB1對(duì)土壤有效磷含量變化的影響

從圖7可以看出，在2種磷水平土壤中，與對(duì)照相比，接種菌株HB1的土壤速效磷含量隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加均呈升高趨勢(shì)，說(shuō)明草酸青霉菌HB1具有較好的溶磷效果。

低磷土壤中（圖7a），接種HB1菌的土壤速效磷含量在培養(yǎng)第10天時(shí)達(dá)到最大值。在培養(yǎng)3～21 d內(nèi)，比對(duì)照增加了17.44%～45.00%，差異顯著（<0.05），溶磷效果明顯；在培養(yǎng)第37 d時(shí)土壤速效磷含量比對(duì)照增加了14.28%，但差異不顯著（>0.05）。高磷土壤中（圖 7b），從培養(yǎng)的第一天開(kāi)始，接種HB1菌土壤的速效磷含量高于對(duì)照，比對(duì)照增加了0.96%～14.17%。

同時(shí)在整個(gè)培養(yǎng)期間，無(wú)論是低磷土還是高磷土中，對(duì)照處理土壤中速效磷含量也有一定增加，這是因?yàn)橥寥牢⑸锵抵幸灿幸欢ǖ娜芰拙诎l(fā)揮作用。

注：不同小寫(xiě)字母表示不同處理間差異顯著（<0.05）。

Note: Different lowercase letters showed significant differences among different treatments (< 0.05).

圖7 草酸青霉菌HB1對(duì)土壤速效磷含量的影響

Fig. 7 Effects ofHB1 on the content of available P in soil

3 討 論

平板解磷圈法是研究微生物解磷能力最常用的方法，溶磷圈直徑、菌落直徑及其溶磷圈直徑/菌落直徑是表征溶磷菌相對(duì)解磷能力的指標(biāo)[10]。有研究報(bào)道，青霉菌屬菌株在以磷酸鈣為磷源的培養(yǎng)基上可良好生長(zhǎng)，且具有較高的溶磷效果[24]，其中草酸青霉菌P8在以磷酸鈣為磷源的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d時(shí)溶磷圈直徑/菌落直徑為1.26[25]，草酸青霉菌P22、P29和P36在以磷酸鈣為磷源的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d時(shí)溶磷圈直徑/菌落直徑為1.22～1.29[7]。本研究草酸青霉菌HB1在以磷酸鈣為磷源的固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d時(shí)溶磷圈直徑/菌落直徑為1.23，與前人研究相比HB1菌溶解磷酸鈣的能力較好；另外，草酸青霉菌P36在固體平板上溶解磷礦粉的溶磷圈直徑/菌落直徑為1.00[7]，而草酸青霉菌HB1溶解磷礦粉溶磷圈直徑/菌落直徑最大達(dá)到1.22，因此HB1菌溶解磷礦粉的能力也較好；范丙全[10]研究草酸青霉菌P8和Pn1時(shí)發(fā)現(xiàn)兩株菌株在以磷酸鐵為磷源的瓊脂培養(yǎng)基上溶磷圈直徑/菌落直徑分別為1.07和1.08，HB1菌在以磷酸鐵為供試磷源時(shí)其溶磷圈直徑/菌落直徑達(dá)到1.09，說(shuō)明三個(gè)草酸青霉菌株對(duì)磷酸鐵的溶解能力相似。

草酸青霉菌Mo-Po溶解磷酸鈣的有效磷含量為64.87 mg/L[26]，草酸青霉菌C’溶解磷酸鈣的有效磷濃度最高達(dá)642 mg/L[27]，本研究中，草酸青霉HB1菌在銨態(tài)氮和硝態(tài)氮條件下溶解磷酸鈣的有效磷濃度分別達(dá)884 mg/L和945 mg/L。王光華等[24]發(fā)現(xiàn)供應(yīng)銨態(tài)氮，青霉菌（）P66培養(yǎng)72 h對(duì)磷礦粉的活化率達(dá)到40%左右；鐘傳青等[28]研究溶磷細(xì)菌（）P17時(shí)發(fā)現(xiàn)，該菌在銨態(tài)氮的供應(yīng)下可以較好地溶解磷礦粉而釋放出磷。在本研究中，HB1菌也能夠有效地溶解、轉(zhuǎn)化磷礦粉中的難溶磷，而且在兩種氮源條件下，接種HB1菌處理的有效磷含量分別與未接菌和滅活菌處理相比，差異均達(dá)到顯著水平（<0.05），且在銨態(tài)氮條件下溶磷能力顯著大于硝態(tài)氮（<0.01），其有效磷含量達(dá)到199 mg/L。這說(shuō)明，草酸青霉菌HB1能夠更好地利用銨態(tài)氮來(lái)提高自身的溶磷能力。而范丙全[10]研究青霉菌P8和Pn1溶解磷礦粉的過(guò)程中卻發(fā)現(xiàn)，使用硝態(tài)氮時(shí)兩株溶磷菌的溶磷能力高于銨態(tài)氮。由此說(shuō)明草酸青霉不同溶磷菌株供應(yīng)的氮源不同，從而導(dǎo)致其溶磷能力存在差異，因此，應(yīng)用溶磷菌株時(shí)需找到其最佳的氮源供應(yīng)條件。

一般而言，微生物的溶磷機(jī)制存在以下兩種情況：一是微生物在代謝過(guò)程中通過(guò)呼吸作用和NH4+同化作用分泌氫質(zhì)子，使其培養(yǎng)介質(zhì)pH下降，導(dǎo)致磷酸鹽溶解；二是微生物分泌的有機(jī)酸降低了pH值，與Ca2+、Al3+、Fe3+等離子結(jié)合，使難溶性磷酸鹽溶解[29]。有大量研究表明溶磷菌在培養(yǎng)過(guò)程中pH與解磷量之間的變化呈顯著相關(guān)關(guān)系[29-30]。本研究中，接種HB1菌后培養(yǎng)液中并未檢測(cè)到主要有機(jī)酸的存在，但是發(fā)酵液中pH顯著低于未接菌處理，這說(shuō)明草酸青霉菌HB1主要是通過(guò)第一種溶磷機(jī)制來(lái)促進(jìn)難溶性磷酸鹽溶解并釋放磷素的。當(dāng)供試氮源為銨態(tài)氮，磷源為磷酸鈣、磷礦粉、磷酸鐵、磷酸鋁，對(duì)照、HB1菌處理、滅活HB1菌3個(gè)處理的培養(yǎng)液中pH值與有效磷含量之間也均存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（=-0.89**、=-0.89**、=-0.85**、=-0.84**），這進(jìn)一步說(shuō)明HB1主要是通過(guò)第一種溶磷機(jī)制來(lái)促進(jìn)難溶性磷酸鹽的溶解并釋放出磷素；當(dāng)供試氮源為硝態(tài)氮，磷源為磷酸鈣、磷礦粉、磷酸鋁，與CK相比，接種HB1菌處理的pH值也均顯著降低（<0.05），且pH值與有效磷含量之間也均存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（=-0.83**、=-0.95**、=-0.88**）。眾所周知，微生物吸收NO3--N并不具有向外釋放H+的能力，而是微生物協(xié)同吸收NO3--N和H+，所以使溶液中OH-數(shù)量增多，進(jìn)一步導(dǎo)致培養(yǎng)液的pH值升高。當(dāng)微生物吸收利用1 mol NO3-時(shí)，就會(huì)消耗掉等量的H+或釋放出等量的OH-，使培養(yǎng)介質(zhì)的pH升高[31]。因此，硝態(tài)氮供應(yīng)條件下接種HB1菌的發(fā)酵液pH顯著降低的原因是HB1菌吸收NO3--N和H+的同時(shí)并通過(guò)自身呼吸作用向外釋放CO2，后者對(duì)pH的降低程度大于前者對(duì)pH升高的程度時(shí)就導(dǎo)致液體培養(yǎng)基pH降低，達(dá)到“酸解”釋放磷的目的。此外，已有的研究也發(fā)現(xiàn)溶磷量與培養(yǎng)介質(zhì)的pH之間并不總是呈負(fù)的相關(guān)性[32-33]。在本研究中也發(fā)現(xiàn)了這一點(diǎn)：當(dāng)供試磷源為磷酸鐵，氮源為硝態(tài)氮時(shí)，不僅接種HB1菌處理的pH值與對(duì)照和滅活菌處理相比顯著升高（<0.05），而且3個(gè)處理的發(fā)酵液pH值和有效磷含量之間存在顯著的正相關(guān)關(guān)系（=0.93**,=27）。分析原因發(fā)現(xiàn)，對(duì)照、HB1菌、滅活HB1處理的初始液體培養(yǎng)基pH 7.0，培養(yǎng)3 d后培養(yǎng)液pH分別降為4.47～4.57、5.51～5.75、4.14～4.15（表5），說(shuō)明礦物態(tài)磷酸鐵中含有一定量的氫，搖瓶培養(yǎng)一段時(shí)間后，磷酸鐵在溶解過(guò)程中，該礦物中包裹的H+得以釋放導(dǎo)致液體培養(yǎng)基的pH急劇降低，尤其是對(duì)照和滅活HB1處理。接種HB1菌的處理的液體培養(yǎng)基中pH降低幅度較小，其原因是因?yàn)镠B1在生長(zhǎng)和繁殖過(guò)程中需要吸收氮源來(lái)完成其生命周期，當(dāng)生長(zhǎng)介質(zhì)中只有NO3--N時(shí)，HB1菌協(xié)同吸收硝態(tài)氮和氫質(zhì)子，使培養(yǎng)基中OH-的濃度增加，中和了一部分因磷酸鐵溶解釋放出的H+所致，這也間接說(shuō)明HB1保持了活性進(jìn)而促進(jìn)了磷的釋放。

菌株在土壤中的定殖能力對(duì)其溶磷效果起著決定性作用[34]。溶磷棘孢青霉菌（）Z32可以很好地在土壤中定殖，并在第21天時(shí)HB1溶磷菌株的活菌數(shù)高出初始數(shù)量的10倍[15]。草酸青霉菌HB1在兩種土壤中展現(xiàn)出了不同的定殖趨勢(shì)，其原因與土壤中有效磷含量的多少有極大的關(guān)系。低磷土壤中，有效磷含量低，接入的HB1菌需要溶解土壤中的難溶性磷源來(lái)供給自己的生長(zhǎng)和繁殖需要，故出現(xiàn)培養(yǎng)時(shí)間在第3天時(shí)菌數(shù)增多的現(xiàn)象；而在高磷土壤中，有效磷含量充足，HB1菌可以直接吸收土壤中的有效磷來(lái)滿足自己的生長(zhǎng)需求。

4 結(jié) 論

1）固體平板培養(yǎng)初步鑒定草酸青霉菌HB1溶解難溶性磷酸鹽溶解磷酸鈣的溶磷能力較強(qiáng)，其溶磷圈直徑/菌落直徑為1.10～1.23。

2）供應(yīng)NH4+-N和磷酸鈣、磷礦粉、磷酸鐵和磷酸鋁時(shí)，HB1菌發(fā)酵液pH與有效磷含量之間存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，初步探明HB1菌的溶磷作用機(jī)制為在生長(zhǎng)過(guò)程中增加培養(yǎng)基質(zhì)中H+質(zhì)子降低pH值，通過(guò)酸解達(dá)到溶磷的效果。

3）草酸青霉菌HB1可在土壤中定殖并表現(xiàn)出溶磷效果，其在低磷土壤中的溶磷效果要好于高磷土壤。

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Ability and mechanism ofHB1 solubilizing phosphates

He Di1, Geng Liping1, Guo Jia1, Lu Xiujun2, Liu Wenju1※, Li Bowen1

(1.,,,,071001,; 2.,,071001,)

We all know that some functional microorganisms can dissolve insoluble phosphates and it is different from the abilities of the same strain mobilizes different phosphates. The experiments of plate cultivation and shaking culture were carried out to explore the abilities and mechanisms ofHB1 to mobilize different insoluble phosphates (Ca3(PO4)2, phosphate rock powder, FePO4, AlPO4) when different forms of nitrogen (NH4+-N, NO3--N) were supplied in the growth medium. Furthermore, a soil incubation experiment was conducted to verify the capacity of HB1 solubilizing insoluble phosphate in two types of soils with low and high levels of available phosphorus. The results of plate cultivation showed that phosphate dissolving zone was observed on each plate with different phosphates of Ca3(PO4)2, phosphate rock powder, FePO4and AlPO4. The calculated ratios of phosphate solubilizing zone and bacterial colony followed the trends of Ca3(PO4)2> phosphate rock powder > FePO4> AlPO4,which indicated that the ability of HB1 to dissolve Ca3(PO4)2was better than others. In order to prove the abilities of HB1 mobilizing different insoluble phosphates further, the shaking cultural experiment was set up and the results clarified that the phosphate solubilizing capacity of HB1 varied with different mineral phosphates and two different forms of nitrogen in growth mediums. When Ca3(PO4)2or FePO4was supplied, the concentrations of phosphorus (P) in the nutrient solution with HB1 were 884 mg/L or 265 mg/L on the condition of NH4+-N, and 945 mg/L or 206 mg/L with NO3--N addition, respectively. However, there was no significant difference in P concentrations of solution between NH4+-N or NO3--N addition. Meanwhile, HB1 enhanced phosphorus released from Ca3(PO4)2markedly compared withFePO4, which illustrated that P concentrations in solution with HB1 and Ca3(PO4)2were 2.34-3.59 folds higher than those of FePO4in the growth medium. Moreover, when phosphate rock powder and NH4+-N supplied, the concentration of phosphorus in the solution with HB1 was 199 mg/L, which was 7.14 times of that of NO3--N situation. However, the concentration of phosphorus in the nutrient solution with HB1 was 120 mg/L when AlPO4and NO3--N applied, which was 3.29 times of that of NH4+-N. Therefore, shaking cultural experiment demonstrated thatHB1 dissolved the P from different insoluble phosphates indeed and the rank of P mobilizing ability followed Ca3(PO4)2> phosphate rock powder and FePO4> AlPO4when NH4+-N supplied in growth medium, whereas followed Ca3(PO4)2> FePO4> AlPO4> phosphate rock powder when NO3--N applied. It suggested that different N forms in growth medium did not affect the ability of HB1 dissolving P from Ca3(PO4)2and FePO4, but influence this ability for AlPO4and phosphate rock powder. NH4+-N is better for HB1 to mobilize phosphate rock powder, and NO3--N applied is a benefit for HB1 to dissolve AlPO4. Furthermore, there were significant negative relationships between P levels and pH in growth medium with NH4+-N, which indicated the possible mechanisms thatHB1 could exudate H+to the solution, then decreased pH in the growth medium, and finally enhanced the releases of P from different insoluble phosphates. The ability of HB1 dissolving insoluble P was proved in the experiment of soil incubation as well. The results showed that concentrations of available phosphorus in HB1 treatments increased by 45.00% and 14.17% in low-phosphorus soil and high-phosphorus soil after incubation for 21 days, respectively. In summary, HB1 had the strongest phosphate-dissolving capacity for Ca3(PO4)2, followed by FePO4andphosphate rock powder when NH4+-N addition, which was dissolved through H+exudate byHB1. It would be a better pathway to use HB1 mobilizing insoluble phosphate in soils with low available phosphorus.

phosphorus; soils; bacteria; insoluble phosphate; soil colonization;HB1

何 迪，耿麗平，郭 佳，陸秀君，劉文菊，李博文. 草酸青霉菌HB1溶磷能力及作用機(jī)制[J]. 農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào)，2020，36(2)：255－265. doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.02.030 http://www.tcsae.org

He Di, Geng Liping, Guo Jia, Lu Xiujun, Liu Wenju, Li Bowen. Ability and mechanism ofHB1 solubilizing phosphates[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(2): 255－265. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.02.030 http://www.tcsae.org

2019-08-01

2019-12-25

河北省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（17962902D）；國(guó)家科技支撐計(jì)劃（2015BAD23B01）

何迪，主要從事土壤環(huán)境質(zhì)量研究。Email：hedinuannuan@163.com

劉文菊，博士生導(dǎo)師，教授，主要從事土壤環(huán)境質(zhì)量研究。Email：liuwj@hebau.edu.cn

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.02.030

S154.3

A

1002-6819(2020)-02-0255-11