（河南師范大學(xué)附屬中學(xué)，河南新鄉(xiāng) 453002）

0.引言

隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，人們對(duì)基因的研究進(jìn)一步深入。基因編輯就是一種新型的能對(duì)基因組進(jìn)行編輯的技術(shù)。目前對(duì)基因編輯的研究已經(jīng)有了一定進(jìn)展，可以對(duì)想要編輯的基因進(jìn)行較為準(zhǔn)確的定點(diǎn)編輯。

核酸酶經(jīng)基因工程改造后可用于基因編輯，作用主要是在目標(biāo)基因位點(diǎn)進(jìn)行剪切，從而導(dǎo)致基因斷裂，生物體可通過(guò)自身的修復(fù)機(jī)制修復(fù)斷裂，在修復(fù)過(guò)程中可能會(huì)出錯(cuò)，將錯(cuò)誤的基因整合連接起來(lái)，而導(dǎo)致靶向突變，我們稱其為基因編輯。高效率是基因編輯技術(shù)的重要優(yōu)勢(shì)之一，因此未來(lái)如果能將基因編輯技術(shù)準(zhǔn)確靈活運(yùn)用于醫(yī)療和抵御治療疾病，將會(huì)帶來(lái)很大的便利，進(jìn)一步推動(dòng)現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展。

1.技術(shù)方法

基因編輯的方法隨著科技的進(jìn)步而不斷變化，最開(kāi)始是通過(guò)同源重組改變編輯基因，即將想要改變的DNA片段分離，再整合入目標(biāo)細(xì)胞中，這些外來(lái)的DNA片段通過(guò)直接注射或化學(xué)物質(zhì)促進(jìn)的方法被細(xì)胞所吸收，進(jìn)一步與原有DNA結(jié)合，重組到目標(biāo)位置。同源重組方法的發(fā)現(xiàn)是基因編輯技術(shù)研究的一大進(jìn)步，但這種方法具有不夠準(zhǔn)確的缺點(diǎn)，并且效率很低，目前已經(jīng)不再使用。

在特定位點(diǎn)產(chǎn)生斷裂后才能進(jìn)行基因編輯，關(guān)鍵在于“切割”和“特定”。限制酶是當(dāng)前實(shí)驗(yàn)和研究中常用的用來(lái)切割DNA的工具，它可以有效地?cái)嗔袲NA，但在確定切割位置的方面還不夠準(zhǔn)確，容易出錯(cuò)。因此，人們針對(duì)這一缺點(diǎn)用生物工程改造了四種核酸酶，研發(fā)出了特異性更好的“DNA剪刀”。

巨型核酸酶特點(diǎn)如其名，識(shí)別范圍非常大，正是因?yàn)樗梢詥未巫R(shí)別12～40個(gè)堿基對(duì)的序列，因此它的特異性更強(qiáng)，同時(shí)也更加準(zhǔn)確。即使在非常復(fù)雜的基因組中，我們也可以利用鋅指核酸酶做到準(zhǔn)確定位和切割，較為準(zhǔn)確，如果在設(shè)計(jì)鋅指結(jié)構(gòu)域時(shí)多加注意，這種方法可以作到對(duì)高等生物甚至于人的基因進(jìn)行準(zhǔn)確的編輯。CRISPR/Cas9技術(shù)是一種非常有效的基因編輯的方法，通過(guò)這種方法使生物具有對(duì)外來(lái)物質(zhì)的抵擋能力，多用于治療預(yù)防疾病，應(yīng)用非常廣泛[1]。

2.在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用

早在20世紀(jì)，隨著對(duì)免疫學(xué)研究的深入，研究者們就提出了通過(guò)適當(dāng)改變自身免疫系統(tǒng)的功能來(lái)控制并殺死腫瘤細(xì)胞的想法，稱為腫瘤免疫療法。20世紀(jì)80年代左右，研究者們開(kāi)始尋找治療腫瘤的方法，他們將滅活的不同菌種的過(guò)濾物混合體外培養(yǎng)，嘗試抑制腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散和殺死腫瘤細(xì)胞，并取得了成功。在1950年左右，研究者又提出了新的理論，即“腫瘤的免疫監(jiān)視理論”，認(rèn)為自身免疫系統(tǒng)可以識(shí)別并殺死體內(nèi)出現(xiàn)異常的腫瘤細(xì)胞，這一理論給后人利用免疫系統(tǒng)治療腫瘤疾病提供了很大的啟發(fā)。在當(dāng)代，對(duì)腫瘤疾病的研究日益推進(jìn)，腫瘤免疫治療在治療多種臨床疾病方面都取得了不錯(cuò)的成效。而隨著對(duì)CRISPR /Cas9基因編輯技術(shù)的研究深入，研究者們對(duì)腫瘤疾病的治療找到了新的思路。

科學(xué)家們通過(guò)研究古生菌，從而發(fā)現(xiàn)了CRISPR/Cas9，即基因編輯系統(tǒng)。它可以對(duì)目標(biāo)位置的RNA進(jìn)行準(zhǔn)確的編輯，是一種獲得性免疫系統(tǒng)。像經(jīng)基因工程改造后的核酸酶一樣，CRISPR/Cas9也具有在特定位點(diǎn)切割和連接的作用,其作用原理是利用向?qū)NA結(jié)合Cas9蛋白并將其結(jié)合體引至PAM識(shí)別位點(diǎn)DNA靶標(biāo)位置上，進(jìn)一步進(jìn)行切割誘導(dǎo)產(chǎn)生DSB（Double-Strand Break）,通俗講即目標(biāo)DNA雙鏈斷裂。在機(jī)體察覺(jué)到斷裂后，真核細(xì)胞就會(huì)利用自身的DSP修復(fù)功能修補(bǔ)斷裂，這一步驟就是基因編輯進(jìn)行的關(guān)鍵，研究者需要利用DSP修復(fù)中相比同源重組更容易出錯(cuò)的一種途徑來(lái)完成滅活靶基因的目的。出錯(cuò)的原因常表現(xiàn)為以下兩種，一是直接的錯(cuò)誤修復(fù)連接；二是突變產(chǎn)生堿基漏插，一旦出現(xiàn)錯(cuò)誤，機(jī)體即敲除滅活靶基因?；蚓庉嫾夹g(shù)雖仍存在許多細(xì)節(jié)上的不足，但與以前的技術(shù)相比，已經(jīng)有了突破性的進(jìn)步，且目前在無(wú)論是在科研還是醫(yī)療尤其是腫瘤免疫治療方面都早已投入使用，推動(dòng)了現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，影響深遠(yuǎn)。

2.1 在免疫阻斷療法中的應(yīng)用

在T細(xì)胞治療的過(guò)程中，免疫檢查點(diǎn)起到調(diào)節(jié)免疫的作用，但部分免疫檢查點(diǎn)的不正常表達(dá)和變化會(huì)阻礙T細(xì)胞作用，并且會(huì)利于腫瘤細(xì)胞逃逸擴(kuò)散，從而加重腫瘤疾病帶來(lái)的惡劣影響和治療難度。隨著對(duì)基因?qū)用嫜芯康倪M(jìn)一步深入的發(fā)展，目前如果能巧妙運(yùn)用CRISPR /Cas9基因編輯技術(shù)，使機(jī)體正常發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)，更好的修復(fù)自身抵抗腫瘤，也可以達(dá)到與傳統(tǒng)技術(shù)同樣的效果，并且操作更加簡(jiǎn)單，表達(dá)效果也更迅速。舉個(gè)常見(jiàn)的例子，用sgRNA結(jié)合引導(dǎo)Cas9蛋白借助基因編輯電穿孔的方法進(jìn)入原代DNA中，從而達(dá)到敲除程序性死亡受體1基因（PD-1）的目的。PD-1基因被敲除后，表達(dá)減少，具體表現(xiàn)為不再對(duì)T細(xì)胞免疫抑制，被免疫檢查點(diǎn)影響的T細(xì)胞恢復(fù)原有的增殖和活性，提高T細(xì)胞的免疫功能，使腫瘤免疫治療效果更好。通過(guò)阻斷療法得到敲除了程序性死亡受體1基因的細(xì)胞，此時(shí)免疫負(fù)調(diào)節(jié)物對(duì)T細(xì)胞作用的阻斷途徑被切斷，CAR-T細(xì)胞的反應(yīng)能力有效提高，腫瘤治療效果增強(qiáng)[2]。

2.2 在過(guò)繼性細(xì)胞治療中的應(yīng)用

為了達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞這一目的，衍生出了通過(guò)導(dǎo)出免疫細(xì)胞，在體外被動(dòng)刺激增活免疫細(xì)胞后重新導(dǎo)入人體的腫瘤治療方法。

腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞療法是過(guò)繼性免疫治療的一種。近年，技術(shù)和設(shè)施的革新使研究進(jìn)程不斷加快，表現(xiàn)出了優(yōu)良的效果，使得這種基于外源基因修飾的過(guò)繼性免疫療法一度成為研究的主要方向。

在進(jìn)行TCR-T時(shí)，由于TCR分子自身的不唯一性，外源和內(nèi)源鏈隨機(jī)配對(duì)可能會(huì)形成雜合TCR分子，提高患自身免疫性疾病的可能性。因此針對(duì)本問(wèn)題的研究重在控制鏈配對(duì)的過(guò)程，達(dá)到減少雜合分子產(chǎn)生的目的。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在這里的作用表現(xiàn)為編輯切割內(nèi)源性基因，使T細(xì)胞中只存在外源TCR基因，這種方法可以有效阻止雜合分子的產(chǎn)生和減小對(duì)機(jī)體的不利影響。

修飾外源基因的另一方法為CAR-T，雖然也可以達(dá)到過(guò)繼性細(xì)胞治療的目的，但存在多重限制，原因在于這個(gè)方法本身的原理是將病體的T細(xì)胞分離處理再重新回輸，而在此過(guò)程中又受到T細(xì)胞數(shù)量的限制和被機(jī)體系統(tǒng)排斥的影響，因此CAR-T雖有能力作到T細(xì)胞治療，但在實(shí)際的應(yīng)用中并不常見(jiàn)。早期實(shí)驗(yàn)證明如果將T細(xì)胞的內(nèi)源性TCR基因編輯清除后再作用，就可以得到可以有效避免GVHD發(fā)生的通用效應(yīng)T細(xì)胞。構(gòu)建方法即將TCR-T療法和電轉(zhuǎn)CRISPR編輯系統(tǒng)的方法相結(jié)合，把轉(zhuǎn)化物質(zhì)導(dǎo)入健康人體的T細(xì)胞中，從而得到具有較強(qiáng)抗腫瘤能力的同種異體通用效應(yīng)T細(xì)胞，這類細(xì)胞不單單只具有高效的體內(nèi)抗腫瘤活性，還可以減弱宿主自身系統(tǒng)和CAR-T細(xì)胞之間的相互排斥作用。另外，由于構(gòu)建通用效應(yīng)T細(xì)胞是針對(duì)CAR-T的缺陷而進(jìn)行研究的，因此它與CAR-T相反，能廣泛運(yùn)用于臨床治療，推動(dòng)了基因編輯治療產(chǎn)業(yè)化實(shí)踐化的發(fā)展。

2.3 在抗體靶向療法中的作用

在腫瘤治療中常用的方法還有很多，例如利用腫瘤細(xì)胞表面會(huì)表達(dá)許多特殊抗原這一原理進(jìn)行治療，這些特殊抗原通常與正?？乖休^大的差異，因此研究者可依據(jù)這一差異性將抗原位點(diǎn)看作靶點(diǎn)，進(jìn)一步被機(jī)體自身系統(tǒng)抗體識(shí)別，從而消滅腫瘤細(xì)胞。

研究者通過(guò)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在已經(jīng)發(fā)生了突變的小鼠胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞中篩選出對(duì)癌細(xì)胞的增殖分化過(guò)程起重要作用的受體，根據(jù)抗體靶向治療的原理，針對(duì)這一類受體特異性結(jié)合。研究結(jié)果表明，經(jīng)實(shí)驗(yàn)處理過(guò)的特殊受體相對(duì)應(yīng)的抗體抑制小鼠胰腺導(dǎo)管腺癌細(xì)胞增長(zhǎng)的能力得到了顯著的提高。這種特殊的受體稱為Frizzled-5，由實(shí)驗(yàn)可以得到，F(xiàn)rizzled-5在抗體靶向療法中可能可以作為靶點(diǎn)，這一結(jié)論為免疫治療藥物的研究提供了很大的啟發(fā)。

抗體作用大體都是與抗原進(jìn)行特異性結(jié)合后發(fā)揮保護(hù)作用，但這些不同的抗體在對(duì)系統(tǒng)的激活以及刺激免疫細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的作用等方面仍存在差異，正是利用這種差異在不同方面腫瘤的不同應(yīng)用，研究者研發(fā)出了在抗體多樣化中占重要環(huán)節(jié)的，抗體類型轉(zhuǎn)換，轉(zhuǎn)換過(guò)程大致分為兩步，首先是利用B細(xì)胞特異性酶起始，在進(jìn)行不同lg基因間的類別轉(zhuǎn)換重組。在轉(zhuǎn)換重組過(guò)程中起著決定性作用的一步就是DNA雙鏈的斷裂。在過(guò)去，這種斷裂通常通過(guò)B細(xì)胞特異性酶來(lái)進(jìn)行啟動(dòng)，哈佛的研究者們首次利用CRISPR/Cas9作用于小鼠多種細(xì)胞，有效的提高了抗體類型轉(zhuǎn)化的效率，從而實(shí)現(xiàn)了首次利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)進(jìn)行抗體制備。此后，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)成為高速高效簡(jiǎn)便易操作抗體制備的主要途徑，在臨床治療和實(shí)驗(yàn)方面廣泛利用[3]。在腫瘤的抗體靶向治療中，抗原抗體結(jié)合片段因其自身的結(jié)構(gòu)較小，進(jìn)入組織更容易等特點(diǎn)而受到廣泛地運(yùn)用。

3.在遺傳性疾病中的作用

由于CRISPR/Cas9技術(shù)的在基因編輯方面顯著的優(yōu)越性，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)，各領(lǐng)域便開(kāi)始了利用該技術(shù)促進(jìn)本領(lǐng)域發(fā)展的相關(guān)研究，在農(nóng)業(yè)方面的作物培植到預(yù)防治療調(diào)控疾病等方面均已投入使用且得到了了較好的成果。由于CRISPR/Cas9系統(tǒng)為可編程系統(tǒng)，且能夠進(jìn)行基因組編輯，因此在遺傳性疾病的治療中體現(xiàn)了極大的優(yōu)勢(shì)。近年，研究者們已將CRISPR/Cas9技術(shù)運(yùn)用于癌癥和艾滋病等過(guò)去死亡率極高的遺傳病，并且取得了理論實(shí)驗(yàn)的成功，目前將此技術(shù)運(yùn)用于臨床治療的進(jìn)程也在穩(wěn)定的開(kāi)展著，若投入使用成功，則能夠?yàn)楣タ似渌z傳性疾病提供極大的助力，具有很大的發(fā)展前景。

研究者們利用小鼠，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)在體內(nèi)設(shè)計(jì)構(gòu)建并且糾正了血友病B的模型，證明了CRISPR/Cas9技術(shù)在血液遺傳性疾病方面臨床治療的可行性。在擁有豐富的理論基礎(chǔ)后，研究者們開(kāi)始投入實(shí)際的臨床使用。他們采取手段誘導(dǎo)iPSCs基因分類分化成為紅細(xì)胞，再對(duì)轉(zhuǎn)化出的紅細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其可發(fā)揮正常紅細(xì)胞的作用，產(chǎn)生功能完善的β－球蛋白，從而可以減輕患者的貧血情況，解決地中海貧血癥所引起的病癥。CRISPR/Cas9技術(shù)同樣在另一種血液遺傳性疾病，鐮狀細(xì)胞性貧血癥中適用。研究者運(yùn)用相同的方法，通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)改造患病者iPSCs中的HBB基因，基因編輯后，改造修復(fù)的iPSCs能夠分化到網(wǎng)織紅細(xì)胞階段，同樣能夠表達(dá)出與正常細(xì)胞功能相同的β－球蛋白[4]。

4.在G6PD缺乏癥方面的應(yīng)用

G6PD缺乏癥病因?yàn)槟軌蛘{(diào)控G6PD的基因發(fā)生了不正常的突變，因?yàn)樾Q豆可以誘導(dǎo)這種突變的發(fā)生，因此G6PD缺乏癥又被稱為蠶豆癥。根據(jù)G6PD酶的缺乏程度，能夠發(fā)揮的作用及障礙程度，可以將G6PD缺乏癥多種類型，不同等級(jí)的缺乏在治療過(guò)程中也存在差異。經(jīng)過(guò)去的臨床研究得到，調(diào)控G6PD基因的突變絕大部分為單基因突變，具有不定向不可控性，存在很多潛在危險(xiǎn)，可導(dǎo)致慢性溶血性貧血，并且很難進(jìn)行臨床治療。在早期實(shí)驗(yàn)中，研究者用CRISPR/Cas9敲除G6PD基因后，發(fā)現(xiàn)G6PD的表達(dá)顯著下降，這一結(jié)論為運(yùn)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)治療G6PD缺乏癥的研究提供了很大的啟發(fā)。在此研究的基礎(chǔ)上，研究者又運(yùn)用基因編輯技術(shù)將匹配的sgRNA和Cas9蛋白注射入人胚胎中，進(jìn)一步證明了CRISPR/Cas9所引起的同源重組可以做到校正調(diào)控G6PD的基因發(fā)生的突變。

基因編輯研究雖然是一種新興的技術(shù)，但至今也已進(jìn)行了近60年的探索，開(kāi)發(fā)了許多基因編輯技術(shù)。這些技術(shù)雖然也能做到按照人的主觀意愿改造基因，但與Cas9蛋白相比，還有明顯的不足，如只有Cas9蛋白才能做到對(duì)DNA、RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行共定位。除此之外，CRISPR/Cas9技術(shù)還具有特異性高，出錯(cuò)率低，人工設(shè)計(jì)操作較簡(jiǎn)便和使用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，具有很強(qiáng)的發(fā)展?jié)撃躘5]。

5.結(jié)語(yǔ)

由于CRISPR/Cas9技術(shù)具有高效、編輯速度快等特點(diǎn)，同時(shí)與其他基因編輯技術(shù)相比較為準(zhǔn)確和易操作，在臨床方面也運(yùn)用廣泛，為多種疾病的治療提供了助力和極大的推動(dòng)作用。但不可忽視的是，現(xiàn)代生物對(duì)基因的研究仍有不足，任何的科技發(fā)展都是一把雙刃劍，如CRISPR /Cas9 基因編輯過(guò)程中出現(xiàn)的脫靶現(xiàn)象還沒(méi)有得到有效的解決，這使得基因編輯的效率受到了影響。應(yīng)通過(guò)增強(qiáng)Cass9蛋白的專一性及提高sgRNA的穩(wěn)定性等手段，改變靶標(biāo)效率，盡量減少脫靶現(xiàn)象的出現(xiàn)；同時(shí)在對(duì)生物尤其是人類的基因進(jìn)行改造時(shí)，不要一味只追求科技的進(jìn)步而忽視了倫理問(wèn)題。綜上，基因編輯技術(shù)推動(dòng)了現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，在疾病治療中發(fā)揮了很重要的作用，但仍存在一定的缺陷，對(duì)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的研究仍有很長(zhǎng)的路要走。