秦合偉，李彥杰，郭 寧，劉志勇

(1. 河南省中醫(yī)院，鄭州 450002；2. 河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，鄭州 450002；3. 河南中醫(yī)藥大學，鄭州 450002)

動脈粥樣硬化(athcrosclerosis，AS)是缺血性心腦血管疾病的基本病理基礎。一般認為，脂質(zhì)代謝紊亂、血液流變學異常和炎性反應是促使動脈粥樣硬化斑塊形成的危險因素[1]。新近研究發(fā)現(xiàn)，參與動脈粥樣硬化的炎癥細胞中，在趨化因子以及多種細胞因子的共同作用下，外周血單核細胞分化成巨噬細胞，然后遷移到動脈內(nèi)膜吞噬脂質(zhì)后形成泡沫細胞，泡沫細胞不斷積累后形成脂質(zhì)核心，與纖維帽及炎癥因子共同組成動脈粥樣硬化斑塊，在動脈粥樣硬化的發(fā)生及斑塊形成過程中，巨噬細胞介導多種炎癥信號通路[2]。miRNAs在調(diào)節(jié)AS發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，單核/巨噬細胞、內(nèi)皮細胞及血管平滑肌細胞都參與AS的發(fā)生發(fā)展，miR-155是非編碼的微小RNA之一，研究發(fā)現(xiàn)其可表達于活化的免疫細胞并與免疫功能相關。新近研究發(fā)現(xiàn)，miR-155具有促進炎癥反應發(fā)生及放大炎癥反應的作用。該研究證實，miR-155通過調(diào)控細胞因子信號傳導抑制劑l(SOCS1, 抑炎因子)/磷酸化轉(zhuǎn)錄激活子 3(p-STAT3, 促炎因子)炎癥信號通路，進而調(diào)控程序性細胞凋亡因子4(PDCD4)，影響腫瘤壞死因子-a(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)、干擾素-γ(IFN-γ)3種炎癥因子在斑塊及血清中的表達，減少動脈粥樣硬化的炎癥反應以及減少動脈粥樣硬化最終事件的發(fā)生[3]。本實驗通過觀察冠心康對miR-155和SOCSl/p-STAT3/PDCD4炎癥信號通路的調(diào)控作用，以及對TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎癥因子的影響，探索中醫(yī)藥抗動脈粥樣硬化的作用機制，為中醫(yī)藥防治心腦血管疾病提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 動物與細胞

雄性SD大鼠20只，體質(zhì)量(300±20)g，購自南京大學模式動物研究所，動物許可證號SCXK(蘇)2015-0001。RAW 264.7只小鼠巨噬細胞株購自ATCC，所有動物飼養(yǎng)于河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院動物實驗中心，(22±1)℃恒溫、60%～75%恒濕、12 h循環(huán)照明，自由攝食、飲水。本實驗已通過河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院實驗動物倫理委員會審查(批準標號20170228)。

1.2 藥物與試劑

本研究所用中藥復方為冠心康。藥物組成：黃芪30 g，全栝樓15 g，赤芍12 g，丹參12 g，薤白12 g，半夏12 g，益母草30 g。方中所有中藥均來源于河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥劑科，由醫(yī)院煎藥房按要求煎煮和濃縮成不同濃度的湯劑(冠心康高劑量濃度3.456 g/mL，冠心康低劑量濃度0.864 g/mL)。

熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas公司；蛋白提取試劑盒購自碧云天公司；抗體pri-miR-126、RGS16和GAPDH均購自Cell Signaling公司；抗體CXCL12、CXCR4和VCAM-1購自Dako公司；二抗(羊抗小鼠IG-HRP)和氧化型低密度脂蛋白(OX-LDL)購自武漢博士德生物工程有限公司;Anti-miR-155引物由廣州銳博生物科技有限公司設計和合成。

2 方法

2.1 含藥血清的制備

將20只雄性健康SD大鼠按隨機數(shù)字表法分為中藥高劑量組、中藥低劑量組2組，高劑量組(10只) 以冠心康86.4 g/(kg·d) 灌胃，低劑量組(10只)以冠心康21.6 g/(kg·d) 灌胃，每日早晚2次，連續(xù)5 d。末次給藥后1 h，腹腔注射水合氯醛(350 mg/kg)麻醉，腹主動脈取血，37 ℃靜置1 h，3000 r/min離心10 min，分離血清放入離心管中，0.45 μm微孔濾膜過濾除菌分裝，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 細胞分組與造模

RAW264.7細胞經(jīng)培養(yǎng)、傳代、活力檢測、免疫化學鑒定，采用ox-LDL刺激RAW264.7巨噬細胞建立模型。造模后按照干預方法不同分為5組：對照組：空白血清；miR-155 mimic組：造模后參照脂質(zhì)體2000說明書轉(zhuǎn)染微小RNA-155 mimic轉(zhuǎn)染進入RAW264.7細胞；miR-155 inhibitor組：造模后參照脂質(zhì)體2000說明書轉(zhuǎn)染微小RNA-155 inhibitor轉(zhuǎn)染進入RAW264.7細胞；含藥血清高劑量組：造模后采用高劑量冠心康含藥血清干預；含藥血清低劑量組：造模后采用低劑量冠心康含藥血清干預。處理48 h后進行觀察，收集細胞總RNA和總蛋白并進行后續(xù)檢測。

2.3 藥物血清干預

血清作用于RAW 264.7細胞：將第3～5代RAW 264.7細胞棄去培養(yǎng)基，用PBS溫和洗3遍，分別加入中藥高劑量和中藥低劑量含藥血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，在37 ℃ 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。

2.4 RAW264.7細胞轉(zhuǎn)染

在無菌條件下，用含有10% FBS的細胞培養(yǎng)基DMEM，將RAW264.7細胞(1×105cells·mL-1)接種于6孔板，每孔含有2 mL培養(yǎng)基；在37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育片刻備用；取miR-155 mimic (20 μM) 0.6 μL和HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑12 μL滴加入300 μL不含F(xiàn)BS和抗生素的DMEM細胞培養(yǎng)基，混合均勻使其終濃度為5 nM；取miR-155 inhibitor (20 μM) 6 μL和HiPerFect轉(zhuǎn)染試劑12 μL滴加入300 μL細胞培養(yǎng)基DMEM(不含F(xiàn)BS和抗生素)，混合均勻使其終濃度為5 nmol/L。在室溫條件下(15～25 ℃)放置 5～10 min，直至形成轉(zhuǎn)染復合物；將轉(zhuǎn)染復合物分別均勻滴入上述接種RAW264.7細胞培養(yǎng)基中混合均勻；在37 ℃ 5% CO2細胞培養(yǎng)箱中孵育24 h后更換所需的培養(yǎng)基，等到RAW264.7細胞的融合度約達到80%時終止細胞培養(yǎng)，用細胞刮輕輕刮取細胞，以提取RAW264.7細胞的RNA和總蛋白[4]。

2.5 指標及檢測方法

2.5.1 RT-PCR檢測RAW264.7細胞中miR-155、SOCSl、p-STAT3、PDCD4 mRNA表達 表1示，收集RAW264.7細胞分離提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，采用SYBR Green進行qRT-PCR反應；反應參數(shù)：95 ℃ 30 s，1個循環(huán)；95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，40個循環(huán)[5]，樣本中目的基因的計算方法為2-ΔΔCT,GAPDH為內(nèi)參。

表1 miR-155、SOCSl、p-STAT3、PDCD4的引物序列

2.5.2 Western blotting檢測RAW264.7細胞中SOCSl、p-STAT3、PDCD4蛋白表達 收集RAW264.7細胞PBS洗滌3次，用試劑盒提取蛋白后，采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度，6%～15% SDS聚丙烯酰胺凝膠進行蛋白電泳，蛋白分離后恒定電流200 mA轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上；室溫下5%脫脂奶粉封閉2 h，用相應的一抗按照1∶1000稀釋，4 ℃孵育過夜，洗滌后換HRP標記二抗，按照1∶5000稀釋，室溫孵育2 h，TBST洗滌3次，洗滌后采用化學發(fā)光試劑盒在GE ImageQuant LAS 4000mini超靈敏化學發(fā)光成像儀顯影，使用Image J的軟件分析條帶灰度值測定目的條帶和內(nèi)參β-actin的灰度值，結果以樣本灰度值/內(nèi)參灰度值表示[5]。

2.5.3 Elisa法檢測RAW264.7細胞分泌TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎癥因子水平 取干預后細胞上清液，Elisa實驗測定TNF-α、IL-6、IFN-γ水平。嚴格按照Elisa試劑盒說明操作，TNF-α、IL-6、IFN-γ的可測范圍分別為4～500、30～4000、15～2000 ng/L，重復3次實驗，各組上清液標本平行檢測3次[5]。

2.6 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 含藥血清對細胞中miR-155、SOCSl、p-STAT3、PDCD4 mRNA表達的影響

表2示，與對照組比較，miR-155mimic組和中藥含藥血清組RAW264.7細胞中miR-155和SOCSl mRNA表達明顯升高(P<0.05)，miR-155inhibitor組RAW264.7細胞中miR-155和SOCSl mRNA表達明顯降低(P<0.05)；與對照組比較，miR-155mimic組和中藥含藥血清組RAW264.7細胞中p-STAT3和PDCD4 mRNA表達明顯降低(P<0.05)，miR-155inhibitor組RAW264.7細胞中p-STAT3和PDCD4 mRNA表達明顯升高(P<0.05)；各中藥含藥血清組RAW264.7細胞中miR-155、SOCSl、p-STAT3、PDCD4 mRNA表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表2 含藥血清對細胞中 miR-155、SOCSl、p-STAT3、PDCD4 mRNA表達的影響

3.2 含藥血清對細胞中SOCSl、p-STAT3、PDCD4蛋白表達的影響

表3圖1示，與對照組比較，miR-155mimic組和中藥含藥血清組RAW264.7細胞中SOCSl蛋白表達明顯升高(P<0.05)，miR-155inhibitor組RAW264.7細胞中SOCSl蛋白表達明顯降低(P<0.05)。與對照組比較，miR-155mimic組和中藥含藥血清組RAW264.7細胞中p-STAT3和PDCD4蛋白表達明顯降低(P<0.05)，miR-155inhibitor組RAW264.7細胞中p-STAT3和PDCD4蛋白表達明顯升高(P<0.05)。各中藥含藥血清組RAW264.7細胞中SOCSl、p-STAT3、PDCD4蛋白表達水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表3 含藥血清對細胞中SOCSl、p-STAT3、PDCD4蛋白表達的影響

圖1 含藥血清對細胞中SOCSl、p-STAT3、PDCD4蛋白表達的影響

3.3 含藥血清對細胞液TNF-α、IL-6、IFN-γ水平的影響

表4示，與對照組比較，miR-155mimic組和含藥血清組細胞液中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平明顯降低(P<0.05)，miR-155inhibitor組細胞液中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平明顯升高(P<0.05)。各含藥血清組細胞液中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

表4 含藥血清對細胞液TNF-α、IL-6、IFN-γ水平的影響

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，動脈內(nèi)皮損害是動脈粥樣斑塊形成的重要始動因素，AS的發(fā)生是由于血管內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞受到各種危險因子損傷時，血管局部產(chǎn)生的一種過度的慢性炎性增生反應，miRNAs在調(diào)節(jié)AS發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，單核/巨噬細胞、內(nèi)皮細胞及血管平滑肌細胞都參與AS的發(fā)生發(fā)展，而miRNAs對這幾種細胞的功能均具有調(diào)節(jié)作用，miRNAs是抗AS藥物的潛在作用靶點[3]。

miR-155是非編碼的微小RNA之一，研究發(fā)現(xiàn)其可表達于活化的免疫細胞并與免疫功能有關，且與心血管疾病和動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展密切相關[6]。研究認為，miR-155能抑制炎癥反應，減少黏附因子和趨化因子表達，從而抑制炎癥反應[7]。動物研究在miR-155-/-/ApoE-/-雙基因敲除模型小鼠中發(fā)現(xiàn)，miR-155的表達缺乏可明顯降低巨噬細胞的炎癥浸潤程度及減慢動脈粥樣硬化的形成[8]。研究發(fā)現(xiàn)，過表達miR-155可使炎癥反應加強，促進泡沫細胞的生成，進而加速動脈粥樣硬化的形成進程[9]。PDCD4是一種腫瘤抑制因子，在巨噬細胞中，PDCD4可以通過激活轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)抑制白介素10(IL-10)的表達,進而促進炎癥反應，PDCD4還能夠通過增殖及誘導內(nèi)皮細胞、血管平滑肌細胞和成纖維細胞等引起各種細胞的凋亡[10-11]。SOCS1是一種重要的炎癥負向調(diào)控因子，其主要功能為通過抑制TNF-α、IL-6、INF-γ等各種炎癥細胞因子的產(chǎn)生，進而抑制炎癥反應。SOCSl也是miR-155的目標靶基因，miR-155可以直接與SOCSl結合逆向調(diào)節(jié)巨噬細胞的炎癥反應[12]，而且巨噬細胞中的miR-155也可以通過SOCSl信號傳感器和活化的STAT3信號途徑,促進心臟肥大和功能衰竭[13]。新近研究發(fā)現(xiàn)，miR-155具有促進及放大炎癥反應的作用。該研究證實，miR-155通過調(diào)控SOCS1/p-STAT3炎癥信號通路，進而調(diào)控PDCD4，影響TNF-α、IL-6、INF-γ炎癥因子在斑塊中及血清中的表達，降低動脈粥樣硬化的炎癥反應以及動脈粥樣硬化最終事件的發(fā)生[3]。

本課題組結合前期研究認為，痰瘀證是動脈粥樣硬化的主要證型，提出益氣活血、化痰降濁的治療大法?！胺綇姆ǔ?，以法統(tǒng)方”。本研究方藥冠心康由《金匱要略》栝樓薤白半夏湯化裁而來，其中生黃芪為君藥，丹參和赤芍為臣藥，可益氣活血、祛瘀通絡，佐以栝樓、薤白化痰降濁，通陽散結；制半夏燥濕化痰，益母草活血通經(jīng)、利水泄?jié)?，全方補瀉兼施、升降同調(diào)、相輔相成，共奏益氣健脾、化痰泄?jié)?、活血祛瘀之功效。前期研究結果表明，冠心康抗動脈粥樣硬化的作用與抗炎、保護血管內(nèi)皮、抑制血小板聚集和調(diào)節(jié)免疫等多種生物效應有關[14]；新近研究還表明，冠心康具有調(diào)節(jié)抑制血小板活化的作用，同時冠心康可能通過阻斷SDF-1/CXCR4生物軸，下調(diào)EPC上CXCR4表達，減弱其下游信號途徑，控制骨髓源性內(nèi)皮祖細胞動員及募集，從而抑制EPC的生物學功能途徑，起到抗動脈粥樣硬化的作用[15-17]。

本實驗采用ox-LDL刺激RAW264.7巨噬細胞，建立動脈粥樣硬化模型，觀察冠心康對RAW264.7細胞miRNA-155和SOCS1-STAT3-PDCD4生物軸的調(diào)控，以及對TNF-α、IL-6、IFN-γ的影響，從分子、細胞層次揭示中藥復方冠心康防治AS的分子機制，為AS相關疾病的防治提供新思路。本研究結果再次驗證miRNA-155能夠調(diào)控SOCS1-STAT3-PDCD4生物軸，影響TNF-α、IL-6、IFN-γ表達，同時表明冠心康含藥血清能夠提高ox-LDL損傷模型RAW264.7細胞中miR-155 mRNA、SOCSl表達水平，降低p-STAT3和PDCD4表達，降低細胞液中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平。研究結果說明，冠心康抗動脈粥樣硬化的分子機制可能與調(diào)節(jié)miR-155、調(diào)控SOCSl/p-STAT3/PDCD4炎癥信號通路、降低TNF-α、IL-6、IFN-γ等炎癥因子表達有關。