李 煜，劉尹航，陳 超

（1. 海軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物學(xué)教研室，上海 200433；2. 上海外國語大學(xué)附屬中學(xué)，上海 200083）

[關(guān)鍵字] 裸鼴鼠；心臟；60Coγ射線；輻射耐受

癌癥是威脅人類健康的重大疾病之一，全球每年有數(shù)千萬人死于癌癥。目前，放射治療是治療癌癥的常用方法之一，大約半數(shù)的癌癥患者通過放療手段進(jìn)行治療[1-2]。但是，在放療過程中，不可避免地癌癥患者會出現(xiàn)相應(yīng)的放療后遺癥，放射性心臟病便是其中之一。放射性心臟病范圍較廣，包括心包炎、心肌病、心肌纖維化、瓣膜病、冠狀動脈疾病和傳導(dǎo)異常等[3-4]。放射性心臟病一旦發(fā)生，便不可逆轉(zhuǎn)，從早期的急性心包炎向晚期動脈粥樣硬化、心臟瓣膜損傷以及心臟傳導(dǎo)異常等轉(zhuǎn)變[5]，嚴(yán)重威脅人類健康。

電離輻射包括人工輻射和天然輻射。目前，人工輻射已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、工業(yè)、軍事和醫(yī)療領(lǐng)域[6]。天然輻射廣泛地分布于人類賴以生存的自然環(huán)境，其中，60Co放射源產(chǎn)生的γ射線也是天然輻射的一種。因具有波長短、頻率高、能量高等特點(diǎn)，60Co暴露達(dá)到一定劑量就會對生物體造成DNA與RNA降解等影響，從而使得蛋白質(zhì)合成等功能喪失，導(dǎo)致生物體的損傷[7-9]。有研究報道[10-12]，高劑量的輻射能夠引起急性心包炎，一段時間后還可能引起動脈粥樣硬化加速、不良心肌重塑、傳導(dǎo)異常和心臟瓣膜損傷等癥狀。目前，雖然放射性心臟病的生物學(xué)機(jī)制日趨明確[13]，但臨床研究過程中最適實驗動物的選擇尚未有明確報道。

裸鼴鼠屬于嚙齒目，分布于肯尼亞、埃塞俄比亞等非洲地區(qū)。1980年代后期發(fā)現(xiàn)，裸鼴鼠應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)研究方面具有較多優(yōu)越性[14]。裸鼴鼠因具有對癌癥的天然免疫等特性，受到生物醫(yī)學(xué)界的廣泛關(guān)注。電離輻射作為誘發(fā)癌癥的因素之一，是致癌模型建立的常用方式。裸鼴鼠雖然對癌癥天然免疫，但是否對電離輻射具有耐受目前尚未見報道。在前期的預(yù)實驗中，本課題組對裸鼴鼠進(jìn)行了不同劑量的60Coγ射線一次性全身照射，并對其存活率進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果顯示，10 Gy組裸鼴鼠30 d存活率為50%。因此，本研究通過觀察裸鼴鼠經(jīng)10 Gy60Coγ射線輻照后的心臟組織結(jié)構(gòu)及生化指標(biāo)變化，初步探討裸鼴鼠心臟的輻射耐受能力，為后續(xù)研究其耐受特性的分子機(jī)制提供依據(jù)，為臨床治療放射性心臟病提供思路。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

18月齡健康雄性裸鼴鼠21只，由本教研室生產(chǎn)，飼養(yǎng)于屏障設(shè)施[S Y X K（滬）2 0 1 7-0004]。

1.2 實驗動物分組與實驗處理

21只裸鼴鼠隨機(jī)分為2組，分別為對照組7只和實驗組14只。實驗組裸鼴鼠給予一次性全身60Coγ射線輻照，輻射劑量率為1.163 Gy/min，輻照時間為8.6 min，總輻射劑量為10 Gy，由海軍軍醫(yī)大學(xué)輻照中心完成。

1.3 主要儀器設(shè)備及試劑

自動組織脫水機(jī)、包埋機(jī)、轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)、染色機(jī)、封片機(jī)和倒置熒光顯微鏡等均購自徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司；生化檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 心臟組織切片的制備與觀察 分別取對照組、60Coγ射線輻照后7 d和14 d實驗組各3只裸鼴鼠，通過腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉對動物進(jìn)行麻醉，迅速打開胸腔，取其心臟，置于通用型中性組織固定液中固定24 h。經(jīng)脫水、透明、包埋、切片、染色、封固等步驟完成H E染色組織切片的制備，光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.4.2 心臟組織氧化應(yīng)激水平檢測 分別取對照組、輻照后7 d和14 d實驗組各4只裸鼴鼠，通過腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉對動物進(jìn)行麻醉，迅速打開胸腔，取其心臟，剪取0.1 g心臟組織，經(jīng)40 μm孔徑篩網(wǎng)研磨過濾后加入1 mL裂解液，12 000×g，4 ℃離心10 min，取上清液用于檢測丙二醛（MDA）、總抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽（GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量，檢測步驟參照試劑盒說明書。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均以x-±s表示，使用Graphpad Prism 5.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。多組計量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 形態(tài)學(xué)觀察

光學(xué)顯微鏡下觀察，對照組心肌細(xì)胞大小正常，呈短柱狀，有分支和橫紋，心肌細(xì)胞間結(jié)構(gòu)正常，心肌纖維排列整齊致密（圖1 A）。60Coγ射線輻照后7 d及14 d，鏡下可見心肌纖維排列緊密，心肌細(xì)胞大小正常，未出現(xiàn)明顯的萎縮、水腫、壞死及纖維化等病變（圖1B、C），但偶見小灶心肌血管充血（圖1 C）。

2.2 心臟生化指標(biāo)檢測結(jié)果

如表1顯示，輻照后7 d心臟組織中MDA含量顯著高于對照組（P＜0.01），60Coγ射線輻照后14 d較輻照后7 d顯著降低（P＜0.01），但仍顯著高于對照組（P＜0.01）。心臟組織T-AOC在輻照后7 d未有顯著降低，但在輻照后14 d顯著低于對照組（P＜0.05）和輻照后7 d組（P＜0.05）。心臟組織GSH與GSSG含量均在輻照后7 d和輻照后14 d顯著降低（P＜0.01），且輻照后14 d組含量顯著低于輻照后7 d組（P＜0.01）。

表 1 60Coγ射線輻照對裸鼴鼠心臟氧化應(yīng)激水平的影響Table 1 Effect of 60Coγ-ray radiation on oxidative stress in the heart of naked mole rats(-x ± s)

3 討論

電離輻射雖然對腫瘤具有一定程度的治療作用，但其引發(fā)的放射性并發(fā)癥也一直嚴(yán)重威脅著人類的健康。心臟作為對電離輻射較為敏感的器官，在經(jīng)過電離輻射后，通常情況下會出現(xiàn)與輻射劑量和輻射時間具有相關(guān)性和依賴性的病變。王升曄等[15]報道小鼠心臟在經(jīng)過電離輻射后呈現(xiàn)出心臟廣泛纖維增厚、心臟微血管和內(nèi)皮細(xì)胞減少等病變，輻射能導(dǎo)致心肌纖維排列紊亂，心肌細(xì)胞出現(xiàn)水樣變性等。另有研究發(fā)現(xiàn)，在局部心臟輻射幾個月后，可以觀察到心肌血管周圍間質(zhì)膠原沉積增加，并逐漸惡化[16-18]。大鼠在經(jīng)過全身高劑量輻射后，心臟微血管密度顯著降低[19]。此外，有報道顯示，經(jīng)過輻射后，不僅心臟微血管密度會改變，其部分功能亦發(fā)生改變[20]。本研究中，經(jīng)過一次性10 Gy60Coγ射線輻照后，裸鼴鼠心肌纖維排列緊密，心肌細(xì)胞大小正常，僅偶見小灶心肌血管充血，未出現(xiàn)心肌纖維廣泛增厚、排列嚴(yán)重紊亂、間質(zhì)細(xì)胞炎性浸潤和纖維化等病變，表明裸鼴鼠心臟組織結(jié)構(gòu)未受輻射的明顯影響。

輻射對于細(xì)胞的損傷，一方面是通過對其直接生化修飾進(jìn)行影響，另一方面則是通過分解細(xì)胞水分子產(chǎn)生活性氧簇和活性氮自由基，促使機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而間接損傷組織結(jié)構(gòu)[14,21]。正常情況下，對于體內(nèi)存在的自由基，機(jī)體具有一定的清除機(jī)制，即機(jī)體抗氧化防御機(jī)制。該機(jī)制包括以GSH、過氧化氫酶等為代表的低分子量抗氧化劑，能夠?qū)⒀趸蜃咏?jīng)過一系列反應(yīng)最終轉(zhuǎn)化為水和氧氣[22-23]。當(dāng)機(jī)體受到電離輻射時，自由基大量產(chǎn)生，超出了機(jī)體清除機(jī)制的承受能力，因此會引起機(jī)體的氧化損傷。而機(jī)體受到氧化損傷最直接的重要標(biāo)志，就是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物MDA大量增加。研究發(fā)現(xiàn)，將小鼠進(jìn)行6 Gy劑量60Coγ射線照射后，其心臟組織中MDA顯著增加[24]。作為機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化和自由基清除劑，GSH在機(jī)體中主要以兩種形式存在，分別為GSSG和還原型GSH，但機(jī)體正常情況下主要以還原型GSH形式存在[25]，且自身會維持還原型GSH和GSSG的動態(tài)平衡，以更好保證生物體內(nèi)抗氧化和清除行為的進(jìn)行；而受到不同條件刺激時，該動態(tài)平衡將進(jìn)行自身調(diào)整以應(yīng)對外部刺激。如左麗麗等[24]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在經(jīng)過6 Gy劑量60Coγ射線照射后，其心臟組織中GSH含量顯著降低。T-AOC反映的是機(jī)體總體的抗氧化能力，其數(shù)值的高低表明機(jī)體抗氧化能力的強(qiáng)弱[26]。在本研究中，經(jīng)過一次性10 Gy60Coγ射線照射后，裸鼴鼠心臟組織中MDA含量顯著增加，T-AOC、GSH和GSSG含量均顯著降低，與文獻(xiàn)報道結(jié)果相符，表明裸鼴鼠心臟組織在輻射后發(fā)生明顯的氧化應(yīng)激，且心肌過氧化損傷顯著。

綜上所述，雖然裸鼴鼠心臟組織中的MDA

含量呈現(xiàn)升高趨勢，T-AOC、GSH和GSSG含量均呈現(xiàn)時間相關(guān)的遞減趨勢，但在組織學(xué)觀察時并未發(fā)現(xiàn)相應(yīng)病變。一方面表明了裸鼴鼠心臟組織確實具有一定程度的輻射耐受能力，另一方面也說明裸鼴鼠心臟組織中還存在其他尚未明確的抗氧化修復(fù)機(jī)制或其他輻射耐受機(jī)制，這為后續(xù)的裸鼴鼠輻射耐受機(jī)制的研究奠定了基礎(chǔ)。