丁欽 吳克儉 鄭璐

摘要 目的：探討補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚調(diào)控γδT細(xì)胞消減胃癌SGC-7901程度。方法：獲取人外周血中單個(gè)核細(xì)胞，體外擴(kuò)增γδT細(xì)胞，不同濃度BVC誘導(dǎo)γδT細(xì)胞、SGC-7901細(xì)胞24 h、48 h和72 h，CCK-8檢測(cè)BVC對(duì)γδT細(xì)胞增殖率、SGC-7901抑制率影響;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)γδT細(xì)胞GZMB、PF、CD107a產(chǎn)生量;LDH法測(cè)γδT細(xì)胞消減SGC-7901程度。結(jié)果：體外擴(kuò)增8 d，γδT細(xì)胞比例由3.54%增至85.34%。與對(duì)照組比較，BVC誘導(dǎo)24 h，濃度10～80 nmol/L促進(jìn)γδT細(xì)胞增殖（P<0.05）。BVC誘導(dǎo)48 h、72 h，濃度5～80 nmol/L促進(jìn)γδT細(xì)胞增殖（P<0.05）。同樣濃度，72 h γδT細(xì)胞增殖率最大。BVC作用腫瘤細(xì)胞24 h、48 h、72 h，濃度160～640 nmol/L SGC-7901生長(zhǎng)抑制率高于對(duì)照組（P<0.05），濃度10～40 nmol/L，GZMB、PF、CD107a表達(dá)高于對(duì)照組（P<0.05）。BVC誘導(dǎo)γδT細(xì)胞72 h，一定濃度該T細(xì)胞消減SGC-7901程度隨濃度增高而增高，濃度40 nmol/L消減程度最大，后呈下降趨勢(shì)。結(jié)論：BVC適宜濃度促進(jìn)γδT細(xì)胞增殖，抑制SGC-7901生長(zhǎng)，加強(qiáng)γδT細(xì)胞消減SGC-7901程度，機(jī)制考慮：PF、GZMB、CD107a表達(dá)提高增強(qiáng)γδT細(xì)胞消減能力。

關(guān)鍵詞 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚;γδT細(xì)胞;胃癌;SGC-7901;殺傷活性;顆粒酶B;穿孔素;CD107a

Abstract Objective：To investigate the regulation of psoralen dihydroflavonoid methyl ether to reduce the degree of gastric cancer SGC-7901 by γδT cells.Methods：Human peripheral blood mononuclear cells was obtained，γδ T cells in vitro was expanded，γδ T cells and SGC-7901 cells with different concentrations of BVC for 24 h，48 h and 72 h were induced.CCK-8 detected the effect of BVC on the proliferation rate of γδ T cells and SGC inhibition rate; flow cytometry was used to measure the production of GZMB，PF，CD107a in γδ T cells; LDH method was used to measure the degree of γδ T cell depletion SGC-7901.Results：After 8 days of in vitro expansion，the proportion of γδT cells increased from 3.54% to 85.34%.Compared with the control group，BVC was induced for 24 h at a concentration of 10 to 80 nmol/L to promote the proliferation of γδT cells（P<0.05）.BVC was induced 48 h，72 h，with the concentration of 5 to 80 nmol/L promoting the proliferation of γδT cells（P<0.05）.At the same concentration，72 h γδT cell proliferation rate was the highest.BVC acted on tumor cells for 24 h，48 h，72 h，with a concentration of 160-640 nmol/L.The growth inhibition rate of SGC-7901 was higher than that of the control group（P<0.05），with a concentration of 10-40 nmol/L.GZMB，PF and CD107 expression was higher than the control group（P<0.05）.As for BVC induced γδ T cells for 72 h，the degree of depletion of SGC-7901 at a certain concentration of T cells increased with the increase of the concentration.The degree of depletion of SGC-7901 at a concentration of 40 nmol/L was the largest and then showed a downward trend.Conclusion：The appropriate concentration of BVC promotes the proliferation of γδ T cells，inhibits the growth of SGC-7901，and strengthens the degree of depletion of SGC-7901 by γδ T cells.The mechanism is considered：the expression of PF，GZMB，and CD107a increase and enhance the depletion ability of γδ T cells.

Keywords Psoralen dihydroflavonoid methyl ether; γδT cells; Gastric cancer; SGC-7901; Killing activity; Granzyme B; Perforin; CD107a

中圖分類(lèi)號(hào)：R735.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A doi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.20.007

目前中國(guó)正面臨著人口老齡化的挑戰(zhàn)和快速城市化的影響，癌癥的發(fā)病率也隨之增加[1]。胃癌在亞洲東部、歐洲東部以及美國(guó)熱帶南部等地區(qū)具有特別高的發(fā)病率[2]。胃癌患病率高，但療效不佳，欠缺有效的治療措施。目前，腫瘤免疫治療得到了長(zhǎng)足的進(jìn)步，為該類(lèi)患者遠(yuǎn)期療效帶來(lái)了根本性變化[3]。γδT細(xì)胞是一種能夠表達(dá)抗原受體的免疫細(xì)胞，γδT細(xì)胞參與的抗腫瘤免疫治療主要是通過(guò)分泌促凋亡分子和炎性反應(yīng)細(xì)胞因子或者通過(guò)TCR依賴(lài)性途徑，對(duì)多種癌細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性，從而在免疫監(jiān)視和針對(duì)腫瘤的免疫防御中的起到重要作用[4]。甲基補(bǔ)骨脂黃酮是由補(bǔ)骨脂提取的某種化合物，具有消減腫瘤、調(diào)整免疫等多種療效[5]，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（BVC）對(duì)HepaRG、HCT-116、PC-3等多種細(xì)胞具有抗增殖作用[6-7]。2014年，Chen X等[8]發(fā)現(xiàn)BVC能促使Th2向Th1飄移，進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)免疫作用。為此，我們假設(shè)其可能同樣能夠調(diào)控γδT細(xì)胞的免疫能力以及抗癌的效果，同時(shí)初探其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 將已復(fù)蘇的胃癌SGC-7901細(xì)胞株用GT-T551H3培養(yǎng)基予以懸浮，每瓶15 mL加入75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37°C、5% CO2條件下培養(yǎng)，每2～3天更換腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞鋪滿(mǎn)80%左右的瓶底時(shí)，釆用0.25%的胰蛋白酶予以脫壁，待細(xì)胞懸浮完成后收取細(xì)胞，予以計(jì)數(shù)后用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.1.2 藥物 補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（Bavachinin，大連美侖生物技術(shù)公司，貨號(hào)：MB6545）。

1.1.3 試劑與儀器 二甲基亞砜（湖南九典制藥股份有限公司，批號(hào)：F25170302）;淋巴細(xì)胞分離液（天津市灝陽(yáng)生物制品科技有限責(zé)任公司，貨號(hào)：LTS1077）;補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（大連美侖生物技術(shù)公司，貨號(hào)：MB6545）;異戊烯焦磷酸（Sigma-Aldrich，美國(guó)，批號(hào)：SLCB2751）;胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)，貨號(hào)：10091-148）;GT-T551 H3培養(yǎng)基（TaKaRa公司，日本，批號(hào)：AK2P027）;Anti-CD3（PeproTech公司，美國(guó)，批號(hào)：25G261905121）;IL-2（雙鷺?biāo)帢I(yè)，批號(hào)：S19991007）;CCK-8（日本同仁，日本，貨號(hào)：VC5001）;CD107a（Biolegend公司，美國(guó)，批號(hào)：B181677）;穿孔素（蘇州康達(dá)醫(yī)療用品貿(mào)易有限公司，批號(hào)：7297548）;顆粒酶B（Becton，Dickinson and Company，美國(guó)，批號(hào)：3200644）;破膜劑（Nordic Mubio，荷蘭，批號(hào)：16389）;胰蛋白酶（Beyotime，批號(hào)：011020200528）;乳酸脫氫酶試劑盒（寧波普瑞柏生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：LD0359）;貝克曼AU680生化儀（貝克曼，美國(guó)，型號(hào)：AU680）;實(shí)驗(yàn)顯微鏡（NiKON，日本，型號(hào)：NiKON ECLIPSE TE2000-S）;酶標(biāo)儀（上?？迫A生物工程股份有限公司，型號(hào)：KHB ST-360）;流式細(xì)胞技術(shù)儀（BD公司，美國(guó)，型號(hào)：BD-FACSCalibur）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備

1.2.1.1 CCK8法檢測(cè)BVC對(duì)γδT細(xì)胞生長(zhǎng)影響 ?對(duì)照組：γδT細(xì)胞（未加入補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚）;實(shí)驗(yàn)組：γδT細(xì)胞+不同濃度的補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（2.5、5.0、10、20、40、80、160、320、640 nmol/L）。

1.2.1.2 CCK8法檢測(cè)BVC對(duì)胃癌SGC-7901生長(zhǎng)改變 對(duì)照組：胃癌SGC-7901細(xì)胞株（未加入補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚）;實(shí)驗(yàn)組：胃癌SGC-7901細(xì)胞株+不同濃度的補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（2.5、5.0、10、20、40、80、160、320、640 nmol/L）。

1.2.1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度BVC誘導(dǎo)前后γδT免疫細(xì)胞中藻紅蛋白標(biāo)記的PF、GZMB及藻藍(lán)蛋白標(biāo)記的CD107a表達(dá) 對(duì)照組：γδT細(xì)胞（未加入補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚）。實(shí)驗(yàn)組：γδT細(xì)胞+不同終濃度的補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚（根據(jù)CCK8最終結(jié)果篩選出實(shí)驗(yàn)濃度，補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚終濃度設(shè)置為2.5、10、40、160 nmol/L）。

1.2.1.4 LDH法測(cè)定不同濃度BVC誘導(dǎo)前后的γδT細(xì)胞消減SGC-7901細(xì)胞程度 對(duì)照組：γδT細(xì)胞+胃癌SGC-7901細(xì)胞（未加入補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚）;實(shí)驗(yàn)組：不同濃度補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚作用72 h后的γδT細(xì)胞+胃癌SGC-7901細(xì)胞株（補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚終濃度分別為2.5、10、40、160 nmol/L）。

1.2.2 給藥方法

1.2.2.1 CCK8法檢測(cè)BVC對(duì)γδT細(xì)胞生長(zhǎng)影響 ?對(duì)照組：未加入補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚;實(shí)驗(yàn)組：補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚藥物終濃度分別為2.5、5.0、10、20、40、80、160、320、640 nmol/L。

1.2.2.2 CCK8法檢測(cè)BVC對(duì)人胃癌SGC-7901生長(zhǎng)改變 對(duì)照組：未加入補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚;實(shí)驗(yàn)組：補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚藥物終濃度分別為2.5、5.0、10、20、40、80、160、320、640 nmol/L。

1.2.2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同濃度BVC誘導(dǎo)前后γδT免疫細(xì)胞中藻紅蛋白標(biāo)記的PF、GZMB及藻藍(lán)蛋白標(biāo)記的CD107a表達(dá) 對(duì)照組：γδT細(xì)胞（未加入補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚）。實(shí)驗(yàn)組：補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚終濃度設(shè)置為2.5、10、40、160 nmol/L。

1.2.2.4 LDH法測(cè)定不同濃度BVC誘導(dǎo)前后的γδT細(xì)胞消減SGC-7901細(xì)胞程度 對(duì)照組：γδT細(xì)胞+胃癌SGC-7901細(xì)胞（未加入補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚）。實(shí)驗(yàn)組：補(bǔ)骨脂二氫黃酮甲醚終濃度分別為2.5、10、40、160 nmol/L。

1.2.3 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.2.3.1 γδT細(xì)胞培養(yǎng)前后純度鑒定的檢測(cè) γδT細(xì)胞百分比、FCM。具體如下：取康壯志愿者抗凝血20 mL，用淋巴細(xì)胞分離液獲取具有單個(gè)核的細(xì)胞（1 800 r/min，離心12 min，離心半徑為12 cm，下同），等滲鹽水洗滌2次（1 800 r/min離心，9 min/次），用GT-T551 H3培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度為1.0×105/mL，置于75 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再放入37°C、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，8 d后收集細(xì)胞，進(jìn)行免疫細(xì)胞表型檢測(cè)和有關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.3.2 BVC對(duì)γδT細(xì)胞生長(zhǎng)影響的檢測(cè) 增殖率、CCK8法。具體如下：取培育8 d的γδT細(xì)胞，測(cè)試γδT細(xì)胞純度達(dá)到使用要求，將γδT細(xì)胞調(diào)整為細(xì)胞懸液，接種于96孔板，200 μL/孔，依據(jù)BVC的不同濃度分為10組，并將藥物終濃度0 nmol/L定為對(duì)照組。加藥時(shí)間為γδT細(xì)胞貼壁后，同一種濃度同一時(shí)間段設(shè)3個(gè)復(fù)孔。繼續(xù)培養(yǎng)不同的時(shí)間段。各個(gè)孔滴入CCK8 20 μL，需避免氣泡，以免影響后續(xù)OD值的讀數(shù)，繼續(xù)培育4 h，棄上清液，上酶標(biāo)儀（450NM）測(cè)定各孔吸光值并記錄結(jié)果。每組重復(fù)操作實(shí)驗(yàn)3遍，取結(jié)果平均值，計(jì)算增殖率。

1.2.3.3 BVC對(duì)人胃癌SGC-7901生長(zhǎng)改變的檢測(cè) 腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）、CCK8法。具體如下：獲得處于對(duì)數(shù)期的SGC-7901，每孔3×104個(gè)細(xì)胞接種到96孔板，根據(jù)BVC不同終濃度分為10組，同時(shí)將藥物終濃度0 nmol/L定為對(duì)照組，培育不同的時(shí)間段后，每孔加入CCK8 10 μL，再培育4 h，于酶標(biāo)儀450 nm處檢測(cè)各孔吸光度（OD）值，計(jì)算腫瘤細(xì)胞抑制率。各組3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)3次，取其結(jié)果的平均值。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率（%）=（對(duì)照組OD值-實(shí)驗(yàn)組OD值）/（對(duì)照組OD值）×100%。

1.2.3.4 不同濃度的BVC誘導(dǎo)前后γδT免疫細(xì)胞中藻紅蛋白標(biāo)記的PF、GZMB及藻藍(lán)蛋白標(biāo)記的CD107a表達(dá)的檢測(cè) PF表達(dá)率、GZMB表達(dá)率、CD107a表達(dá)率、流式細(xì)胞術(shù)。具體如下：取BVC誘導(dǎo)72 h后的γδT細(xì)胞，重復(fù)清洗3遍，細(xì)胞數(shù)目為1×107/L，100 μL細(xì)胞懸液加入流式細(xì)胞技術(shù)分析管，每個(gè)試管滴anti-γδTCR-FITC20 μL，遮光培育30 min。100 μL固定液室內(nèi)溫度遮光培育15 min，PBS洗滌，1 500 r/min，離心5 min，棄上清。檢測(cè)藻紅蛋白標(biāo)記的GZMB、PF的管中加入破膜劑B 100 μL，各試管滴加anti-GraB-PE、anti-PFP-PE各5 μL;期間均設(shè)置同型對(duì)照抗體管。室內(nèi)溫度遮光培育15 min，清洗，2 000 r/min，離心5 min，棄上清，PBS 1 mL重懸細(xì)胞，流式分析儀分析各管中藻紅蛋白標(biāo)記的GZMB、PF的表達(dá)及藻藍(lán)蛋白標(biāo)記的CD107a的表達(dá)。反復(fù)3次，取結(jié)果的平均。

1.2.3.5 測(cè)定不同濃度BVC誘導(dǎo)前后的γδT細(xì)胞消減SGC-7901細(xì)胞程度的檢測(cè) 消減活性（%）、LDH法。具體如下：各自滴入預(yù)設(shè)好濃度的BVC（終濃度為2.5、10、40、160 nmol/L），未加BVC的為對(duì)比組，各個(gè)組復(fù)孔3個(gè)，孵育72 h，作為效應(yīng)細(xì)胞。效靶細(xì)胞每個(gè)均取0.5 mL，培育6 h，輕柔混好，轉(zhuǎn)速1 800 r/min，離心時(shí)間為10 min，收集上清液。選定波長(zhǎng)下測(cè)取吸光度值（A值），計(jì)算消減活性，實(shí)驗(yàn)操作重復(fù)3遍，取結(jié)果的平均值加以計(jì)算。消減活性（%）按照已定公式加以計(jì)算。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間處置予以單因素的方差分析，假設(shè)檢驗(yàn)的標(biāo)尺以α=0.05加以比對(duì)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 γδT細(xì)胞培養(yǎng)前后純度鑒定 FCM結(jié)果顯示，人γδT細(xì)胞體外培養(yǎng)8 d后，所占比例由培養(yǎng)前的3.54%增加到85.34%。見(jiàn)圖1。

2.2 BVC對(duì)γδT細(xì)胞增殖率的影響 不同濃度BVC作用γδT細(xì)胞不同的時(shí)間段，BVC誘導(dǎo)24 h后，與對(duì)照組比較，其濃度位于10～80 nmol/L時(shí)能夠促使γδT細(xì)胞增殖（P<0.05）。BVC誘導(dǎo)48 h、72 h后，與對(duì)照組比較，濃度位于5～80 nmol/L時(shí)能夠促進(jìn)γδT細(xì)胞增殖（P<0.05）。當(dāng)藥物濃度超過(guò)320 nmol/L時(shí)，3個(gè)時(shí)間段的γδT細(xì)胞均處于抑制狀態(tài)（P<0.05）。同樣藥物濃度時(shí)，72 h的γδT細(xì)胞增殖率最大。見(jiàn)表1，圖2。

2.3 BVC作用不同時(shí)間對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞生長(zhǎng)的影響 在BVC作用腫瘤細(xì)胞24 h、48 h、72 h后，與對(duì)照組比較，CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，藥物濃度在160～640 nmol/L區(qū)間時(shí)胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率要高于對(duì)照組（P<0.05），其他藥物濃度組SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），結(jié)果表明BVC在高濃度時(shí)對(duì)SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。見(jiàn)表2，圖3。

2.4 不同濃度BVC對(duì)γδT細(xì)胞穿孔素、GZMB、CD107a影響 流式細(xì)胞術(shù)測(cè)驗(yàn)結(jié)果表明，BVC誘導(dǎo)γδT細(xì)胞72 h后，當(dāng)其藥物濃度在10～40 nmol/L區(qū)間時(shí)，藻紅蛋白標(biāo)記GZMB、藻紅蛋白標(biāo)記PF以及藻藍(lán)蛋白標(biāo)記的CD107a的狀況均高于對(duì)照組（P<0.05），并且當(dāng)BVC的藥物濃度超過(guò)40 nmol/L時(shí)，藻紅蛋白標(biāo)記的穿孔素、藻紅蛋白標(biāo)記GZMB以及藻藍(lán)蛋白標(biāo)記的CD107a的狀況呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。見(jiàn)表3，圖4～6。

2.5 BVC調(diào)控γδT細(xì)胞消減人胃腺癌SGC-7901細(xì)胞程度 BVC誘導(dǎo)γδT細(xì)胞72 h以后，在一定的濃度范圍內(nèi)，γδT細(xì)胞對(duì)于人胃腺癌SGC-7901的消減隨著濃度的增高而增高，濃度為40 nmol/L時(shí)消減活性最大，并且當(dāng)BVC的藥物濃度超過(guò)40 nmol/L時(shí)，γδT細(xì)胞對(duì)于胃癌SGC-7901細(xì)胞的消減活性呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。見(jiàn)表4，圖7。

3 討論

胃癌（Gastric Cancer，GC）是世界上常見(jiàn)腫瘤之一，是全球癌癥相關(guān)死亡的第二大原因。不可切除或轉(zhuǎn)移性胃癌患者的預(yù)后較差[9]。我國(guó)是胃癌高發(fā)國(guó)家，發(fā)病和死亡例數(shù)均約占世界的50%，疾病負(fù)擔(dān)嚴(yán)重，是癌癥防治的重點(diǎn)[10]。

BVC是一種異戊烯基黃酮類(lèi)化合物，用途廣泛，如消減癌癥細(xì)胞、抗過(guò)敏、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等[11-12]。通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在BVC作用腫瘤細(xì)胞24 h、48 h以及72 h后，CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，藥物濃度在160～640 nmol/L區(qū)間時(shí)胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率高于對(duì)照組（P<0.05），其他藥物濃度組SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BVC在高濃度時(shí)對(duì)胃癌SGC-7901細(xì)胞的生長(zhǎng)具有抑制作用。結(jié)合BVC有調(diào)節(jié)免疫作用，我們考慮是否可以通過(guò)輔助采用免疫治療的手段，來(lái)增強(qiáng)抗腫瘤的效果。

免疫細(xì)胞消減癌癥細(xì)胞是借助免疫效應(yīng)細(xì)胞來(lái)控制惡性腫瘤目標(biāo)的一種療法，其已成為一種新的治療腫瘤的方式。有別于αβT細(xì)胞，γδT細(xì)胞能夠以不依賴(lài)MHC的方式來(lái)識(shí)別抗原。如淋巴細(xì)胞功能相關(guān)分子（LFA）、NKG2D分子、CD16以及其他在γδT細(xì)胞識(shí)別和殺傷癌細(xì)胞中發(fā)揮關(guān)鍵作用的分子[13]?？偠灾?，γδT細(xì)胞在癌癥免疫治療方面有較為廣泛的應(yīng)用前景。在此次實(shí)驗(yàn)中，BVC誘導(dǎo)γδT細(xì)胞24 h后，在10～80 nmol/L的濃度范圍內(nèi)，與對(duì)照組比較，γδT細(xì)胞有一定程度的增殖。BVC誘導(dǎo)γδT細(xì)胞48 h、72 h后，在5～80 nmol/L的濃度范圍內(nèi)，與對(duì)照組比較，γδT細(xì)胞較之有一定程度的增殖。這為今后的胃癌臨床免疫治療中應(yīng)用BVC提供了些許理論參考。

CTL是針對(duì)癌癥的較為理想的免疫細(xì)胞，其在接觸靶細(xì)胞后分泌的效應(yīng)物主要是顆粒酶和穿孔素，二者所誘導(dǎo)的凋亡是細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫的主要途徑。PF主要是細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞生成，他使得目標(biāo)細(xì)胞滲透的壓力改變進(jìn)而使其死亡，抑或于PF共同作用而導(dǎo)致目標(biāo)的凋亡。GZMB則為CTL生成的物質(zhì)，其通過(guò)半胱天冬酶的活化來(lái)誘導(dǎo)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和病毒感染細(xì)胞的凋亡。但是，在誘導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，GZMB扮演更為重要的角色。既往的研究表明，CD107a存在于細(xì)胞毒性顆粒的膜中，其能夠以特異性抗原的形式來(lái)介導(dǎo)殺傷，CD107a主要與細(xì)胞毒性活性相關(guān)，是細(xì)胞毒性活性的敏感標(biāo)記[14-17]。本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一定濃度范圍的BVC誘導(dǎo)γδT細(xì)胞72 h后，PFP、GraB、CD107a的表達(dá)較對(duì)照組有一定程度的升高，并且在BVC的藥物濃度為40 nmol/L時(shí)，3種標(biāo)記的表達(dá)較為明顯。另外，我們通過(guò)乳酸脫氫酶法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在BVC的藥物濃度為40 nmol/L時(shí)，經(jīng)過(guò)BVC誘導(dǎo)后的免疫細(xì)胞消減人胃腺癌SGC-7901程度同樣到達(dá)最高峰。為此，我們推測(cè)BVC有可能通過(guò)升高γδT細(xì)胞PF、GZMB以及CD107a的表達(dá)進(jìn)而增強(qiáng)γδT細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性。

總而言之，在一定的濃度范圍，BVC使得γδT細(xì)胞增殖，增強(qiáng)γδT細(xì)胞對(duì)人胃腺癌SGC-7901消減，其機(jī)制考慮：PF、GZMB、CD107a的表達(dá)提高增強(qiáng)了γδT細(xì)胞的消減能力。另外，BVC之于人胃腺癌SGC-7901生長(zhǎng)具有抑制效果，這為今后BVC應(yīng)用于γδT免疫細(xì)胞治療胃癌提供了一定程度的參考意義和理論支撐。

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（2019-03-12收稿 責(zé)任編輯：芮莉莉）