夏萬松，夏 英,2，韋四喜，周春歡，杜 洪，袁 婷，金 泳，黃 ?！?/p>

(1.貴州醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗學院，貴州貴陽 550004；2.貴州中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，貴州貴陽 550001；3.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院臨床檢驗中心，貴州貴陽 550004；4.貴航貴陽醫(yī)院檢驗科，貴州貴陽 550009)

乙醛脫氫酶2(ALDH2)rs671單核苷酸多態(tài)性(SNP)被鑒定為活性純合ALDH2 rs671(GG)、非活性雜合ALDH2 rs671(GA)、非活性純合ALDH2 rs671(AA)[1]。ALDH2 rs671SNP存在于世界近十分之一人口中，是人類最常見的變異，約5.4億人攜帶ALDH2 rs671SNP[2]。攜帶ALDH2 rs671SNP的個體飲酒后會出現(xiàn)酒精代謝障礙的表現(xiàn)，如面部潮紅和心率增加[3-4]。重要的是ALDH2 rs671SNP除了會引起酒精反應外，還能影響某些藥物的代謝，危及攜帶者的健康。ALDH2 rs671SNP可增加胃癌、食管癌、上呼吸道鱗狀細胞癌的患病風險[5-9]。此外，ALDH2 rs671SNP與多種非癌癥疾病相關(guān)，是心肌梗死[10-11]、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)的危險因素[12]。ALDH2 rs671SNP也可以明顯增加髖部骨折風險[13]。然而，目前的研究較為局限，僅在DNA水平研究個體的ALDH2 rs671SNP與疾病的相關(guān)性，關(guān)于攜帶ALDH2 rs671SNP的個體ALDH2基因在信使RNA(mRNA)水平的改變研究尚比較少見。因此，本研究探討了ALDH2 rs671SNP的個體ALDH2基因在mRNA水平的改變，為進一步揭示ALDH2 rs671SNP影響人類健康的機制提供基礎。

1 資料與方法

1.1一般資料 將貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院體檢中心的48例體檢者作為研究對象，收集所有研究對象外周抗凝全血標本，其中男24例，女24例；年齡20～40歲。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 紅細胞裂解液購于北京索萊寶科技有限公司，DNA及總RNA提取試劑盒、TRIZOL reagent、DNA純化試劑盒購于生工生物工程(上海)股份有限公司，實驗所需引物合成及聚合酶鏈反應(PCR)產(chǎn)物測序也由生工生物工程(上海)股份有限公司完成，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購于TaKaRa公司，Taq DNA聚合酶購于美國Vazyme Biotech公司。ABI Pro FlexTM梯度PCR擴增儀購于賽默飛世爾科技(中國)有限公司，瓊脂糖水平電泳儀購自北京六一儀器廠，GeneGnome凝膠成像分析儀購自伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品(上海)有限公司。

1.3方法

1.3.1位置特異性引物設計 于美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫下載ALDH2基因的基本信息。設計上游引物671-F3734(位于內(nèi)含子11)和下游引物671-R165(位于內(nèi)含子12)可特異性擴增含ALDH2 rs671SNP位點的片段。設計上游引物F1455(位于外顯子11)和下游引物R1740(位于外顯子13)可特異性擴增含ALDH2 rs671SNP位點對應的互補脫氧核糖核酸(cDNA)的片段。所有引物序列如下，671-F3734：5′-GTCCTGGGAGTGTAACCCAT-3′；671-R165：5′-CCCAGCAGGTCCTGAACTTC-3′；F1455：5′-GGACAAGGCCAATTACCTGT-3′；R1740：5′-ATTCAGCACGCAAGGATCAT-3′。

1.3.2DNA及總RNA提取、總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA 根據(jù)紅細胞裂解液產(chǎn)品說明書裂解人外周抗凝全血紅細胞，分別用于提取DNA和總RNA。根據(jù)DNA和總RNA提取試劑盒說明書提取人外周抗凝全血白細胞 DNA和總RNA。取5 μg總RNA按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行反轉(zhuǎn)錄獲得第一鏈RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA。

1.3.3PCR擴增及測序 為了擴增位于外顯子12的ALDH2 rs671SNP位點，以上游引物671-F3734和下游引物671-R165進行PCR擴增可鑒定受試者的ALDH2 rs671SNP；以上游引物F1455和下游引物R1740進行PCR擴增可鑒定ALDH2 rs671SNP位點對應的cDNA序列。引物示意圖見圖1A。PCR體系(25 μL)：2×Green Taq Mix 12.5 μL，上下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)后72 ℃延伸4 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)濃度為1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳分離，根據(jù)DNA純化試劑盒說明書回收目的片段后進行測序。以DNA為模板的PCR產(chǎn)物用上游引物671-F3734進行測序，以cDNA為模板的PCR產(chǎn)物用上游引物F1455進行測序。

2 結(jié) 果

2.1PCR擴增白細胞的DNA和cDNA 用上游引物671-F3734和下游引物671-R165對白細胞的DNA進行PCR擴增的部分結(jié)果見圖1B。用上游引物F1455和下游引物R1740對白細胞的cDNA進行PCR擴增的部分結(jié)果見圖1C。

注：A為ALDH2 mRNA及引物示意圖，僅展示ALDH2變異體1(Variant，V1)的3′端的3個外顯子，?代表外顯子(E)，?下方的數(shù)字表示外顯子堿基對(bp)的長度，▼指示ALDH2 rs671SNP位點，→的位置表示引物的位置；B為PCR擴增白細胞的DNA瓊脂糖凝膠電泳部分結(jié)果；C為PCR擴增白細胞的cDNA瓊脂糖凝膠電泳部分結(jié)果。圖1 來自白細胞的DNA和cDNA PCR擴增產(chǎn)物電泳圖

2.2PCR產(chǎn)物測序的結(jié)果 用上游引物671-F3734和下游引物671-R165對白細胞的DNA進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化后用上游引物671-F3734進行Sanger測序的結(jié)果見圖2A，通過測序結(jié)果可鑒定受試者的ALDH2 rs671SNP。用上游引物F1455和下游引物R1740進行PCR擴增白細胞的cDNA，PCR產(chǎn)物純化后以上游引物F1455進行Sanger測序的結(jié)果見圖2B。在圖2A和圖2B中，當DNA在ALDH2 rs671SNP位點表現(xiàn)為雜合“GA”或純合“AA”時，cDNA在對應的位點表現(xiàn)為鳥苷(G)，顯示出DNA與cDNA測序結(jié)果不符的情況。

2.3ALDH2 rs671(GG、GA、AA)3種基因型的基因頻率和cDNA的表現(xiàn)型 48例受試者ALDH2 rs671(GG、GA、AA)3種基因型的基因頻率見圖3A。在所研究的人群中，基因型為ALDH2 rs671(GG)的基因頻率最高，基因型為ALDH2 rs671(AA)的基因頻率最低(僅發(fā)現(xiàn)1例)。對48例受試者ALDH2 rs671SNP位點對應的cDNA的核苷酸序列進行計算，cDNA均表現(xiàn)為“G”，結(jié)果見圖3B。

注：A為以白細胞的DNA進行PCR擴增后測序的結(jié)果，▼指示ALDH2 rs671SNP位點；B為以白細胞的cDNA進行PCR擴增后測序的結(jié)果，▼指示ALDH2 rs671SNP位點對應的cDNA的位點。圖2 配對DNA與cDNA的測序結(jié)果

注：A為ALDH2 rs671(GG、GA、AA)3種基因型的基因頻率；B為ALDH2 rs671(GG、GA、AA)3種基因型的cDNA表現(xiàn)型。圖3 ALDH2 rs671(GG、GA、AA)的基因頻率和cDNA的表現(xiàn)型

3 討 論

ALDH2蛋白質(zhì)是以四聚體的形式在體內(nèi)發(fā)揮催化功能，基因型為雜合ALDH2 rs671(GA)的個體，主要是ALDH2蛋白質(zhì)第504位谷氨酸→賴氨酸(504E→504K)的改變[14-15]。然而，這種改變會導致ALDH2蛋白質(zhì)四聚體的穩(wěn)定性下降，從而降低ALDH2蛋白質(zhì)對乙醛的催化活性[16-17]。本研究的受試者中，基因型表現(xiàn)為雜合ALDH2 rs671(GA)的19例受試者，ALDH2 rs671SNP位點對應的cDNA都表現(xiàn)為“G”，并未檢測到腺苷(A)(圖2B)，理論上ALDH2 mRNA翻譯出的蛋白質(zhì)并不會出現(xiàn)ALDH2(504E→504K)的改變。矛盾的是，LAI等[18]報道基因型為雜合ALDH2 rs671(GA)的個體ALDH2蛋白質(zhì)催化活性不到正?；钚缘?/2。因此，推測基因型表現(xiàn)為雜合ALDH2 rs671(GA)的受試者，ALDH2蛋白質(zhì)催化活性明顯降低并不完全是因為ALDH2(504E→504K)的改變。一種原因可能是僅ALDH2的等位基因(G)被轉(zhuǎn)錄，等位基因(A)不被轉(zhuǎn)錄，ALDH2 mRNA的量相對減少，造成ALDH2蛋白質(zhì)的量相對不足，導致機體對乙醛的代謝活性出現(xiàn)異常。盡管未檢測這些受試者ALDH2蛋白質(zhì)對乙醛的催化活性。對于基因型表現(xiàn)為雜合ALDH2 rs671(GA)的受試者，也許機體認為等位基因(A)對于機體是“不利的”，因此，不轉(zhuǎn)錄等位基因(A)，而僅轉(zhuǎn)錄等位基因(G)。

RNA編輯被定義為一種協(xié)同/轉(zhuǎn)錄后修飾機制，通過在RNA水平上插入、刪除或替換核苷酸，導致RNA序列與其模板DNA之間的差異來改變序列信息；這種修飾可以發(fā)生在編碼區(qū)，從而重新編碼氨基酸，具有典型的矯正功能；在哺乳動物中，由作用于RNA的腺苷脫氨酶(ADAR)催化的腺苷→肌苷(A→I)編輯是最常見的RNA編輯類型[19-20]。這種類型的RNA編輯在DNA水平表現(xiàn)為“A”，而對應的cDNA卻表現(xiàn)為“G”，DNA與cDNA測序時出現(xiàn)A→G不符的情況[21-22]。在進行蛋白質(zhì)翻譯時，由于I通常被識別為G，因此A→I編輯也稱為A→G編輯[23]。本研究中的48例受試者中基因型表現(xiàn)為罕見的純合ALDH2 rs671(AA)的受試者，ALDH2 rs671SNP位點對應的cDNA也表現(xiàn)為“G”(圖2B)，DNA與cDNA測序出現(xiàn)A→G不匹配。因此，推測基因型表現(xiàn)為罕見的純合ALDH2 rs671(AA)的個體ALDH2 mRNA發(fā)生了(A→G)RNA編輯。有研究表明，基因型表現(xiàn)為純合ALDH2 rs671(AA)時，ALDH2蛋白質(zhì)的催化活性僅為正?；钚缘?%～5%[24]。然而，通過RNA編輯這種轉(zhuǎn)錄后的修飾機制，可以使原本DNA水平上異常的純合ALDH2 rs671(AA)在RNA水平矯正為正常的“G”，這是RNA編輯典型的矯正功能，在進化上也是一種非常好的現(xiàn)象。

4 結(jié) 論

48例受試者中，19例基因型表現(xiàn)為雜合ALDH2 rs671(GA)的個體，ALDH2 rs671SNP位點對應的cDNA都表現(xiàn)為“G”，基因型表現(xiàn)為罕見的純合ALDH2 rs671(AA)的個體，ALDH2 mRNA發(fā)生(A→G)RNA編輯，這些結(jié)果為ALDH2 rs671SNP如何影響人類健康的機制提供了新的見解。