祝娃娃 王健達 張險峰 俞靈鶯

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是由于動脈內膜在早期局部損傷后，膽固醇尤其是氧化低密度脂蛋白（oxidized-low density lipoprotein，ox-LDL） 引起血管壁脂質堆積，進而導致動脈內膜纖維組織增生以及內膜增厚，最后形成動脈粥樣斑塊[1-2]。細胞內膽固醇酯主要受清道夫受體和膽固醇逆轉錄蛋白調節(jié)[3]。膽固醇逆轉錄蛋白如腺苷三磷酸結合盒轉運體A-1（ABCA-1）和腺苷三磷酸結合盒轉運體G-1（ABCG-1）在游離膽固醇流出中起主要作用[4-6]。ABCA-1和ABCG-1協(xié)同作用維持細胞內膽固醇攝取和流出的動態(tài)平衡，阻止脂質在細胞內蓄積繼而泡沫化[7]。

Humanin（HN）是一種內源性抗細胞凋亡多肽，2001年首次在阿爾茨海默病患者大腦中發(fā)現，在許多細胞里起抗氧化、細胞保護、抗炎癥的作用[8-9]。[Gly14]-humanin（HNG）是HN肽鏈第14位氨基酸甘氨酸取代色氨酸形成的，與HN相比，在阿爾茨海默病患者中其細胞保護活性提高了將近1 000倍[10]。本課題組前期研究表明外源性給予HNG可以通過抑制脂質攝取從而減少ox-LDL在人臍靜脈內皮細胞（HUVECs）的聚集[11]，然而HNG對內皮細胞脂質外排的具體機制還有待進一步研究。因此本研究擬探討HNG對ox-LDL誘導的內皮細胞膽固醇外排的作用，進而闡明在HUVECs中HNG對ABCA-1和ABCG-1蛋白表達的影響。

1 材料和方法

1.1 材料 HUVECs購自上海凱基生物有限公司。

1.2 主要試劑及儀器 HNG購自美國Sigma-Aldrich公司；ox-LDL購自中國奕源生物公司；ABCA-1兔單克隆抗體購自英國Abcam公司；ABCG-1兔單克隆抗體購自美國Immunoway公司；凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司；酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國Tecan公司Infinite 200。Power PAC2000電泳儀購自美國Bio-Rad公司；垂直電泳槽、轉移電泳槽均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞復蘇 取出HUVECs細胞凍存管迅速置于37℃的水浴鍋中持續(xù)快速振蕩使細胞融化；先吸取5 ml DMEM培養(yǎng)基，再快速從凍存管吸取2 ml細胞液，置于15 ml離心管中，1 200 r/min離心5 min，吸出上清液，加入含10%小牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基5 ml中，混勻后將細胞懸液加入細胞培養(yǎng)皿中，吹打均勻，置于37℃、含5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.2 細胞傳代 從培養(yǎng)箱中取出貼壁生長近100%的細胞，吸出上清液，加入1.0 ml的0.25%Trypsin，靜置1 min，至細胞觸角開始回縮；吸去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基混勻，以1∶4種入新的培養(yǎng)皿，最后放置37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.3.3 HUVECs細胞分組與處理 將對數生長期的HUVECs細胞接種于6孔板中并隨機分組，其中采用ox-LDL 處理的5組：0 μg/ml ox-LDL組、30 μg/ml ox-LDL組、60 μg/ml ox-LDL 組、90 μg/ml ox-LDL 組、120 μg/ml ox-LDL組；采用HNG處理的5組：0 nM HNG組、50 nM HNG 組、100 nM HNG 組、1 μM HNG 組、10 μM HNG組；聯(lián)合用藥處理的5組：空白組、ox-LDL組、ox-LDL+100 nM HNG 組、ox-LDL+1 μM HNG 組、ox-LDL+10 μM HNG組，分別使用不同濃度的HNG預處理HUVECs細胞1 h，隨之加入60 μg/ml ox-LDL；經培養(yǎng)及不同藥物濃度作用12 h后收集細胞樣品。另設HNG作用不同時間 5組：0 h HNG 組、3 h HNG 組、6 h HNG 組、12 h HNG組、24 h HNG組，將1 μM的HNG按上述時間處理細胞后再收集細胞樣品。

1.3.4 ABCA-1、ABCG-1蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。用預冷的PBS洗滌HUVECs細胞2次以上，加入100 μl的RIPA細胞裂解液，4℃、13 200 r/min離心15 min，取上清液，進行蛋白質定量后，常規(guī)進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，上樣量為50 μg，轉膜、封閉后轉印至膜，加入兔單克隆抗體ABCA-1或兔單克隆抗體ABCG-1和β-actin作為一抗，4℃孵育過夜后，加入與一抗所相對應的二抗，ECL化學發(fā)光，分析條帶的灰度值并與各自的內參β-actin的比值來判斷目的蛋白的表達水平。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0和GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同濃度ox-LDL處理后ABCA-1、ABCG-1蛋白表達水平比較 與 0 μg/ml ox-LDL 組相比，60、90、120 μg/ml ox-LDL組ABCA-1、ABCG-1蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖1和表1。

圖1 不同濃度氧化低密度指蛋白（ox-LDL）處理后腺苷三磷酸結合盒轉運體A-1（ABCA-1）、腺苷三磷酸結合盒轉運體G-1（ABCG-1）蛋白表達的電泳圖（a：ABCA-1蛋白；b：ABCG-1蛋白）

表1 不同濃度ox-LDL處理后ABCA-1、ABCG-1蛋白表達水平比較

2.2 不同濃度HNG處理后ABCA-1、ABCG-1蛋白表達水平比較 與0 nM HNG組相比，1、10 μM HNG組ABCA-1、ABCG-1蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖2和表2。

2.3 不同時間HNG處理后ABCA-1、ABCG-1蛋白表達水平比較 與0 h HNG組相比，12、24 h HNG組ABCA-1、ABCG-1蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖3和表3。

2.4 HNG與ox-LDL聯(lián)合處理后ABCA-1和ABCG-1蛋白表達水平比較 與空白組比較，ox-LDL組ABCA-1、ABCG-1蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均 P＜0.05）；而與 ox-LDL 組相比，ox-LDL+1 μM HNG 組、ox-LDL+10 μM HNG 組 ABCA-1、ABCG-1 蛋白表達水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖 4 和表 4。

圖2 不同濃度[Gly14]-humanin（HNG）處理后腺苷三磷酸結合盒轉運體A-1（ABCA-1）、腺苷三磷酸結合盒轉運體G-1（ABCG-1）蛋白表達的電泳圖（a：ABCA-1蛋白；b：ABCG-1蛋白）

表2 不同濃度HNG處理后ABCA-1和ABCG-1蛋白表達水平比較

圖3 不同時間[Gly14]-humanin（HNG）處理后腺苷三磷酸結合盒轉運體A-1（ABCA-1）、腺苷三磷酸結合盒轉運體 G-1（ABCG-1）蛋白表達的電泳圖（a：ABCA-1蛋白；b：ABCG-1蛋白）

3 討論

動脈內膜下沉積過量的膽固醇尤其是ox-LDL并逐漸形成泡沫細胞是動脈粥樣硬化的主要特征，ox-LDL是慢性冠脈疾病的重要危險因子，是導致動脈粥樣斑塊形成和斑塊不穩(wěn)定性重要原因[12-13]。血液中的ox-LDL逐漸被酯化、處理、儲存和聚集成細胞脂質滴沉積在血管內膜下，從而導致泡沫細胞形成[14]。ox-LDL濃度與動脈粥樣硬化進程呈正相關，是引起動脈粥樣硬化最危險的因子[15]。清道夫受體介導的ox-LDL的攝取和逆轉錄受體介導的膽固醇外排是調節(jié)脂質代謝平衡兩條關鍵途徑[16]。他汀類藥物可通過抑制TC和LDL水平而降低血脂及穩(wěn)定斑塊等起到抗動脈粥樣硬化的重要作用，但長期使用該類藥物會引起肝毒性和肌溶癥等不良反應而影響它的臨床應用。而積極尋找一種新的毒性低、療效好的降脂藥物可能對動脈粥樣硬化的治療很有應用前景。

表3 不同時間HNG處理后ABCA-1、ABCG-1蛋白表達水平比較

圖4 [Gly14]-humanin（HNG）與氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）聯(lián)合處理后腺苷三磷酸結合盒轉運體A-1（ABCA-1）和腺苷三磷酸結合盒轉運體 G-1（ABCG-1）蛋白表達的電泳圖（a：ABCA-1蛋白；b：ABCG-1蛋白）

表4 HNG與ox-LDL聯(lián)合處理后ABCA-1和ABCG-1蛋白表達水平比較

HN是一種由24個氨基酸所組成的抗凋亡多肽，能夠對抗由淀粉樣蛋白D所誘導的神經細胞凋亡[17]。HN也參與了動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，在動脈粥樣硬化患者頸動脈脂質斑塊及人類血管內皮細胞和中均發(fā)現有HN的表達[18]。研究表明，使用HNG干預高脂飲食誘導的小鼠后，可增加肝微粒體甘油三酯轉移蛋白（MTTP）的表達并促進肝臟TG的分泌，而顯著降低小鼠體內肝TG的蓄積[19]。筆者前期研究發(fā)現，HNG通過抑制植物凝集素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1（LOX-1）入胞，減少ox-LDL在血管內皮細胞的聚集[11]。然而，HNG對內皮細胞脂質外排的具體機制還有待進一步的研究。

細胞內膽固醇從血管壁外排到細胞外的受體，主要包括ABCA-1和ABCG-1受體[3]。ABCA-1是膽固醇外排最重要的逆轉錄受體，在人和動物中，ABCA-1對動脈粥樣硬化的保護起到了關鍵的作用，敲減ABCA-1基因會增加細胞內膽固醇的聚集[20]。此外，許多種具有抗動脈粥樣硬化作用的藥物，例如槲皮素、Apelin-13及大蒜提取主要成S-烯丙基半胱氨酸等都能增加ABCA-1的表達，而促進巨噬細胞膽固醇的流出[21-23]。除了ABCA-1對脂質外排的重要作用外，逆轉錄受體ABCG-1在膽固醇逆轉錄中也發(fā)揮重要作用。以往研究顯示多種物質包括桉樹酚（在茶和草本的一個小芳香化合物）和巖藻甾醇（海藻中豐富的膽固醇）可通過激活肝臟X受體（LXR）和類視黃醛受體（RXR）而增加ABCG-1的表達[24-25]。ABCG-1基因敲除后可明顯減少巨噬細胞逆轉錄的作用，而增加ABCG-1的表達后可顯著促進巨噬細胞膽固醇的外排進而抑制泡沫細胞的形成[26]。

綜上所述，ABCA-1和ABCG-1在膽固醇外流起著關鍵作用。筆者在本實驗中，通過Western blot法檢測ABCA-1和ABCG-1蛋白的表達。在ox-LDL誘導下，隨著ox-LDL濃度的增加，ABCA-1和ABCG-1蛋白的表達逐漸增加。而HNG單獨處理后，ABCA-1和ABCG-1的蛋白表達隨著濃度和時間的增加而逐漸增加，表明HNG單獨處理可以促進HUVECs細胞脂質的外排。最后，HNG與ox-LDL聯(lián)合作用后，HUVECs細胞ABCA-1和ABCG-1的蛋白表達比ox-LDL單獨處理后的表達量顯著增加?？傊抵委熞呀洷蛔C實能夠降低臨床事件的發(fā)生，HNG在HUVEC內皮細胞的保護作用中，為我們提供了新的見解。HNG有減少內皮細胞脂質蓄積的作用，可能成為預防動脈粥樣硬化發(fā)展新的合適研究藥物。