常 江,張曉樂,余 華,陳 杰,李俊玲

1.陜西省中醫(yī)醫(yī)院腦病科 (西安710003) ;2.西安市中醫(yī)醫(yī)院婦科(西安710021)

蛛網(wǎng)膜下腔出血(Subarachnoid hemorrhage，SAH)是腦卒中的一種重要類型，大大增加了患者死亡和致殘的風險[1-3]。研究證實，早期腦水腫可能是SAH患者腦神經(jīng)功能癥狀加劇或死亡的關(guān)鍵因素[4]。研究表明，抗炎可以減輕實驗性SAH后的早期腦水腫[5-7]，提示抑制SAH后炎癥反應(yīng)可能是緩解SAH后腦水腫及腦損傷的重要策略。絞股藍總皂苷(Gypenosides)是從葫蘆科植物絞股藍中提得的達瑪烷型皂苷，為絞股藍的重要成分[8-9]。絞股藍總皂苷具有顯著的抗炎效果，可緩解脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)和認知功能障礙[10-11]。在局灶性腦中風模型中，絞股藍總皂苷可減輕大鼠神經(jīng)元的DNA損傷并促進腦室下區(qū)的神經(jīng)干細胞增殖[12]。因此，本研究擬采用血管內(nèi)穿刺法建立大鼠SAH模型，探討絞股藍總皂苷對蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦水腫和神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響。

材料與方法

1 主要材料及設(shè)備 絞股藍總皂苷購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W(xué)試劑公司；蛋白提取試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；Nrf2抗體購自美國Abcam公司；β-actin內(nèi)參抗體購自美國Santa Cruz公司；大鼠促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA檢測試劑盒由武漢博士德生物工程有限公司提供；TUNEL凋亡檢測試劑盒由美國Roche公司提供；Evans blue染色試劑購自美國Sigma公司。

2 SAH模型的建立 正常大鼠用10%水合氯醛(2.5 ml/kg)腹腔注射后，做一正中頸部切口。按順序清晰顯露右側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈、頸外動脈后，4-0尼龍線頭經(jīng)頸外動脈置入右頸內(nèi)動脈，刺破大腦前動脈和大腦中動脈的分叉處，形成蛛網(wǎng)膜下出血[13-14]。

3 實驗分組 體重230～250 g雄性SD大鼠總計96只，購自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。將其分為四組(n=24)，包括假手術(shù)對照組(Sham組)、蛛網(wǎng)膜下腔出血組(SAH組)、絞股藍總皂苷200 mg/(kg·d)組(GP1組)、絞股藍總皂苷400 mg/(kg·d)組(GP2組)。Sham組尼龍線不損傷血管壁；SAH組大鼠按照上述方法建立SAH模型；GP1和GP2組大鼠每日口飼絞股藍總皂苷溶液(溶于無菌生理鹽水)200或400 mg/kg共7 d[15]，之后建立SAH模型。

4 腦組織水含量和Evans blue外滲率檢測 參照文獻[13]測量大腦組織水含量。每組取大鼠6只，模型建立后24 h用過量戊巴比妥鈉(150 mg/kg)處死大鼠取腦，即刻稱得濕重。后再把標本放于100℃的烘箱中，72 h后稱重(干重)。腦組織水含量=([濕重-干重] /濕重)×100%。參照文獻[16]行Evans blue染色以評估血腦屏障損壞的程度。模型建立后24 h將2%Evans blue溶液(4 ml/kg)注入腹腔,3 h后用100 ml冰PBS液灌注大鼠，之后取出受損大腦右半球。把這些大腦半球樣本在PBS中勻漿并離心(30 min,15000 g,4℃)，回收上清液。取0.5 ml樣本與等量50%三氯乙酸混勻，在4℃下過夜反應(yīng)后離心(30 min，15000 g，4℃)。最后，Evans blue染色值于分光光度計的610 nm處測得，單位以μg/g表示。

5 Western blot檢測和ELISA檢測 每組取大鼠6只，模型建立后24 h，過量戊巴比妥鈉(150 mg/kg)處死大鼠取腦，加入RIPA裂解液充分裂解。離心后將樣本上清均分，一份用于Western blot檢測Nrf2蛋白表達水平，另一份用于ELISA法檢測腦組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素6(IL-6)和白細胞介素1β(IL-1β)含量。Western blot檢測：10%凝膠電泳后將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%BSA封閉后，加入抗β-actin抗體(1∶500)或抗Nrf2抗體(1∶1000)，4 ℃孵育過夜。第2天，使用HRP標記二抗室溫孵育PVDF膜0.5 h，用ECL顯影液反應(yīng)并曝光，用Quantity one軟件分析條帶灰度值。ELISA檢測：根據(jù)廠家說明書，先后加入生物素化抗體工作液、酶結(jié)合工作液、顯色劑及終止液，用分光光度計在450 nm處測得吸光度值，并根據(jù)標準曲線定量。

6 TUNEL凋亡檢測 每組大鼠6只，模型建立24 h后用心臟灌注大鼠，取大腦組織于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，常規(guī)石蠟包埋后使用切片機將腦組織切成5 μm厚的切片。使用TUNEL凋亡染色試劑盒檢測腦組織石蠟包埋切片的凋亡細胞數(shù)。用PBS洗滌后，加入rTdT反應(yīng)混合物于4℃過夜。PBS中漂洗后將切片與辣根過氧化物酶(稀釋比例1∶500)室溫下反應(yīng)0.5 h。之后于室溫下加入DAB溶液處理10 min。最后，切片在乙醇分級脫水和二甲苯透明后于光鏡下(200×)計數(shù)，TUNEL陽性細胞細胞核呈現(xiàn)暗褐色。

結(jié) 果

1 四組大鼠SAH后腦組織水含量及Evans blue外滲率比較 見表1。SAH組大鼠腦水含量明顯高于Sham組(P<0.05)，而GP1和GP2組大鼠腦水含量明顯降低(P<0.05)；同時，GP2組大鼠腦含水量低于GP1組(P<0.05)。SAH組損傷半球Evans blue外滲率明顯高于Sham組(P<0.05)，而GP1和GP2組大鼠的外滲率明顯降低(P<0.05)；與GP1組比較，GP2組受損腦半球Evans blue外滲率明顯降低(P>0.05)。

表1 蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦水含量和Evans blue外滲率比較

2 四組大鼠SAH后腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β含量比較 見表2。SAH組大鼠腦組織炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量明顯較Sham組增加(P<0.05)；而GP1和GP2組大鼠腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β含量較SAH組減低(P<0.05)；GP2組腦組織IL-6含量較GP1組減低(P<0.05)。

表2 四組大鼠SAH后腦組織TNF-α、IL-6、IL-1β含量比較(ng/mg)

3 四組大鼠SAH后腦凋亡細胞數(shù)量和Nrf2蛋白表達水平比較 見表3(圖1、2)。

注：與Sham組比較，*P<0.05；與SAH組比較，△P<0.05；與GP1組比較，#P<0.05

注：與Sham組比較，*P<0.05；與SAH組比較，△P<0.05；與GP1組比較，#P<0.05

表3 蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦組織凋亡細胞數(shù)量和Nrf2蛋白表達水平比較

可見，SAH組大鼠腦TUNEL陽性細胞數(shù)比Sham組明顯增加(P<0.05)；而GP1和GP2組大鼠腦TUNEL陽性細胞數(shù)顯著較少(P<0.05)；與GP1組比較，GP2組腦TUNEL陽性凋亡細胞更少(P<0.05)。SAH組大鼠腦Nrf2蛋白比Sham組明顯下調(diào)(P<0.05)；與SAH組比較，GP1和GP2組腦Nrf2蛋白明顯增加(P<0.05)。

討 論

本研究探討了絞股藍總皂苷在SAH后早期腦損傷中的抗腦水腫和抗炎作用。結(jié)果顯示，不同劑量的外源性絞股藍總皂苷可減輕SAH大鼠的腦水腫，保持血腦屏障完整性，顯著下調(diào)炎癥因子含量并減少細胞凋亡。這就提示，絞股藍總皂苷預(yù)處理可能是預(yù)防或緩解SAH患者早期腦損傷的有效替代療法。

腦水腫是蛛網(wǎng)膜下腔出血后的重要早期病理生理改變，也是導(dǎo)致SAH患者神經(jīng)功能障礙的重要因素[4]。而神經(jīng)炎癥反應(yīng)可導(dǎo)致神經(jīng)元細胞功能損傷和線粒體功能異常，是SAH后腦水腫發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵機制[17]。本研究采用經(jīng)典血管內(nèi)穿刺法建立了大鼠SAH模型，結(jié)果顯示，SAH后大鼠腦水含量和Evans blue外滲率顯著增加，細胞凋亡加重，受損腦皮質(zhì)中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β含量明顯增加，驗證了SAH后腦水腫、血腦屏障破壞、細胞凋亡及神經(jīng)炎癥反應(yīng)加重的病理生理過程。

已有研究表明，絞股藍總皂苷在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中具有抗炎作用[10]。本研究進一步證實，絞股藍總皂苷預(yù)處理可顯著緩解SAH后促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β等促炎因子的表達。而SAH后這些促炎因子可加重血腦屏障的破壞、細胞凋亡及血管損傷，進而誘發(fā)腦水腫和神經(jīng)功能損傷[18]。本研究結(jié)果顯示，絞股藍總皂苷預(yù)處理可減輕SAH后大鼠血腦屏障破壞和細胞凋亡。這就提示，絞股藍總皂苷對SAH大鼠的神經(jīng)保護作用可能與其抗神經(jīng)炎癥反應(yīng)作用密切相關(guān)。

體外細胞研究已表明，絞股藍總皂苷預(yù)處理比后處理具有更強的神經(jīng)保護作用[19]。在急性全腦缺血模型中，絞股藍總皂苷預(yù)處理已被證實可減少大鼠神經(jīng)元DNA損傷[20]。在局灶性腦缺血模型中發(fā)現(xiàn)，絞股藍總皂苷預(yù)處理不僅可緩解腦急性缺血再灌注損傷，還能促進腦室下區(qū)的神經(jīng)再生[12]。與之一致，本研究結(jié)果表明，絞股藍總皂苷預(yù)處理能有效緩解SAH后出現(xiàn)的腦水腫和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，說明絞股藍總皂苷對于SAH具有潛在的預(yù)防作用。

轉(zhuǎn)錄因子Nrf2激活可有效減輕SAH后出現(xiàn)的腦損傷[21]。其作用機制可能與有效阻斷細胞氧化應(yīng)激及炎癥相關(guān)信號通路相關(guān)[22]。已有研究證實，絞股藍總皂苷的腦保護和抗凋亡作用與Nrf2的激活密切相關(guān)。而本研究結(jié)果顯示絞股藍總皂苷預(yù)處理可顯著上調(diào)SAH后腦Nrf2的表達，提示SAH后絞股藍總皂苷的神經(jīng)保護作用可能與Nrf2激活相關(guān)。

綜上所述，絞股藍總皂苷預(yù)處理可通過激活Nrf2信號通路減輕蛛網(wǎng)膜下腔出血造成的腦損傷和神經(jīng)炎癥反應(yīng)。