張菊根，吳振啟

作者單位：復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院泌尿科，上海201799

膀胱癌是泌尿科的常見(jiàn)惡性腫瘤，多數(shù)為上皮細(xì)胞癌，由于起病較為隱匿，早期診斷仍較為困難。微小核糖核酸（miRNAs）是一類具有重要生物學(xué)功能的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA，具有癌基因和抑癌基因的類似作用，參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，在腫瘤的診斷，預(yù)后判斷和靶向治療具有重要意義［1-2］。目前miRNAs在膀胱癌的研究主要集中在組織標(biāo)本或者血液標(biāo)本，而對(duì)尿液的研究較少。有研究表明尿液中的miR-375 可作為膀胱癌的診斷和監(jiān)測(cè)復(fù)發(fā)［3］，而尿液miR-145 表達(dá)也可以作為膀胱癌的診斷和預(yù)后判斷的指標(biāo)［4］，但尿液聯(lián)合檢測(cè)miR-375和miR-145-5p 是否能夠提高膀胱癌診斷和預(yù)后的效能，未見(jiàn)報(bào)道。本組研究通過(guò)采集膀胱癌病人的尿液檢測(cè)miRNA-375和miR-145-5p水平，觀察其在膀胱癌發(fā)生發(fā)展，診斷和預(yù)后中的臨床價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2012年1月至2016年1月在復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院青浦分院就診確診為膀胱癌的病人112 例，為膀胱癌組。其中男64 例，女48例，年齡（63.24±10.61）歲，年齡范圍為37～79 歲，腫瘤部位：膀胱底51 例，膀胱體37 例和三角區(qū)24 例；腫瘤分期：Ta-T139 例，T2-T473 例。選擇同期在我院行健康體檢者45 例，為健康對(duì)照組，男24 例，女21例，年齡（62.92±9.16）歲，年齡范圍為38～79 歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：所有病人均經(jīng)病理學(xué)確診為膀胱癌；所有病人或其近親屬均簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：嚴(yán)重的心肝腎等重要臟器功能障礙；其他惡性腫瘤，免疫性疾病和血液性疾病；精神性和智力性疾病影響隨訪；術(shù)前右化療，放療和靶向治療；有泌尿系統(tǒng)其它疾病如結(jié)石，感染等；病人資料不完整。兩組在年齡和性別等一般資料無(wú)明顯差別，具有可比性。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 方法

1.2.1 尿液標(biāo)本的保存 病人入院時(shí)，禁飲食12 h后收集中后段尿液100 mL，放置在低溫冰箱中保存，并在2 h內(nèi)予以離心，離心速度3 000 r/min，時(shí)間30 min，并分裝在RNA 酶處理過(guò)的Eppendorf 管中，保存在-80 ℃的冰箱中。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量PCR 根據(jù)Trizol 說(shuō)明書(shū)，取尿液上清液用紫外光光度計(jì)分別檢測(cè)在230 nm，260 nm和280 nm 處的吸收值。實(shí)驗(yàn)采用Primer Premier 5.0 軟件涉及引物。miRNA-375 引物序列，正向5′-TTTGTTCGTTCGGCTCGC-3′，反向 5′-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′；miR-145-5p 的引物序列，正向 5′-GTCCAGTTTTCCCAGGAATC-3′，反向 5′-AGAACAGTATTTCCAGGAAT-3′；U6 引物序列，正向 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反向 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。使用 20 μL 的 cDNA的合成反應(yīng)體系，使用PCR 擴(kuò)增儀，分別在26 ℃，42 ℃和85 ℃的溫度下，分別反應(yīng)30 min，30 min 和10 min。最后將引物，定量PCR Master Mix，Taq DNA 聚合酶和 cDNA 模板加入 ddH2O 中形成 20μL的反應(yīng)體系。反應(yīng)過(guò)程：分別在95 ℃，95 ℃和60 ℃，分別反應(yīng)時(shí)間3 min，12 s和40 s，總共40個(gè)循環(huán)。以 U6 為內(nèi)參，測(cè)定 CT 值。采用 2-△△CT表示miRNA-375和miR-145-5p相對(duì)表達(dá)量，其中△△CT＝膀胱癌組（CT目的基因-CTU6）-健康對(duì)照組（CT目的基因-CTU6）。每個(gè)樣本重復(fù)3次。

1.2.3 觀察指標(biāo) 觀察膀胱癌組和健康對(duì)照組尿液miRNA-375和miR-145-5p水平的差異，膀胱癌病人尿液miRNA-375 和miR-145-5p 表達(dá)水平術(shù)前術(shù)后變化，與臨床指標(biāo)和預(yù)后的關(guān)系，及其在診斷膀胱癌和判斷其預(yù)后的靈敏度和特異度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 21.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用表示，多組比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q比較，兩組比較采用t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用率表示，率的比較采用χ2檢驗(yàn)。采用logistic二元回歸分析得出尿液miRNA-375和miR-145-5p水平聯(lián)合變量檢測(cè)膀胱癌和預(yù)后發(fā)生情況。用MedCalc 軟件包繪制出受試者曲線（ROC）評(píng)價(jià)診斷和預(yù)后的靈敏度和特異度。P＜0.05 視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)的比較 從表1 和圖1 可知，膀胱癌組尿液miRNA-375表達(dá)明顯高于健康對(duì)照組（P＜0.01），術(shù)后較術(shù)前明顯降低（P＜0.01），而miR-145-5p的表達(dá)明顯低于健康對(duì)照組（P＜0.01），術(shù)后較術(shù)前明顯升高（P＜0.01）。

表1 膀胱癌112例與健康體檢者45例尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)的比較/

表1 膀胱癌112例與健康體檢者45例尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)的比較/

組別健康對(duì)照組膀胱癌組術(shù)前術(shù)后例數(shù)45 miRNA-375/（2-ΔΔCT）2.30±0.54 miR-145-5p/（2-ΔΔCT）2.68±0.61 112 112 3.95±1.26 2.43±1.08 1.48±0.75 2.56±0.67

圖1 各組尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)的比較

2.2 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)在診斷膀胱癌的效能 從表2 和圖2 可知，尿液miRNA-375和miR-145-5p 表達(dá)在診斷膀胱癌具有較高的靈敏度和特異度，將尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平進(jìn)行回歸的方程2.678XmiRNA-375-2.617XmiR-145-5p-0.996，聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度87.5%，特異度93.3%，其曲線下面積明顯高于 miRNA-375（z＝2.316，P＝0.021）和 miR-145-5p（z＝2.727，P＝0.006）單獨(dú)檢測(cè)，而miRNA-375 和miR-145-5p 之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（z＝0.921，P＞0.05）。

2.3 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系 從表3可知尿液miRNA-375和miR-145-5p 表達(dá)水平與性別、年齡、腫瘤部位和腫瘤分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)性（P＞0.05），而與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤數(shù)目具有明顯相關(guān)性（P＜0.01）。

表2 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)在診斷膀胱癌的效能

圖2 聯(lián)合檢測(cè)曲線下面積在診斷膀胱癌的效能

2.4 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系 膀胱癌病人隨訪3年，出現(xiàn)23例死亡，89 例存活，死亡組的miRNA-375 表達(dá)水平明顯高于存活組（P＜0.01），而miR-145-5p表達(dá)水平明顯低于存活組（P＜0.01）。見(jiàn)表4。

表4 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系/

表4 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平與膀胱癌預(yù)后的關(guān)系/

miR-145-5p 0.78±0.36 1.66±0.72 5.668 0.000例數(shù)23 89組別死亡組存活組t 值P 值miRNA-375 5.49±1.42 3.55±0.84 8.431 0.000

2.5 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平在預(yù)測(cè)3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的效能 從表5和圖3可知，尿液miRNA-375表達(dá)水平在預(yù)測(cè)膀胱癌3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的靈敏度為78.3%，特異度95.5%，其曲線下面積為0.891；而尿液miR-145-5p 表達(dá)水平在預(yù)測(cè)膀胱癌3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的靈敏度為95.7%，特異度為70.8%，曲線下面積為0.856。兩者聯(lián)合檢測(cè)并不能提高預(yù)測(cè)3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的診斷效能。

3 討論

MicroRNAs 是20 個(gè)核苷酸左右的非編碼單鏈RNA，至今至少發(fā)現(xiàn)超過(guò)1 000 種以上的miRNA 參與了30%以上的基因調(diào)控，并在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平進(jìn)行調(diào)控?，F(xiàn)有的研究證實(shí)miRNA 具有很強(qiáng)的組織和細(xì)胞特異度，一旦出現(xiàn)異常，對(duì)疾病的診斷和預(yù)后的判斷具有重要價(jià)值［5］。檢測(cè)miRNA 的標(biāo)本可以是組織，血液和尿液，而尿路上皮癌選擇尿液具有明顯的優(yōu)勢(shì)［6］，由于尿液與腫瘤組織直接接觸，腫瘤細(xì)胞和及其釋放細(xì)胞因子在尿液中有著不同程度表達(dá)，并且標(biāo)本易得，miRNA 在尿液中的穩(wěn)定性高于血液和組織標(biāo)本；尿液的pH 值對(duì)miRNA 影響很小，其室溫下放置72 h甚至反復(fù)凍融7次，尿液的miRNA變化依然不大［7］，故運(yùn)用于臨床miRNA的檢測(cè)具有較高的臨床檢測(cè)價(jià)值。

表3 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系/

表3 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平與臨床指標(biāo)的關(guān)系/

例數(shù)miRNA-375/（2-ΔΔCT）miR-145-5p/（2-ΔΔCT）臨床指標(biāo)性別t（F）值0.083男女年齡64 48 3.96±1.30 3.94±1.21 P值0.934 t（F）值1.476 P值0.143 1.39±0.71 1.60±0.79 1.503＜65 歲≥65 歲腫瘤部位膀胱底膀胱體三角區(qū)腫瘤分級(jí)高級(jí)別低級(jí)別腫瘤分期Ta～T1 T2～T4淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移47 65 4.16±1.21 3.80±1.28 0.1360.7660.445 1.42±0.69 1.53±0.79（1.734）51 37 24 4.06±1.22 3.64±1.11 4.19±1.50 0.170（0.287）0.752 1.45±0.70 1.46±0.76 1.58±0.85 0.418 55 57 4.00±1.21 3.90±1.32 0.6770.9840.327 1.41±0.70 1.55±0.80 9.777 39 73 2.78±0.57 4.58±1.07 0.00014.6170.000 2.31±0.37 1.04±0.47 11.975是 否51 61 4.98±1.03 3.09±0.62腫瘤數(shù)目單發(fā)多發(fā)0.00016.2030.000 0.80±0.34 2.06±0.46 12.071 62 50 3.10±0.62 5.00±1.03 0.00016.4070.000 2.05±0.46 0.78±0.33

表5 尿液miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)水平在預(yù)測(cè)3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的效能

圖3 預(yù)測(cè)膀胱癌3年內(nèi)出現(xiàn)死亡的ROC曲線下面積的比較

miRNA-375 最早發(fā)現(xiàn)在哺乳動(dòng)物β 細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，作用于胰腺小島，通過(guò)血糖激素水平的變化來(lái)調(diào)整胰島素的分泌［8］。隨后發(fā)現(xiàn)miRNA-375在各種器官和組織均有表達(dá)，是一種多功能的miRNA，與胰島細(xì)胞，肺表面活性物質(zhì)分泌，黏膜免疫和腫瘤的發(fā)生發(fā)展均具有重要意義。miRNA-375 在不同的腫瘤表達(dá)不同，在胃癌的研究中發(fā)現(xiàn)，胃癌組織miRNA-375 表達(dá)明顯低于胃正常組織，并對(duì)胃癌細(xì)胞的增殖和遷移具有明顯的抑制作用［9］。同樣在結(jié)腸癌的miRNA-375表達(dá)明顯低于結(jié)腸正常組織，并且發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miRNA-375 基因到結(jié)腸癌細(xì)胞后能夠明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖和遷移，具有明顯抑制癌作用［10］；在前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)miRNA-375存高表達(dá)，明顯高于健康對(duì)照組，并且與前列腺癌臨床病理特征具有明顯的相關(guān)性，具有明顯促癌作用［11］。本組研究表明膀胱癌病人尿液中miRNA-375 表達(dá)明顯高于對(duì)照組，手術(shù)后病人尿液中的miRNA-375 水平出現(xiàn)明顯降低，并且發(fā)現(xiàn)與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤數(shù)目具有明顯相關(guān)性，說(shuō)明miRNA-375 參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，并且發(fā)現(xiàn)miRNA-375 與膀胱癌的腫瘤分期具有明顯相關(guān)性。本組研究還發(fā)現(xiàn)在診斷膀胱癌方面具有較高的診斷效能，具有較高的靈敏度和特異度。并且隨訪3年發(fā)現(xiàn)存活組病人尿液miRNA-375表達(dá)水平明顯低于死亡組，并發(fā)現(xiàn)尿液miRNA-375表達(dá)在預(yù)測(cè)3年內(nèi)出現(xiàn)死亡具有較高的特異度和靈敏度，故當(dāng)尿液中miRNA-375表達(dá)＞4.829，其出現(xiàn)3年內(nèi)死亡的可能性明顯增加，故這部分病人是否采取進(jìn)一步的干預(yù)措施，以降低膀胱癌病人的3年內(nèi)死亡率。

miR-145-5p 在多種腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)表達(dá)失調(diào)，并作為腫瘤的抑制基因調(diào)節(jié)腫瘤的增殖轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化［12］。在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)明顯低于正常肺組織，并且發(fā)現(xiàn)其具有抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用［13］；在另一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)miR-145-5p具有明顯抑制食管癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移，并發(fā)現(xiàn)與核因子和特異度蛋白1具有明顯關(guān)系［14］。在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)miR-145-5p對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖，遷移和凋亡具有明顯抑制作用［15］，說(shuō)明miR-145-5p具有明顯抑制癌細(xì)胞的作用。本組研究顯示膀胱癌病人尿液中miR-145-5p表達(dá)明顯低于健康對(duì)照組，手術(shù)后較術(shù)前比較出現(xiàn)明顯升高，并且與腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤數(shù)目具有明顯相關(guān)性，說(shuō)明miR-145-5p參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，具有明顯抑癌作用?，F(xiàn)有的研究表明miR-145-5p 能夠明顯促進(jìn)膀胱癌的增殖，遷移和轉(zhuǎn)移作用［16］。本組研究發(fā)現(xiàn)尿液中miR-145-5p表達(dá)在診斷膀胱癌具有較高的診斷效能，當(dāng)尿液中miR-145-5p≤1.225，其診斷膀胱癌具有較高的靈敏度和特異度。膀胱癌死亡組尿液miR-145-5p 表達(dá)明顯低于存活組，并且在診斷3年內(nèi)出現(xiàn)死亡具有較高特異度和靈敏度，但尿液中miR-145-5p表達(dá)≤1.225 具有3年內(nèi)具有較高出現(xiàn)死亡的風(fēng)險(xiǎn)。本組研究發(fā)現(xiàn)miRNA-375 和miR-145-5p 分別類似促癌基因和抑癌基因的功能，兩者在膀胱癌中的表達(dá)存在某種平衡，并且發(fā)現(xiàn)兩者聯(lián)合檢測(cè)在診斷膀胱癌具有較單一指標(biāo)檢測(cè)更高的靈敏度和特異度，其靈敏度87.5%，特異度93.3%，曲線下面積0.959，說(shuō)明聯(lián)合miRNA-375 和miR-145-5p 指標(biāo)在診斷miR-145-5p膀胱癌明顯提高診斷效能。在預(yù)測(cè)3年內(nèi)出現(xiàn)死亡方面，尿液中miRNA-375和miR-145-5p表達(dá)具有較高的效能，聯(lián)合兩個(gè)指標(biāo)并不能提高預(yù)測(cè)效能。本組通過(guò)尿液聯(lián)合檢測(cè)miRNA-375和miR-145-5p對(duì)膀胱癌診斷和預(yù)后具有一定的優(yōu)勢(shì)：尿液標(biāo)本容易獲得，并且能夠反復(fù)獲得，可用作對(duì)膀胱癌術(shù)后的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)；取標(biāo)本為無(wú)創(chuàng)，病人依從性強(qiáng)；本組聯(lián)合檢測(cè)，較單個(gè)指標(biāo)檢測(cè)比較明顯提高診斷效能。本研究采用qRT-PCR檢測(cè)，需要一定的實(shí)驗(yàn)儀器，對(duì)基層醫(yī)院的推廣有一定的難度。

總之，miRNA-375和miR-145-5p參與了膀胱癌的發(fā)生發(fā)展，尿液中的miRNA-375和miR-145-5p檢測(cè)對(duì)于膀胱癌的診斷和預(yù)后判斷具有重要臨床價(jià)值。