張文博，楊志峰，吳佩，趙明偉，劉慧英，崔金霞

(石河子大學農(nóng)學院/新疆生產(chǎn)建設兵團特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用重點實驗室，新疆 石河子 832003)

低溫脅迫是限制植物分布和產(chǎn)量的重要因素之一。植物在低溫脅迫下的生理生化變化主要表現(xiàn)為葉綠素合成受阻[1]、細胞收縮、膜系統(tǒng)受損、膜脂從液晶態(tài)變成凝膠態(tài)，導致離子發(fā)生外滲、細胞導電性發(fā)生變化，進而體內(nèi)各種代謝發(fā)生紊亂。活性氧(ROS)參與細胞內(nèi)生理生化反應，正常情況下，ROS分子能夠被氧化防御機制清除，即植物的保護性應激反應[2]。一旦植物受到低溫等逆境脅迫時，活性氧的動態(tài)平衡被打破，從而對植物造成傷害[3]。NO是一種易穿過生物膜，幾乎不含極性的親脂性分子。植物體內(nèi)NO的產(chǎn)生主要有硝酸還原酶(NR)、一氧化氮合酶(NOS)途徑和非酶促途徑[4]。研究[5]已證實NO在植物中是一種關鍵的信號分子參與植物體內(nèi)多種生理代謝，包括促進植物生長發(fā)育、延緩葉片衰老、刺激防御相關基因的表達，并在逆境中具有抗氧化的作用。Zhao等[6]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥內(nèi)源NO的產(chǎn)生與低溫馴化呈正相關關系，并且NO合成的迅速增加伴隨著冷應答基因的表達。也有研究[7]表明ROS中的H2O2可以作為信號分子參與植物的防御反應，并可以與NO信號分子互作來提高植物的抗逆性。

植物在生長發(fā)育過程中遭受低溫、干旱等逆境脅迫后，能夠通過一系列信號轉(zhuǎn)導激發(fā)轉(zhuǎn)錄因子與順式作用元件結(jié)合，精確調(diào)控下游基因的轉(zhuǎn)錄表達，并通過基因產(chǎn)物的作用對外界信號在生理生化等方面做出合適的調(diào)節(jié)反應，提高自身的耐性以維持生存[8]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族能響應低溫脅迫，Ling等[9]研究表明黃瓜中共發(fā)現(xiàn)有57個WRKY家族基因，有一些WKRY轉(zhuǎn)錄因子參與到低溫脅迫中。

近年來，將NO作為信號分子來研究植物抗逆的報道較多[10]，但對于構(gòu)建不同水平的NO對植物生長發(fā)育及抗逆的研究鮮有報道。因此，本試驗以黃瓜幼苗為試驗材料，通過外源噴施NO供體硝普鈉(SNP)及其清除劑PTIO來構(gòu)建不同NO水平的黃瓜幼苗植株，進而研究NO對黃瓜幼苗的生長發(fā)育及低溫脅迫后NO在提高黃瓜幼苗低溫耐受性的機制，為黃瓜栽培中外源NO供體的合理應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與處理

試驗材料為‘津研4號’(購自山東祥云種業(yè)有限公司)黃瓜品種，試驗所用NO供體SNP購自Sigma公司，試驗所用PTIO購自東京化成工業(yè)株式會社，草炭購自德國Floragard公司。

試驗材料于2019年3—6月在石河子大學農(nóng)學院試驗站及特色果蔬栽培生理與種質(zhì)資源利用實驗室中進行。挑選籽粒飽滿、大小一致的黃瓜種子于55 ℃浸種30 min，自然冷卻至室溫浸泡6 h后于28 ℃恒溫箱內(nèi)黑暗催芽24 h。選取發(fā)芽一致的種子播于72孔穴盤。待兩片子葉完全展開后移入裝有基質(zhì)(V草炭∶V蛭石∶V珍珠巖=2∶1∶1)的花盆(直徑120 mm，高110 mm)，每盆1株，緩苗5 d后每隔4 d澆1次Hoagland營養(yǎng)液(0.5倍)，每次100 mL。待幼苗第1片真葉完全展開后，進行以下處理：①噴施蒸餾水，每隔1 d噴一次；②噴施200 μmol·L-1SNP，每隔3 d噴1次；③噴施200 μmol·L-1PTIO，每隔1 d噴1次；④噴施200 μmol·L-1PTIO及200 μmol·L-1SNP，PTIO每隔1 d處理1次，SNP每隔4 d處理1次。每處理重復3次，各15株。

待植株長至二葉一心后，選取整齊一致的幼苗60株移到人工氣候箱(Percival，美國)，10:00對以上植株進行低溫處理：晝(14 h)(10±1) ℃、夜(10 h)(6±1) ℃，植物葉片表面受光照強度為100 μmol·m-2·s-1,相對濕度晝75%/夜50%,分別在低溫脅迫0、24和48 h后對植株第2片葉進行相關指標的測定。試驗采用單因素完全隨機試驗設計。

1.2 測定項目及方法

1.2.1 植物地上部分干鮮重與葉面積的測量

黃瓜植株地上部分以子葉下1 cm處為準，稱取植物的鮮重后，將植株放于信封袋內(nèi)，置于DCG-9(146 A)電熱恒溫鼓風干燥箱內(nèi)，105 ℃殺青30 min后，70 ℃烘至恒重，此時植株的重量記為干重。LI-3100C臺式葉面積儀用于測定植物的葉面積。

1.2.2 葉綠素含量的測量

葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素均用丙酮乙醇混合液法進行提取[11]，日本日立U-3900H紫外分光光度計用于測量各色素的含量。

1.2.3 丙二醛含量的測量

參照Hodges等[12]的方法測定黃瓜葉片丙二醛(MDA)含量。

1.2.4 過氧化氫含量的測量及過氧化氫染色

過氧化氫(H2O2)含量的測定采用南京建成生物工程研究所的過氧化氫試劑盒(A064)，具體操作使用方法見說明書，H2O2組織化學染色參考Thordal-Christensen等[13]的方法，雙蒸水沖洗各處理黃瓜幼苗葉片，打孔器(直徑1 cm)打孔，葉圓片放入24孔培養(yǎng)板中，每孔加入1.6 mLDAB反應液(50 mmolTris-HCL，pH3.8)用于H2O2染色。300 μmol·m-2·s-1光強下28 ℃光照6 h后將葉圓片放入存有95%無水乙醇中煮沸數(shù)分鐘，肉眼觀察葉片顏色由綠變白后拍照，棕褐色表示H2O2積累程度。

1.2.5 NO含量及NOS活性測定

NO含量及NOS活性測定采用南京建成生物工程研究所的試劑盒(A012-1-2、A0142-2)，具體操作使用方法見說明書。

1.2.6 RNA提取及基因轉(zhuǎn)錄水平

Trizol法提取黃瓜葉片總RNA，Nanodrop 2000(Thermo Fisher Scientific公司，美國)檢測核酸含量瓊脂糖凝膠電泳驗證RNA完整性。Bio-Rad(美國)熒光定量PCR儀用于qRT-PCR反應。反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個循環(huán)。以黃瓜的Actin(XM-011659465.1)基因作為內(nèi)參校正并定量分析葉綠素相關基因、抗冷相關基因的表達水平。實時定量(qRT-PCR)分析：基因表達的相對定量采用2-ΔΔCt法進行計算[14]?；虻膓RT-PCR擴增引物序列如表所示：

表1 qRT-PCR引物序列

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

采用Excel 2010和SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，Duncan’s新復極差法用于差異顯著性檢驗(P<0.05)，Origin 9.0軟件繪圖。圖表中結(jié)果為平均值±標準誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源NO處理對黃瓜幼苗生長指標的影響

如表2所示，與CK相比，SNP處理的黃瓜幼苗的葉面積、鮮重及干重分別顯著升高38.55%、45.68%和28.33%；PTIO處理的黃瓜幼苗葉面積、鮮重及干重分別顯著降低了11.70%、6.8%和20.00%；PTIO+SNP處理的黃瓜幼苗葉面積、鮮重分別顯著增加了20.18%、23.53%。此外，與SNP相比，PTIO+SNP處理的黃瓜幼苗的葉面積、鮮重及干重分別顯著降低了13.26%、15.21%和23.38%，說明PTIO抑制了SNP的作用效果。

表2 不同處理對黃瓜幼苗葉面積、干鮮重的影響

2.2 外源NO處理對葉綠素含量及其合成基因表達

由表3可知，在低溫處理0 h后，與CK相比，SNP處理的葉綠素a、b和總?cè)~綠素的含量分別顯著提高17.85%、21.57%和18.23%；低溫脅迫24 h后，與CK相比，SNP處理的葉綠素a、b和總?cè)~綠素的含量分別顯著提高31.61%、28.81%和33.19%。而PTIO處理與對照相比在0 h時，葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量分別顯著降低16.43%、15.68%和16.67%；在低溫脅迫24 h后，PTIO處理與CK相比，葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量分別顯著降低19.54%、23.73%和19.21%。PTIO+SNP處理的葉綠素a、b和總?cè)~綠素含量與CK相比無顯著差異。

表3 低溫脅迫下NO對黃瓜幼苗葉綠素含量的影響

如圖1所示，低溫0 h時，與CK相比，SNP和PTIO+SNP處理顯著上調(diào)MgCH和FeCH基因的表達水平，PTIO處理與CK相比無顯著差異。低溫24 h后，與CK相比，SNP處理的MgCH和FeCH基因的轉(zhuǎn)錄水平依然顯著上調(diào)，PTIO處理顯著則抑制FeCH和MgCH基因的表達水平，PTIO+SNP處理的FeCH基因表達與CK相比無差異，但MgCH的表達水平顯著高于CK。

2.3 外源NO對黃瓜幼苗MDA含量的影響

如圖2，低溫0 h時，與CK相比，SNP處理的MDA含量顯著降低了12.66%，其他處理與CK相比無顯著差異。低溫24 h后，SNP和PTIO+SNP處理的MDA含量與CK相比無顯著差異，但與CK相比，PTIO處理黃瓜幼苗的MDA含量顯著增加了25.59%。

圖2 不同NO處理對黃瓜幼苗丙二醛(MDA)含量的影響

2.4 外源NO對黃瓜幼苗H2O2的影響

低溫脅迫后黃瓜幼苗H2O2含量的變化如圖3。在低溫0 h時，各處理H2O2含量與CK相比無顯著差異。低溫24 h后，與低溫前相比，各處理的H2O2含量迅速升高，與CK相比，SNP、PTIO處理的H2O2含量顯著增加57.02%、26.47%，PTIO+SNP處理與CK相比無顯著差異。如圖3B，染色深淺與H2O2含量正相關。H2O2染色圖像與H2O2含量的變化趨勢相一致。

A—H2O2含量，B—H2O2染色。

2.5 低溫脅迫下外源NO對黃瓜幼苗內(nèi)源NO及NOS活性的影響

如圖4所示，低溫脅迫24 h后，與CK相比，SNP和PTIO+SNP處理的NO含量和NOS活性均顯著增加，PTIO處理NO含量與CK相比無顯著差異(圖4A)，而與CK相比，PTIO處理的NOS活性顯著降低(圖4B)。

圖4 低溫脅迫下NO對黃瓜幼苗NO含量和NOS活性的影響

2.6 外源NO對黃瓜幼苗抗冷相關基因的影響

如圖5所示，低溫脅迫后，與CK相比，SNP顯著提高CsWRKR40和CsWRKR57基因的相對表達水平(除低溫48 h后的CsWRKR40)(圖5 A、5C)，顯著降低了CsWRKR53的表達水平(圖5B)，而PTIO處理則表現(xiàn)出與SNP完全相反的作用效果，且PTIO的抑制效果可以被SNP部分恢復。

圖5 不同NO處理對黃瓜幼苗抗冷基因表達的影響

3 討論

據(jù)研究[15-16]，適宜濃度的NO會促進番茄等植物幼苗的生長。Tian等[17]研究表明濃度適宜的NO處理使豌豆葉片膨大。本試驗發(fā)現(xiàn)，SNP處理后黃瓜幼苗的葉面積及干鮮重顯著增加，而PTIO處理則表現(xiàn)出了與SNP相反的作用效果，這與張雙雙等[18]研究的與野生型擬南芥相比，擬南芥NO合成缺陷突變體具有葉色泛黃、葉片較小、植株矮小等結(jié)果一致。這說明本試驗利用化學遺傳法成功構(gòu)建了不同NO水平的黃瓜幼苗植株。Kolbert等[19]研究表明，對NO的nia1、nia2和noa1-2突變體外源施加NO能增加突變體內(nèi)源NO水平，從而提高突變體的抗逆性。本試驗證明，低溫脅迫下，外源施加SNP可以顯著提高NO含量和NOS活性，而PTIO對植物內(nèi)源NO和NOS的負影響可以部分被SNP處理恢復并提升。

當植物遭受低溫脅迫時，光合機構(gòu)首先受到損傷，葉綠體色素是植物進行光合作用的重要基礎，葉綠素含量在一定程度上反映了植株進行光合作用的能力。低溫會造成的植物葉綠素的損失[20]。Zhang等[21]研究表明低溫脅迫后，SNP處理會顯著提高葉綠素的含量和相關基因表達。本試驗表明，NO顯著提高葉綠素含量及其合成基因FeCH和MgCH的相對表達水平，而PTIO處理則表現(xiàn)出與SNP相反的作用效果。這表明在低溫脅迫下NO通過提高植物葉綠素合成相關基因的表達水平來提高葉綠素含量，進而緩解低溫對黃瓜幼苗的傷害。

MDA是衡量黃瓜低溫耐受性的一個重要指標[22]。吳旭紅等[23]研究表明，外源NO能降低低溫脅迫下植株MDA含量。徐洪雷等[24]研究表明適宜濃度的SNP能夠降低低溫脅迫下黃瓜幼苗葉片質(zhì)膜透性，抑制過氧化作用產(chǎn)物MDA的積累，提高黃瓜幼苗對低溫脅迫的適應性。本試驗結(jié)果顯示，低溫24 h后SNP處理的MDA含量相比CK而言顯著降低，而PTIO處理則顯著提高了MDA含量。這與徐洪雷等[24]的研究結(jié)果一致。

植物受到低溫脅迫后，ROS代謝失衡，會造成ROS如O2-、H2O2、羥自由基(OH·)及單線態(tài)氧等的大量積累[25]。ROS可以傷害蛋白質(zhì)、核酸和脂類等生物大分子引起細胞氧化損傷，但也可做為信號分子對植物生理進行調(diào)節(jié)，提高其抗逆性[26]。在非生物脅迫下，H2O2和NO的產(chǎn)生是瞬時連續(xù)發(fā)生或者平行發(fā)生[27]。Liao等[28]人報道cPTIO(NO清除劑)可以抑制內(nèi)源性H2O2的生成，說明植物體內(nèi)產(chǎn)生H2O2需要NO的參與。NO和H2O2兩個分子之間存在相互作用，可以調(diào)節(jié)其他分子、細胞和整個植物對各種脅迫的反應[27]。Shams等[29]研究發(fā)現(xiàn)，NO處理可以提高辣椒體內(nèi)過氧化氫的含量。本試驗研究發(fā)現(xiàn)，正常條件下，NO對黃瓜幼苗過氧化氫含量無顯著影響，在低溫脅迫24 h后，NO誘導H2O2含量顯著上升。這表明NO在低溫脅迫后誘導了黃瓜葉片內(nèi)源H2O2的產(chǎn)生共同參與到低溫脅迫應激反應中。

Ling等[9]研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子能響應低溫脅迫，至今在黃瓜基因組中共有57個基因被鑒定為WRKY家族的可能成員，目前已經(jīng)鑒定它們編碼55個WRKY蛋白(CsWRKY10和CsWRKY16未被鑒定)。在低溫條件下，這些轉(zhuǎn)錄因子的表達水平不盡相同，CsWRKR40和CsWRKR57在低溫下表達量上調(diào)，而CsWKRY53在低溫下表達量下調(diào)。本試驗發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫后，SNP顯著提高CsWRKR40和CsWRKR57的相對表達水平(除低溫48 h后的CsWRKR40)，抑制CsWRKY53的相對表達水平，PTIO+SNP處理3個轉(zhuǎn)錄因子的表達水平處于SNP和PTIO處理之間，表明WKRY轉(zhuǎn)錄因子參與了NO增強黃瓜幼苗的耐冷性。

4 結(jié)論

正常生長條件下，持續(xù)SNP處理會誘導黃瓜幼苗葉面積、干鮮重、葉綠素含量顯著增加。低溫脅迫下，持續(xù)SNP處理，能通過提高NOS的活性、內(nèi)源NO含量、H2O2含量、葉綠素含量和上調(diào)葉綠素合成基因，降低丙二醛含量以及增強與抗冷相關正調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子(CsWRKY40和CsWRKY57)的表達水平，抑制負調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子(CsWRKY53)的表達水平來提高黃瓜幼苗對低溫脅迫的耐受性。