蔣立勇 董 學(xué) 鐘方曉 李克明 張會(huì)敏

1.山東省泰安市新泰市中醫(yī)醫(yī)院，山東 新泰 271200；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南 250014

三棱為黑三棱科黑三棱屬植物黑三棱Sparganiumstoloniferum(Graebn.)Buch.的干燥塊莖[1]，主要分布于我國東北、黃河、長江中下游流域，野生資源較為豐富。其味苦、性平，入肝、脾經(jīng)，具有破血行氣、消積止痛等功效，用于癥瘕痞塊、瘀血經(jīng)閉、食積脹痛。三棱中含有的化學(xué)成分有黃酮類、揮發(fā)油類、皂苷類[2-4]等?，F(xiàn)代藥理研究表明三棱總黃酮具有較強(qiáng)的抗血小板聚集[5]、抗血栓和鎮(zhèn)痛[6]作用并且具有抑制腫瘤細(xì)胞A549、MCF-7、宮頸癌Hela細(xì)胞的細(xì)胞增殖活性等作用[7]。目前，2015版《中國藥典》僅僅規(guī)定了三棱飲片的性狀，對(duì)薄層鑒別、水分和浸出物進(jìn)行了考察，沒有進(jìn)行含量測定研究。在國內(nèi)外研究報(bào)道中，張建中等[8-9]對(duì)三棱飲片的薄層色譜和總黃酮含量也展開了一定的研究，但研究內(nèi)容還不夠完善，薄層展開方法以及結(jié)論還不夠詳實(shí)。因此，本研究在此基礎(chǔ)上運(yùn)用系列薄層色譜法對(duì)16批不同產(chǎn)地的三棱飲片進(jìn)行研究，優(yōu)化三棱飲片的薄層鑒別方法，完善和提高三棱飲片薄層鑒別的準(zhǔn)確性與可靠性，同時(shí)運(yùn)用紫外可見分光光度法分別對(duì)三棱飲片中的總黃酮含量進(jìn)行研究，建立三棱飲片總黃酮的含量測定方法。

1 儀器與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器 939薄層制板器(重慶市南岸貝爾德儀器技術(shù)廠), ZX-002紫外分光光度計(jì)(日本島津)，F(xiàn)W177型粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)材料 蘆丁對(duì)照品(中國食品藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)100080-200306)，三棱對(duì)照藥材(中國食品藥品生物制品檢定研究院，批號(hào)121521-201504)，乙醇(分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司)，亞硝酸鈉(分析純，天津市博迪化工有限公司)，硝酸鋁(分析純，天津市博迪化工有限公司)，氫氧化鈉(分析純，國營山東單縣有機(jī)化工廠)。

三棱飲片來自于各大藥店和藥材市場。經(jīng)鐘方曉研究員鑒定為黑三棱科黑三棱屬植物黑三棱Sparganiumstoloniferum(Graebn.)Buch.的干燥塊莖，其飲片如圖1所示，具體來源見表1。

圖1 三棱飲片圖

表1 三棱飲片來源

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜鑒別

2.1.1 供試品溶液及對(duì)照藥材溶液的制備 取本品粉末(過60目篩)1.0 g，加甲醇3 mL，浸泡過夜，取上清液作為供試品溶液。另取三棱對(duì)照藥材1.0 g，同法制備對(duì)照藥材溶液。

2.1.2 藥典薄層鑒別方法 吸取供試品溶液及對(duì)照藥材溶液各5 μL，以樣品1～8、9(三棱對(duì)照藥材)、10～17為點(diǎn)樣順序，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚:乙酸乙酯(v∶v=4∶1, 60～90 ℃)為展開劑，飽和30 min，展開，取出，晾干。置紫外光燈下(365 nm)檢視，如圖2所示。

由圖2可知，15個(gè)樣品溶液(4號(hào)樣品溶液除外)在與對(duì)照藥材溶液相同位置均有一組相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)1(Rf值0.33)，這些斑點(diǎn)強(qiáng)弱差異較大，1、2、6、7、10、12～17斑點(diǎn)較弱，4號(hào)樣品未發(fā)現(xiàn)該熒光斑點(diǎn)，按照藥典的展開條件這些樣品可能鑒別為劣藥甚至假藥，為了提高鑒別的準(zhǔn)確度，有必要對(duì)三棱飲片進(jìn)行系列薄層色譜研究，來尋找更優(yōu)的三棱飲片薄層鑒別方法。

2.2.3 優(yōu)化后的薄層色譜方法 吸取供試品溶液及對(duì)照藥材溶液各5 μL，以1～8、9(三棱對(duì)照藥材)、10～17為點(diǎn)樣順序，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為粘合劑的硅膠G薄層板上，以石油醚:乙酸乙酯:甲酸(v∶v∶v=3∶1∶0.1，60～90 ℃)為展開劑，飽和30 min，展開，取出，晾干。置紫外光燈下(365 nm)下檢視，如圖3所示。再噴以5%硫酸乙醇，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)清晰，在可見光下觀察，如圖4所示。再次置紫外光燈下(365 nm)檢視，如圖5所示。

1～8.三棱樣品；9.三棱對(duì)照藥材；10～17.三棱樣品圖2 2015年版中國藥典方法三棱薄層色譜圖

1～8.三棱樣品；9.三棱對(duì)照藥材；10～17.三棱樣品圖3 新建方法三棱薄層色譜圖

1～8.三棱樣品；9.三棱對(duì)照藥材；10～17.三棱樣品圖4 可見光下5%硫酸乙醇加熱顯色后三棱薄層色譜圖

1～8.三棱樣品；9.三棱對(duì)照藥材；10～17.三棱樣品圖5 紫外光下5%硫酸乙醇加熱顯色后三棱薄層色譜圖

由圖3可知，在石油醚:乙酸乙酯:甲酸(v∶v∶v=3∶1∶0.1，60～90 ℃)展開條件下，紫外燈下直接觀察，除4號(hào)樣品溶液外，其余15個(gè)樣品溶液在與對(duì)照藥材溶液相同位置均有相同的藍(lán)色熒光斑點(diǎn)，但斑點(diǎn)顏色強(qiáng)弱差異較大；由圖4可知，在可見光下，16個(gè)樣品溶液與對(duì)照藥材溶液在相同位置有兩個(gè)相同的紅色斑點(diǎn)1(Rf值0.05)和2(Rf值0.46)，且斑點(diǎn)強(qiáng)度相近；由圖4可知，1(Rf值0.05)、3(Rf值0.46)、4(Rf值0.50)、5(Rf值0.52)、7號(hào)斑點(diǎn)(Rf值0.90)為16個(gè)樣品溶液和對(duì)照藥材溶液的共有斑點(diǎn)，且熒光強(qiáng)度接近；2號(hào)斑點(diǎn)(Rf值0.38)為藥典條件下所觀察的熒光斑點(diǎn)，樣品溶液與對(duì)照藥材溶液熒光斑點(diǎn)顏色強(qiáng)弱差異較大；6號(hào)斑點(diǎn)(Rf值0.85)為15個(gè)樣品溶液的共有斑點(diǎn)(4號(hào)樣品溶液除外)，但對(duì)照藥材溶液沒有。

由上述研究可見，按照藥典薄層方法得到的信息量較少，無法準(zhǔn)確的鑒別出三棱飲片的質(zhì)量真?zhèn)蝺?yōu)劣，可能會(huì)得出錯(cuò)誤的結(jié)論，而采用改良后的薄層展開方法后，至少存在5個(gè)以上共有斑點(diǎn)，可以通過這些共有斑點(diǎn)快速準(zhǔn)確的綜合評(píng)價(jià)三棱飲片的真?zhèn)蝺?yōu)劣。

2.2 三棱飲片總黃酮的含量測定[10]

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取在120 ℃干燥至恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品5.22 mg，置 50 mL容量瓶中，加60%乙醇適量，采用超聲處理，使其溶解，放冷，加60%的乙醇至刻度，搖勻，即得(每1 mL中含蘆丁0.1044 mg)。

2.2.2 測定波長的確定 精密量取6 mL蘆丁對(duì)照品溶液，置于25 mL容量瓶中，加水6 mL，加5%亞硝酸鈉溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min；加入10%硝酸鋁溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min；加入4%氫氧化鈉試液5 mL，再加至刻度，搖勻，放置15 min。以不加蘆丁對(duì)照品同上法平行操作的相應(yīng)溶液為空白對(duì)照，進(jìn)行240～600 nm全波段掃描。結(jié)果顯示，在500 nm 處有最大吸收波長，故選擇波長500 nm 處進(jìn)行含量測定。

2.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取蘆丁對(duì)照品溶液2 、4 、6 、8 、10 、12 mL，分別置25 mL量瓶中，后按2.2.2的方法制備樣品，以不加蘆丁對(duì)照品同上法平行操作的相應(yīng)溶液為空白對(duì)照，在最大吸收波長處測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，再用最小二乘法進(jìn)行線性回歸，以吸光值對(duì)濃度進(jìn)行線性回歸分析, 求得回歸方程為A=0.1062C-0.0053(R2=0.9995)，表明蘆丁對(duì)照品溶液濃度在0.008～0.050 mg·mL-1范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.2.4 提取條件的選擇

2.2.4.1 乙醇濃度的選擇 精密稱取三棱粉末(5號(hào)樣品)1.0 g，平行稱定3份，分別置于100 mL錐形瓶中，精密加入25 mL不同濃度的乙醇(第1份40%乙醇，第2份60%乙醇，第3份80%乙醇)，后按2.2.2的方法制備樣品，在最大吸收波長處測定吸光度。 由表2可見，用60%乙醇提取后總黃酮含量最高，故選用60%乙醇溶液提取。

表2 不同濃度乙醇的吸光度值

表3 不同提取時(shí)間及提取方法的吸光度

2.2.4.2 提取時(shí)間及提取方法的選擇 精密稱取三棱粉末(5號(hào)樣品)1.0g，平行稱定4份，分別置于100 mL錐形瓶中，精密加入25 mL的60%乙醇，稱重，其中兩份樣品溶液超聲提取，另兩份加熱回流提取，測定吸光度。由表3可見，回流提取的總黃酮含量高于超聲提取的，但回流1 h與回流1.5 h差距不大，故選加熱回流1h為提取方法。結(jié)果表明，以60%乙醇溶液，加熱回流提取1 h為最佳提取工藝。

2.2.5 供試品溶液的制備 精密稱取三棱粉末(3號(hào)樣品)1.0 g，置于100 mL錐形瓶中，精密量取60%乙醇25 mL，稱重，加熱回流提取1h，放冷后，用60%乙醇溶液補(bǔ)足損失的重量，過濾，濾液為供試品溶液。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 精密量取蘆丁對(duì)照品溶液6 mL，置25 mL量瓶中，按照2.2.3的方法，自“各加水6 mL”起依法測定吸光度，連續(xù)測6次，按吸光度計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為0.000471，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.173%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取供試品溶液5 mL，置25 mL量瓶中，按照2.2.3的方法，自“各加水6 mL”起依法測定吸光度，分別測定顯色后放置10、20、30、40、50、60 min 供試品溶液的吸光度，按吸光度算得其在1 h內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)為0.005，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為3.00%。

表4 不同來源的三棱飲片中總黃酮的含量

2.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取6份同一袋樣品各1.0 g，按照2.2.5的方法平行操作制備6份供試品溶液，分別精密吸取6份供試品溶液各5 ml,置25 mL量瓶中，按照2.2.3的方法，自“各加水6 mL”起依法測定吸光度，按含量計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.49%。

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn) 稱取已知含量的樣品約0.50 g，精密稱定，平行6份，分別加入一定量的蘆丁對(duì)照品，按2.2.5制得供試品溶液。精密量取供試品溶液5 mL，置于25 mL錐形瓶中，按照2.2.3的方法，自“各加水6 mL”起依法測定吸光度。用實(shí)值除以理論值計(jì)算回收率，再計(jì)算平均回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。算得平均回收率為98.9%，RSD為1.49%。表明該含量測定方法的誤差以及操作過程的損失較小，可靠性較高。

2.2.10 三棱中總黃酮的含量測定 精密稱取本品粉末1.0 g，置100 mL錐形瓶中，精密加入60%乙醇25 mL，浸泡，稱重，加熱回流提取1 h，放冷，60%乙醇補(bǔ)足損失重量，搖勻，濾過，濾液為供試品溶液。精密量取供試品溶液5 mL，置25 mL容量瓶中，按照2.2.3的方法，測定吸光度，計(jì)算供試品中總黃酮的含量(mg·g-1)，再按含量計(jì)算均值，結(jié)果表4。

16批三棱藥材總黃酮的平均含量為3.75 mg·g-1。最低含量為2.43 mg·g-1,最高含量為5.25 mg·g-1。

3 結(jié)論

通過實(shí)驗(yàn)可知，在石油醚-乙酸乙酯-甲酸(3∶1∶0.1)的展開條件下，可顯現(xiàn)5組與對(duì)照藥材溶液相同的共有斑點(diǎn)，且這些斑點(diǎn)更為清晰，更具有代表性，可用于三棱飲片的快速鑒別。在2015版《中國藥典》的薄層展開條件下，三棱飲片在紫外光下僅能觀察到一組熒光斑點(diǎn)，而本實(shí)驗(yàn)建立的方法，在紫外光下5%硫酸乙醇加熱顯色后三棱薄層色譜圖顯示7組熒光斑點(diǎn)，斑點(diǎn)多且清晰，專屬性強(qiáng)。運(yùn)用紫外可見分光光度法可以快速測定三棱飲片中總黃酮的含量。