付勇剛 楊家耀

摘要?目的：探究附子理中湯對非酒精性脂肪性肝炎大鼠內(nèi)毒素及其受體的影響。方法：將75只SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組，分別為正常組，模型組，附子理中湯觀察組。采用腹主動(dòng)脈取血法，收集血液后離心取上清，通過雙抗體夾心法檢測腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和鱟合成基質(zhì)顯色法檢測內(nèi)毒素表達(dá)水平;免疫組織化學(xué)法檢測肝組織內(nèi)CD14表達(dá)水平，并利用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法檢測Toll樣受體-4（TLR-4）與TNF-α mRNA表達(dá)水平。結(jié)果：與正常組比較，模型組TNF-α水平顯著提高，且在第12～24周內(nèi)持續(xù)維持較高水平;附子理中湯觀察組TNF-α水平較模型組顯著降低，但仍高于正常組;正常組大鼠肝臟TNF-α mRNA未見其表達(dá)，模型組TLR4和TNF-α mRNA表達(dá)量均顯著升高。與模型組比較，附子理中湯觀察組TLR4和TNF-α mRNA顯著低于模型組，但仍高于正常組TLR4和TNF-α mRNA表達(dá);正常組只有少量細(xì)胞能夠表達(dá)CD14。與正常組比較，模型組大鼠肝組織在第12～24周內(nèi)，CD14表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)持續(xù)升高，在24周時(shí)略有降低，而附子理中湯觀察組CD14表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)與模型組比較顯著減少。結(jié)論：附子理中湯可降低非酒精性脂肪性肝炎大鼠內(nèi)毒素及其受體表達(dá)。

關(guān)鍵詞?附子理中湯;非酒精性脂肪性肝炎;內(nèi)毒素;Toll樣受體-4;腫瘤壞死因子-α;CD14;信使核糖核酸;逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng);雙抗體夾心法;免疫組織化學(xué)法

Abstract?Objective：To explore the effects of Fuzi Lizhong Decoction on endotoxin and its receptor in rats with nonalcoholic steatohepatitis.Methods：A total of 75 SD male rats were randomly divided into 3 groups：a normal group，a model group and a treatment group with Fuzi Lizhong Decoction.Abdominal aortic blood sampling method was used，blood was collected and centrifuged to take supernatant，and the expression level of endotoxin was detected by double antibody filling method to detect tumor necrosis factor alpha（TNF-α）and Limulus synthetic matrix color method was used to detect endotoxin expression; immunohistochemical method was used to detect the expression level of CD14 in liver tissues，and the reverse transcription-polymerase chain reaction（RT-PCR）method was used to detect the expression levels of Toll-like receptor-4（TLR-4）and TNF-α mRNA.Results：Compared with the normal group，the level of TNF-α in the model group increased significantly，and continued to maintain a high level during the 12th to 24th weeks; the level of TNF-α in the Fuzi Lizhong Decoction was significantly lower than that in the model group，but it was still higher than that in the normal group.The expression of TNF-α mRNA in liver of normal group rats was not found，and the expression levels of TLR4 and TNF-α mRNA in model group were significantly increased.Compared with the model group，the TLR4 and TNF-α mRNA of the Fuzi Lizhong Decoction group were significantly lower than the model group，but it was still higher than TLR4 and TNF-α mRNA expression in the normal group; only a small number of cells in the normal group were able to express CD14.Compared with the normal group，the number of CD14-expressing positive cells in the model group′s liver tissue continued to increase from 12 to 24 weeks，and slightly decreased at 24 weeks，while the number of CD14-expressing positive cells in the Fuzi Lizhong Decoction group significantly reduced compared with the model group.Conclusion：Fuzi Lizhong Decoction can reduce the expression of endotoxin and its receptor in non-alcoholic steatohepatitis rats.

Keywords?Fuzi Lizhong Decoction; Nonalcoholic steatohepatitis; Endotoxin; Toll-like receptor4; Tumor necrosis factor-α; CD14; Messenger RNA; Reverse transcription-polymerase chain reaction; Double antibody filling method; Immunohistochemical method

中圖分類號(hào)：R289.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.19.009

非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic Steatohepatitis，NASH）是指沒有飲酒史，非肝炎病毒誘導(dǎo)的一類與酒精性脂肪肝炎具有相似的病理特征的一種疾病[1]。接近15%的非酒精性脂肪性肝炎可出現(xiàn)肝纖維化，10年病程的患者可發(fā)生肝硬化及肝衰竭，嚴(yán)重可致肝細(xì)胞癌[2]。非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)病機(jī)制盡管尚未完全明確，但認(rèn)為與脂質(zhì)代謝紊亂、炎性反應(yīng)及胰島素抵抗緊密相關(guān)。研究顯示非酒精性脂肪性肝炎患者均伴有不同程度的腸源性內(nèi)毒素血癥，內(nèi)毒素穿透細(xì)胞腸壁屏障，與脂多糖結(jié)合蛋白（Lipopolysaccharide Binding Protein，LBP）結(jié)合后輸送至肝臟，隨之由庫普弗（Kupffer）細(xì)胞清除[3-4]，同時(shí)肝臟固有免疫病原識(shí)別受體Kupffer細(xì)胞表面4型Toll樣受體-4（Toll-like Receptor4，TLR-4）被激活，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子α（Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（Interleukin-1β，IL-1β）等炎性反應(yīng)遞質(zhì)生成與釋放，其中TNF-α結(jié)合TNF-α受體，可對肝細(xì)胞具有直接的毒性作用，可促使肝細(xì)胞壞死或凋亡，同時(shí)能趨化細(xì)胞內(nèi)的中性粒細(xì)胞發(fā)生浸潤釋放自由基，誘導(dǎo)細(xì)胞損傷[5-7]。內(nèi)毒素受體亞型中CD14的功能作用最突出。目前治療非酒精性脂肪性肝炎尚無特效藥，西藥治療非酒精性脂肪性肝炎多以保肝為主，且長期服藥也存在不良反應(yīng)。中醫(yī)在非酒精性脂肪性肝炎通過辨證施治獲得了良好的效果，附子理中湯來源于宋代陳言所著的《三因極一病證方論》，臨床主要用于治療存在炎性反應(yīng)的胃潰瘍[8]或慢性結(jié)腸炎[9]，我們將附子理中湯治療非酒精性脂肪性肝炎獲得了良好的效果，減輕重型肝炎患者的脾陽虛等現(xiàn)象，但治療的機(jī)制尚不明確，且近年來有較多的機(jī)制研究顯示中藥治療非酒精性脂肪性肝炎是與調(diào)控外周血或肝組織TLR4、TNF-α及CD14表達(dá)有關(guān)[10]。本研究通過研究附子理中湯對高脂誘導(dǎo)的非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝組織TLR4、TNF-αmRNA及CD14表達(dá)等相關(guān)指標(biāo)的影響，探究附子理中湯對非酒精性脂肪性肝炎大鼠的可能機(jī)制?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動(dòng)物

選取SD雄性大鼠，2月齡，200～220 g，購自北京動(dòng)物醫(yī)學(xué)院。實(shí)驗(yàn)時(shí)動(dòng)物房保持12 h光照與黑暗交替，相對濕度60%左右，室溫保持在22 ℃左右，各組大鼠均可自由飲水、采食。

1.1.2?藥物

附子理中湯（人參10 g、白術(shù)15 g、干姜10 g、制附子10 g、炙甘草3 g），自制，加入5倍藥材的純凈水，浸泡30 min，大火煮沸，40 min，加入生姜10 g，連續(xù)煎煮2次，合并煎液，濃縮至相當(dāng)于10 g生藥/mL，即得。

1.1.3?試劑與儀器

Toll樣受體-4（Toll-like Receptor4，TLR-4）與TNF-α上下游引物由北京的天根有限公司合成;高脂飼料（2%膽固醇，10%豬油，普通飼料）（自制）;水合氯醛（化學(xué)純，北京化工廠，批號(hào)：019663）;石蠟（化學(xué)純，北京化工廠，批號(hào)：020016）、β-actin（南京建成生物工程研究所，貨號(hào)：X1546）;顯色基質(zhì)鱟試劑盒（廈門市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司，貨號(hào)：020106）;大鼠CD14免疫組織化學(xué)試劑盒、TNF-α和內(nèi)毒素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法（ELISA）試劑盒均購自武漢的默沙克生物科技有限公司，貨號(hào)為020117、019608、020152。c1000型PCR儀（Bio-rad公司，美國，貨號(hào)：c1000）;Multiskan Sky全波長酶標(biāo)儀（Thermo公司，美國，貨號(hào)：51119570）;ME104E ME204E型萬分之一電子天平（美國梅特勒-托利多集團(tuán)，美國，貨號(hào)：ME204）;VCM-3558型輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)（新鄉(xiāng)市維克科教儀器有限公司，貨號(hào)：VCM-3558）。

1.2?方法

1.2.1?分組與模型制備

將75只SD雄性大鼠隨機(jī)分為3組，分別為正常組，模型組，附子理中湯觀察組。其中模型組和藥物觀察組喂食高脂飼料（2%膽固醇，10%豬油，普通飼料），正常組喂食普通飼料。

1.2.2?給藥方法

附子理中湯觀察組喂食高脂飼料的同時(shí)，每天定時(shí)灌胃附子理中湯。正常組，模型組每天定時(shí)灌胃生理鹽水。

1.2.3?檢測指標(biāo)與方法

分別在第8、12、16周各取3只大鼠處死，24周后將其全部處死取材，并在大鼠處死前隔夜禁食。1）TNF-α和內(nèi)毒素表達(dá)水平：使用10%水合氯醛將大鼠麻醉后，采用腹主動(dòng)脈取血法獲得2 mL全血，3 500 r/min，離心半徑8 cm，4 ℃條件下離心15 min，轉(zhuǎn)移上清液至新的離心管中，置于-80 ℃保存。TNF-α使用雙抗體夾心法，內(nèi)毒素檢測采用鱟合成基質(zhì)顯色法進(jìn)行檢測。采用免疫組織化學(xué)法檢測肝組織內(nèi)CD14表達(dá)水平：10%水合氯醛將大鼠麻醉后，解剖其腹部，使肝組織暴露，剪取適當(dāng)組織置于固定液中保存。固定2 h后進(jìn)行脫水包埋，對包埋組織進(jìn)行石蠟切片，隨即常規(guī)脫蠟，通過抗原修復(fù)，抗體孵育后，進(jìn)行常規(guī)脫水和透明，封片待用。根據(jù)視野下觀察計(jì)數(shù)，讀取其陽性細(xì)胞數(shù)。采用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）檢測Toll樣受體-4（TLR-4）與TNFα mRNA表達(dá)水平：使用TRizol法進(jìn)行肝組織RNA提取，提取后的RNA立即進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄，獲得CDNA。取適量CDNA，以β-actin為內(nèi)參，對TLR4和TNFα基因進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)設(shè)定參數(shù)進(jìn)行引物擴(kuò)增，擴(kuò)增體系為：CDNA 7.5，加樣緩沖液1.5倍，進(jìn)行20 g/L瓊脂糖凝膠電泳，并通過RT-PCR儀獲得擴(kuò)增情況，從而計(jì)算相關(guān)基因的mRNA相對表達(dá)量，引物及序列見表1。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料用均數(shù)標(biāo)準(zhǔn)（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，2組間比較采用SNK檢驗(yàn)，多組間計(jì)量資料的比較采用方差分析，計(jì)算F值。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?附子理中湯對非酒精性脂肪性肝炎大鼠血清內(nèi)TNF-α水平的影響

與正常組比較，模型組TNF-α水平顯著提高，且在第12～24周內(nèi)持續(xù)維持較高水平;附子理中湯觀察組TNF-α水平較模型組顯著降低，但仍高于正常組。見表2。

2.2?附子理中湯對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟內(nèi)TLR4和TNF-α mRNA表達(dá)的影響

正常組大鼠肝臟TNF-α mRNA未見其表達(dá)，模型組TLR4和TNF-α mRNA表達(dá)量均顯著升高。與模型組比較，附子理中湯觀察組TLR4和TNF-α mRNA顯著低于模型組，但仍高于正常組TLR4和TNF-α mRNA表達(dá)。見表3和圖1。

2.3?附子理中湯對非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝臟內(nèi)毒素受體CD14的影響

正常組只有少量細(xì)胞能夠表達(dá)CD14。與正常組比較，模型組大鼠肝組織在第12～24周內(nèi)，CD14表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)持續(xù)升高，在24周時(shí)略有降低，而附子理中湯觀察組CD14表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)與模型組比較顯著減少。見表4。

3?討論

附子理中湯為理中湯中加附子而成的用于溫中祛寒的理想藥方，且可增強(qiáng)小鼠耐寒、鎮(zhèn)痛的作用，同時(shí)對脾寒胃虛患者具有較強(qiáng)的調(diào)節(jié)作用。而關(guān)于附子理中湯對非酒精性脂肪性肝炎患者影響的報(bào)道較為少見。因此，本研究附子理中湯對非酒精脂肪性肝炎大鼠體內(nèi)CD14、TLR4、TNF-α和內(nèi)毒素表達(dá)影響，探究附子理中湯對非酒精性脂肪性肝炎大鼠內(nèi)毒素及其受體的作用。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)附子理中湯可顯著降低非酒精性脂肪性肝炎大鼠體內(nèi)TNF-α水平和CD14表達(dá)的陽性細(xì)胞數(shù)，同時(shí)可促使TLR4和TNF-α基因表達(dá)水平顯著下調(diào)。內(nèi)毒素在血循環(huán)中與受體蛋白結(jié)合形成復(fù)合物后，便與位于細(xì)胞膜上的CD14受體結(jié)合，在相關(guān)蛋白的協(xié)同作用下，TLR4信號(hào)受體將其傳導(dǎo)至細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)各種炎性反應(yīng)遞質(zhì)被激活、釋放。內(nèi)毒素的肝毒性來源于庫普細(xì)胞，其在肝臟內(nèi)主要表達(dá)TLR4和CD14，當(dāng)其在肝組織內(nèi)表達(dá)發(fā)生波動(dòng)可反映出內(nèi)毒素受體表達(dá)升高[11]。已知脂質(zhì)過氧化物和氧化應(yīng)激是造成非酒精性脂肪性肝炎二次損傷的主要原因，而脂質(zhì)氧化的參與遞質(zhì)內(nèi)毒素在其中起著重要作用。CD14在主要位于庫普弗細(xì)胞表面，內(nèi)毒素可通過CD14促進(jìn)庫普弗細(xì)胞激活，進(jìn)而促進(jìn)炎性反應(yīng)遞質(zhì)的分泌，如TNF-α[12]。TNF-α作為肝臟疾病發(fā)展過程中的一個(gè)關(guān)鍵控制因子，與肝損傷有著密切的關(guān)系。酒精性肝硬化患者體內(nèi)的TNF-α和其受體-P75，-55表達(dá)均顯著增加，且與其患病的嚴(yán)重程度有關(guān)[13]。而當(dāng)將小鼠體內(nèi)TNF-αR1被敲除后，發(fā)現(xiàn)乙醇引發(fā)的肝損傷較對照組顯著減輕，且TNF-αR1是TNF-α的激活劑，證實(shí)TNF-α在酒精性脂肪性肝炎發(fā)病中具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α是非酒精性脂肪性肝炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵遞質(zhì)，ob/ob小鼠高脂喂養(yǎng)并給予抗-TNF-α抗體，實(shí)驗(yàn)4周后對肝組織具有明顯的改善作用，且肝炎指標(biāo)降低，IR和脂肪酸均減少[14]。因此，研究藥物對非酒精性脂肪性肝炎內(nèi)TNF-α表達(dá)的影響，有利于判斷藥物對非酒精性脂肪性肝炎的影響。

內(nèi)毒素不但對肝細(xì)胞具有直接毒性，而且可與結(jié)合蛋白相結(jié)合，如CD14和TLR4受體結(jié)合后能促使庫普弗細(xì)胞被激活后，促進(jìn)核因子-κB等轉(zhuǎn)錄因子活化，進(jìn)而促進(jìn)各種化學(xué)因子和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄合成、釋放，誘導(dǎo)肝損傷[15]。據(jù)報(bào)道，TNF-α不僅可介導(dǎo)內(nèi)毒素生物學(xué)效應(yīng)，且可誘導(dǎo)多種遞質(zhì)的協(xié)同作用，進(jìn)而促使內(nèi)毒素的多種生物學(xué)效應(yīng)被擴(kuò)大，致使肝損害[16]。Bondeva等[17]發(fā)現(xiàn)，337例老年人中，約有21.5%患者患有內(nèi)毒素血癥，血清中的內(nèi)毒素含量與體質(zhì)量指數(shù)、三酰甘油水平正相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，非酒精性脂肪性肝炎患者的小腸內(nèi)細(xì)菌出現(xiàn)過度生長現(xiàn)象的同時(shí)，血清內(nèi)TNF-α表達(dá)水平也伴隨著升高[18]。在脂肪性肝炎的研究中發(fā)現(xiàn)，肝臟內(nèi)出現(xiàn)CD14表達(dá)增強(qiáng)，血清內(nèi)TNF-α表達(dá)上調(diào)等現(xiàn)象，間接表明非酒精性脂肪性肝炎與內(nèi)毒素肝損傷具有相關(guān)性。

綜上所述，附子理中湯可降低非酒精性脂肪性肝炎大鼠內(nèi)毒素及其受體表達(dá)。

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（2019-05-29收稿?責(zé)任編輯：楊覺雄）