趙志敏 黃愷 沈麗 劉成海 葉偉成

摘要?目的：探討歐當(dāng)歸內(nèi)酯A調(diào)節(jié)纖維化肝臟NO釋放的抗肝纖維化作用機(jī)制。方法：40只Wistar大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A 3 mg/kg組、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A 6 mg/kg組，每組10只。以四氯化碳（CCl4）與高脂低蛋白飲食復(fù)合因素誘導(dǎo)肝纖維化模型，連續(xù)6周。藥物觀察組于造模第4周腹腔注射給藥至結(jié)束。觀察肝組織炎性反應(yīng)及膠原沉積、eNOS表達(dá)及MDA、SOD、NO、NOS水平。體外以800 μmol/L氯化鈷作用于SK-HEP-1細(xì)胞24 h誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧損傷，藥物處理后觀察細(xì)胞活力、vWF表達(dá)、上清及胞內(nèi)NO水平。結(jié)果：與模型組比較，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A各組肝細(xì)胞變性和炎性反應(yīng)壞死有所減輕，纖維化改善;高劑量組SOD和MDA顯著改善，NO和NOS降低，eNOS陽(yáng)性表達(dá)下降（P<0.05）。體外實(shí)驗(yàn)顯示，藥物干預(yù)后細(xì)胞活力得到改善，vWF平均熒光強(qiáng)度減弱，NO釋放顯著改善（P<0.05）。結(jié)論：歐當(dāng)歸內(nèi)酯A具有抗肝纖維化的作用，其機(jī)制可能與抗脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，改善內(nèi)皮細(xì)胞功能，調(diào)節(jié)NO釋放有關(guān)。

關(guān)鍵詞?肝纖維化;歐當(dāng)歸內(nèi)酯A;內(nèi)皮細(xì)胞;一氧化氮;機(jī)制

Abstract?Objective：To explore the effects of levistilide A on anti-hepatic fibrosis mechanism of regulating the release of NO from fibrotic liver. Methods：A total of 40 Wistar rats were randomly divided a control group， a model group， a levistilide A 3 mg/kg group and a levistilide 6 mg/kg group， with 10 rats in each group. The liver fibrosis model was induced by a combination of carbon tetrachloride （CCl4） and a high-fat and low-protein diet for 6 consecutive weeks. The drug treatment group was given intraperitoneal injection to the end on the 4th week of modeling. Liver tissue inflammatory reaction and collagen deposition， eNOS expression and MDA， SOD， NO， NOS levels were observed. In vitro， 800 μmol/L cobalt chloride was applied to SK-HEP-1 cells for 24 h to induce cell hypoxia. After drug treatment， cell viability， vWF expression， supernatant and intracellular NO levels were observed. Results：Compared with those in the model group， the degeneration and inflammatory necrosis of Levistilide A in each group were reduced， and the fibrosis was improved; the high-dose group SOD and MDA significantly improved， NO and NOS decreased， and the positive expression of eNOS decreased （P<0.05）. In vitro experiments showed that cell viability was improved after drug intervention， the average fluorescence intensity of vWF was weakened， and the release of NO was significantly improved （P<0.05）. Conclusion：Levistilide A can inhibit liver fibrosis， the mechanism may be related to Levistilide A， anti-lipid peroxidation， and regulate the release of NO.

Keywords?Liver fibrosis; Levistilide A; Endothelial cell; Nitric oxide; Mechanism

中圖分類(lèi)號(hào)：R285.5文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.19.004

肝纖維化存在于大多數(shù)慢性肝臟疾病過(guò)程中，肝組織內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)過(guò)度增生與沉積導(dǎo)致肝臟組織結(jié)構(gòu)異常改變，并影響肝臟正常生理功能，是慢性肝病過(guò)程中一種可逆的肝組織損傷過(guò)度修復(fù)反應(yīng)[1]。血管病理改變與纖維化的進(jìn)展和消退密切相關(guān)。內(nèi)皮細(xì)胞損傷、毛細(xì)血管化是纖維化發(fā)生的早期事件和原因之一。研究表明，NO通路與血管損傷、活化、增殖、功能紊亂等相關(guān)且影響纖維化逆轉(zhuǎn)[2]。歐當(dāng)歸內(nèi)酯A具有抗肝纖維化作用，可改善肝竇毛細(xì)血管化，但對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷及功能的作用尚不清楚，本研究通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步研究歐當(dāng)歸內(nèi)酯A調(diào)節(jié)纖維化肝臟NO釋放的抗肝纖維化作用機(jī)制。

1?材料與方法

1.1?材料

1.1.1?動(dòng)物?Wistar大鼠，雄性40只，清潔級(jí)，體質(zhì)量（145±15）g。由中國(guó)科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（許可證號(hào)：2008001615261，倫理審批號(hào)：PZSHUTCM18113012），飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度18～22 ℃，濕度55%～65%，以12/12 h為光暗周期飼養(yǎng)。

1.1.2?細(xì)胞?人內(nèi)皮細(xì)胞（SK-HEP-1購(gòu)自ATCC）為人內(nèi)皮來(lái)源的腹水瘤細(xì)胞，具備肝竇內(nèi)皮的某些特性[3]，常規(guī)培養(yǎng)于含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液，5% CO2及飽和濕度的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，細(xì)胞隔天換液，每2～3 d傳代1次。

1.1.3?藥物?歐當(dāng)歸內(nèi)酯A，購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司，批號(hào)：161024，純度：>98%。

1.1.4?試劑與儀器?CCl4（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)：10006480）、橄欖油溶液（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)：69018028）、甲醛溶液（國(guó)藥化學(xué)試劑公司，貨號(hào)：10010018）、二甲苯（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，貨號(hào)：10023418）。六水合氯化鈷（CoCl2·6H2O，Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：C8661）、甲瓚（MTT）（Sigma公司，美國(guó)，貨號(hào)：M5655）。MEM干粉（GIBCOTM公司，美國(guó)，貨號(hào)：1543170）、胎牛血清（Bovogen公司，澳大利亞，貨號(hào)：1710B）;DMSO（Amresco公司，美國(guó)，貨號(hào)：0231）;4%多聚甲醛（北京鼎國(guó)生物技術(shù)公司，貨號(hào)：AR-0211）;NO熒光探針、細(xì)胞核染色液（DAPI）、抗兔FITC熒光二抗（碧云天生物技術(shù)研究所，貨號(hào)：S0019、C1002、P0186）。兔來(lái)源血管血友病因子（Von Willebrand Factor，vWF）抗體（Abcam公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab6994）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（Endothelial nitric oxide synthase，eNOS）抗體（Abcam公司，美國(guó)，貨號(hào)：ab76198）。移液器（Eppendorf公司，德國(guó)，型號(hào)：Research plus）;超純水系統(tǒng)（Millipore公司，美國(guó)，型號(hào)：Direct-Q3）;轉(zhuǎn)移脫色搖床（海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司，型號(hào)：TS-8）;高溫高壓滅菌消毒鍋（HIRAYAMA公司，日本，型號(hào)：HVE-50）;生物安全柜（青島海爾特種電器有限公司，型號(hào)：HR50-IIA2）;微孔板分光光度計(jì)（BioTek公司，美國(guó)，型號(hào)：MQX200R）;倒置顯微鏡（Olympus公司，日本，型號(hào)：IX70）;CO2培養(yǎng)箱（Eppendorf公司，德國(guó)，型號(hào)：Galaxy 170S）、高內(nèi)涵篩選分析儀（Thermo Scientific有限公司，美國(guó)，型號(hào)：ArrayScan VTI）。

1.2?方法

1.2.1?分組給藥與動(dòng)物模型制備?40只大鼠隨機(jī)分為4組：正常組、模型組、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A低劑量組、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A高劑量組，每組10只。除正常組外，其他各組大鼠均在無(wú)菌條件下由皮下注射CCl4，首次劑量為100%CCl4溶液0.5 mL/kg大鼠體質(zhì)量，后40%CCl4橄欖油溶液（40%CCl4+60%橄欖油）3 mL/kg大鼠體質(zhì)量，2次/周，連續(xù)注射9周。藥物觀察組于造模后第5周開(kāi)始分別給予歐當(dāng)歸內(nèi)酯A高劑量6 mg/（kg·d）、歐當(dāng)歸內(nèi)酯A低劑量3 mg/（kg·d）腹腔注射。

1.2.2?取材?實(shí)驗(yàn)結(jié)束，于肝組織最大葉切割組織塊3塊，0.5 cm×0.5 cm×0.3 cm大小，其中2塊放入包埋框，4%甲醛溶液固定，脫水、包埋成石蠟組織塊，使用4 μm切片;其余肝組織分裝，-80 ℃保存。肝組織二甲苯、多級(jí)乙醇脫蠟至水，進(jìn)行HE、天狼猩紅和eNOS免疫組化染色。OlympusBX40顯微鏡下100倍、200倍觀察。Image-pro Express6.3軟件攝片，并對(duì)天狼猩紅染色片進(jìn)行半定量分析。

1.2.3?肝組織丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量、超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）活性、一氧化氮（Nitric Oxide，NO）含量和一氧化氮合酶（Nitric Oxide Synthase，NOS）活性?肝組織MDA含量采用TBA法測(cè)定;SOD活性采用羥胺法測(cè)定;肝組織NO含量，采用硝酸還原酶法測(cè)定;肝組織NOS活性采用比色法測(cè)定。

1.2.4?細(xì)胞模型制備及藥物添加?1）細(xì)胞模型制備：每孔8 000個(gè)細(xì)胞接種于96孔板，待細(xì)胞密度為70%左右，加入含氯化鈷的培養(yǎng)液（氯化鈷終濃度800 μmol/L），每孔100 μL，設(shè)空白對(duì)照（0.5%FBS）組，孵育24 h。藥物在80 μmol/L范圍內(nèi)設(shè)6個(gè)濃度梯度確定對(duì)SK-HEP-1細(xì)胞的最大無(wú)毒范圍（與不加藥組比存活率>90%），根據(jù)最大無(wú)毒濃度再分設(shè)3個(gè)濃度梯度分別作用于細(xì)胞模型。各藥物與細(xì)胞共孵育24 h同時(shí)添加氯化鈷溶液。2）MTT法檢測(cè)：細(xì)胞接種于96孔板，長(zhǎng)至亞單層，棄原培養(yǎng)液，換為各藥物成分培養(yǎng)液，100 μL/孔，4～6個(gè)復(fù)孔，孵育24 h。棄藥物培養(yǎng)液，加入0.5 mg/mL MTT工作液，孵育4 h。可見(jiàn)藍(lán)紫色結(jié)晶，小心吸棄工作液，加入DMSO 100 μL/孔，至充分溶解，在微孔板掃描分光光度計(jì)上測(cè)定吸光度OD490。

1.2.5?免疫熒光法?藥物孵育結(jié)束后，棄培養(yǎng)液，每孔加入50 μL 4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗滌，以0.5% Triton X-100孵育10 min，5%BSA/PBS 37 ℃封閉30 min后加入一抗（抗vWF抗體1∶100，稀釋在3%BSA/PBS中）37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后，加入熒光二抗（1∶100，稀釋在3%BSA/PBS中）37 ℃孵育1 h，PBS洗滌后，滴加DAPI染核5 min，PBS洗滌，Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader采集圖像，Cellomics Cell Health Profiling BioApplication Software對(duì)圖像進(jìn)行分析。

1.2.6?熒光探針?lè)?細(xì)胞接種于96孔板，長(zhǎng)至亞單層，棄原培養(yǎng)液，換為各藥物成分培養(yǎng)液，100 μL/孔，4個(gè)復(fù)孔，孵育24 h。棄藥物培養(yǎng)液，原位裝載NO探針，100 μL/孔。37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20～40 min。PBS洗3次。使用495 nm激發(fā)波長(zhǎng)，515 nm發(fā)射波長(zhǎng)，Thermo scientific varioskan flash光譜掃描多功能讀數(shù)儀上檢測(cè)。

1.2.7?Griess法?收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清，96孔板每空加50 μL，在各孔中加入50 μL室溫Griess Reagent I，然后各孔中加入50 μL Griess Reagent II，酶標(biāo)儀540 nm波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。

1.3?統(tǒng)計(jì)學(xué)方法?采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差用（±s）表示。組間比較使用單因素方差分析。纖維化等級(jí)資料采用Ridit分析，免疫組化半定量分析采用image-pro plus 6.1圖像分析軟件。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2?結(jié)果

2.1?歐當(dāng)歸內(nèi)酯A對(duì)大鼠肝組織炎性反應(yīng)與膠原沉積的影響?HE染色可見(jiàn)正常組肝小葉與肝細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整;模型大鼠肝組織可見(jiàn)肝細(xì)胞腫大變圓，脂肪空泡變性明顯，肝細(xì)胞散在壞死，成纖維細(xì)胞大量增生，匯管區(qū)及纖維間隔內(nèi)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。與模型組比較，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A低劑量與高劑量組肝細(xì)胞變性和炎性反應(yīng)壞死有所減輕。

天狼猩紅染色可見(jiàn)正常組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，僅在匯管區(qū)有極少量膠原沉積;模型組可見(jiàn)大量膠原纖維沉積，部分形成纖維間隔，嚴(yán)重者偶可見(jiàn)假小葉形成;與模型組比較，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A低劑量和高劑量組膠原沉積減少，高劑量組肝纖維化分級(jí)評(píng)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1，表2。

2.2?歐當(dāng)歸內(nèi)酯A對(duì)CCl4肝纖維化大鼠肝組織MDA、SOD、NO、NOS的影響?與正常組比較，模型組SOD顯著降低，MDA顯著增高（P<0.01）;與模型組比較，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A低劑量組MDA顯著降低（P<0.01），高劑量組SOD和MDA均顯著改善（P<0.05或P<0.01）。與正常組比較，模型組NO、NOS顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A低劑量組NO顯著降低（P<0.05），高劑量組NO和NOS均顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)圖2。

2.3?歐當(dāng)歸內(nèi)酯A對(duì)CCl4肝纖維化大鼠肝組織eNOS表達(dá)的影響?肝組織免疫組織化學(xué)染色及半定量分析顯示，與正常組比較，模型組肝組織eNOS光密度顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A高劑量組eNOS光密度顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)圖3。

2.4?歐當(dāng)歸內(nèi)酯A對(duì)SK-HEP-1細(xì)胞毒性及缺氧損傷模型細(xì)胞活力的影響?歐當(dāng)歸內(nèi)酯A設(shè)6個(gè)濃度：0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L、20 μmol/L、40 μmol/L、80 μmol/L，藥物作用24 h，根據(jù)MTT結(jié)果，選擇與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異，且存活率>90%的濃度為最大無(wú)毒濃度，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A對(duì)SK-HEP-1細(xì)胞最大無(wú)毒濃度為10 μmol/L。在最大無(wú)毒范圍內(nèi)設(shè)3個(gè)濃度梯度組用于缺氧損傷的細(xì)胞，同時(shí)設(shè)正常和模型對(duì)照組，MTT結(jié)果顯示，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A在2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L時(shí)對(duì)SK-HEP-1細(xì)胞氯化鈷損傷模型細(xì)胞活力均有保護(hù)作用。圖4。

2.5?歐當(dāng)歸內(nèi)酯A對(duì)SK-HEP-1缺氧損傷模型細(xì)胞vWF表達(dá)的影響?vWF免疫熒光染色顯示，與正常組比較，模型組熒光強(qiáng)度顯著升高（P<0.01）;與模型組比較，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A（2.5 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L）對(duì)vWF熒光強(qiáng)度有不同程度的降低（P<0.01）。見(jiàn)圖5。

2.6?歐當(dāng)歸內(nèi)酯A對(duì)SK-HEP-1缺氧損傷模型細(xì)胞NO水平的影響?Griess法檢測(cè)細(xì)胞上清NO結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組上清NO水平明顯升高（P<0.01）;與模型組比較，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A能夠顯著降低氯化鈷損傷模型SK-HEP-1細(xì)胞上清NO（P<0.05或P<0.01）。熒光探針?lè)z測(cè)胞內(nèi)NO顯示，與對(duì)照組比較，模型組NO表達(dá)明顯降低（P<0.05）;與模型組比較，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A 10 μmol/L組NO表達(dá)明顯升高（P<0.01）。見(jiàn)圖6。

3?討論

慢性肝病過(guò)程中血管生成和血管活性物質(zhì)（NO等）的表達(dá)改變、內(nèi)皮功能障礙、神經(jīng)激素失調(diào)和全身炎性反應(yīng)狀態(tài)在調(diào)節(jié)肝硬化體內(nèi)病理失衡和異常血管生成反應(yīng)方面發(fā)揮著不同的作用[4]。慢性肝損傷可導(dǎo)致肝竇內(nèi)皮功能障礙，內(nèi)皮細(xì)胞損傷、毛細(xì)血管化是纖維化發(fā)生的早期事件和原因之一。肝竇內(nèi)皮細(xì)胞存在于肝竇內(nèi)壁，具有獨(dú)特的窗孔結(jié)構(gòu)[5]，有利于促進(jìn)肝細(xì)胞氧代謝，增強(qiáng)肝細(xì)胞與外界的物質(zhì)交換;缺氧可使肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷發(fā)生表型改變[6]，vWF表達(dá)增加，窗孔結(jié)構(gòu)破壞或消失，同時(shí)細(xì)胞功能障礙，NO等合成釋放改變;任其發(fā)展將進(jìn)一步加重肝臟疾病如纖維化并形成難以逆轉(zhuǎn)的血管病理。歐當(dāng)歸內(nèi)酯A來(lái)源于中藥當(dāng)歸、川芎等，研究報(bào)道其具有抑制肝星狀細(xì)胞增殖作用[7]，我們前期研究發(fā)現(xiàn)，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A可顯著改善CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝組織纖維化程度，抑制TGF-β1誘導(dǎo)的LX-2細(xì)胞活化;抑制肝竇毛細(xì)血管化，抑制ECGs誘導(dǎo)的肝竇內(nèi)皮細(xì)胞增殖等作用[8]。本研究在此基礎(chǔ)上，通過(guò)體內(nèi)外研究進(jìn)一步探討歐當(dāng)歸內(nèi)酯A調(diào)節(jié)纖維化肝臟NO釋放的抗肝纖維化作用機(jī)制，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示歐當(dāng)歸內(nèi)酯A可有效抑制CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化，與前期結(jié)果一致。

脂質(zhì)過(guò)氧化是指在自由基的攻擊下，不飽和脂肪酸發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)，從而生成一系列活性氧的復(fù)雜過(guò)程[9]，可造成器官、組織、細(xì)胞損傷。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化的終產(chǎn)物之一，其含量可反映組織中脂質(zhì)過(guò)氧化程度。SOD是機(jī)體清除自由基的主要酶，SOD活性高低反映肝組織清除自由基的能力[10]。本研究使用的CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化動(dòng)物模型具有脂質(zhì)過(guò)氧化損傷特點(diǎn)[11]，模型組MDA顯著升高，SOD顯著下降，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A可以升高SOD水平，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化損傷具有調(diào)節(jié)作用。

內(nèi)皮細(xì)胞損傷時(shí)細(xì)胞功能變化主要體現(xiàn)在NO的合成釋放，vWF是細(xì)胞損傷的主要標(biāo)志物。NO具有神經(jīng)遞質(zhì)，信使等功能，既是一種強(qiáng)大的血管擴(kuò)張劑和細(xì)胞保護(hù)因子，也是細(xì)胞毒作用介導(dǎo)物;NOS是調(diào)節(jié)NO生物合成的重要因素。文獻(xiàn)報(bào)道，肝損傷可引起血清及肝組織中NO顯著升高，引起毒性作用，如抑制線(xiàn)粒體有氧呼吸、抑制肝細(xì)胞蛋白合成以及生成具有肝細(xì)胞毒性的過(guò)氧化亞硝酸鹽離子介導(dǎo)免疫性肝損傷。NO還可增加肝臟的血流量從而降低肝臟有氧代謝，從而發(fā)揮一定的保護(hù)作用[12]。CCl4誘導(dǎo)的急性或慢性肝纖維化動(dòng)物模型中可觀察到血清NO及肝組織NOS活性明顯升高[13-14]。我們研究結(jié)果顯示，模型鼠肝組織NO和NOS顯著升高，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A可顯著降低NO水平和NOS活性，提示對(duì)NO整體釋放具有調(diào)節(jié)作用。eNOS主要存在于內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞，在肝纖維化和肝硬化肝組織都有表達(dá)[15]。本研究結(jié)果表明，在CCl4誘導(dǎo)的肝纖維化模型中，肝組織eNOS明顯升高，提示損傷導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生和釋放NO功能發(fā)生改變，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A治療后，隨著纖維化的改善肝組織eNOS表達(dá)顯著減少。氯化鈷化學(xué)誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧損傷是體外研究常用的技術(shù)方法，廣泛應(yīng)用于神經(jīng)細(xì)胞、癌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞缺氧研究[16]。體外實(shí)驗(yàn)我們采用氯化鈷誘導(dǎo)具有肝竇內(nèi)皮細(xì)胞特點(diǎn)的SK-HEP-1細(xì)胞建立缺氧損傷模型，損傷后細(xì)胞vWF表達(dá)顯著升高，上清NO水平升高，胞內(nèi)NO下降，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A可以降低vWF表達(dá)及上清NO水平，胞內(nèi)NO上升，提示該藥對(duì)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用。

綜上所述，歐當(dāng)歸內(nèi)酯A可抑制CCl4大鼠肝纖維化，減輕脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，降低肝組織NO和NOS水平，下調(diào)eNOS表達(dá);其抗肝纖維化作用機(jī)制可能與保護(hù)肝竇內(nèi)皮細(xì)胞缺氧損傷，調(diào)節(jié)NO釋放有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[1]中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)肝病專(zhuān)業(yè)委員會(huì).肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南（2019年版）[J].臨床肝膽病雜志，2019，35（7）：1444-1449.

[2]Marrone G，Russo L，Rosado E，et al.The transcription factor KLF2 mediates hepatic endothelial protection and paracrine endothelial-stellate cell deactivation induced by statins[J].J Hepatol，2013，58（1）：98-103.

[3]Cogger VC，Arias IM，Warren A，et al.The response of fenestrations，actin，and caveolin-1 to vascular endothelial growth factor in SK Hep1 cells[J].Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2008，295（1）：G137-G145.

[4]Shenoda B，Boselli J.Vascular syndromes in liver cirrhosis[J].Clin J Gastroenterol，2019，12（5）：387-397.

[5]Desroches-Castan A，Tillet E，Ricard N，et al.Bone Morphogenetic Protein 9 Is a Paracrine Factor Controlling Liver Sinusoidal Endothelial Cell Fenestration and Protecting Against Hepatic Fibrosis[J].Hepatology，2019，70（4）：1392-1408.

[6]趙志敏，黃愷，孫鑫，等.基于肝竇內(nèi)皮細(xì)胞損傷評(píng)價(jià)黃芪來(lái)源成分的防護(hù)作用[J].中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2017，27（3）：155-157，后插5-后插6.

[7]Lee TF，Lin YL，Huang YT.Studies on antiproliferative effects of phthalides from Ligusticum chuanxiong in hepatic stellate cells[J].Planta Med，2007，73（6）：527-534.

[8]Zhao ZM，Liu HL，Sun X，et al.Levistilide A inhibits angiogenesis in liver fibrosis via vascular endothelial growth factor signaling pathway[J].Exp Biol Med（Maywood），2017，242（9）：974-985.

[9]Eltahir HM，Nazmy MH.Esomeprazole ameliorates CCl4 induced liver fibrosis in rats via modulating oxidative stress，inflammatory，fibrogenic and apoptotic markers[J].Biomed Pharmacother，2018，97：1356-1365.

[10]孫家昌，孫嫵弋，厲歆然，等.不同濃度四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型的比較[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)，2018，38（4）：255-260.

[11]陳國(guó)中，朱飛葉，俞忠明.化痰行瘀湯對(duì)肝纖維化大鼠治療作用及對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的影響研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，43（9）：935-939，944.

[12]余嬌，王偉.多烯磷脂酰膽堿對(duì)急性肝損傷患者血清NO、NOS水平的影響[J].肝臟，2018，23（3）：269-270.

[13]張博，謝云亮.紫草多糖對(duì)CCl4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究[J].現(xiàn)代免疫學(xué)，2018，38（2）：135-139.

[14]倪若愚，易建華，曾令蘭，等.慢性乙型肝炎肝組織內(nèi)NO合成酶及其意義[J].中華肝臟病雜志，1996，4（3）：145-147.

[15]劉銘.在肝硬化形成過(guò)程中eNOS和iNOS在肝腸組織的表達(dá)及其意義[D].太原：山西醫(yī)科大學(xué)，2007.

[16]王君妍，葉潔瑜，梁恩瑜，等.血小板生成素通過(guò)PI3K/AKT通路防止CoCl2誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)雜志，2018，26（2）：528-534.

（2020-09-10收稿?責(zé)任編輯：王明）