張 飛，李 越，畢丁仁，王喜亮*

（1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院、動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖北武漢 430070；2.河南龍鳳山農(nóng)牧股份有限公司，河南駐馬店 463000）

當(dāng)前抗生素在規(guī)模養(yǎng)殖過程中的長(zhǎng)期大量使用導(dǎo)致病原體的耐藥性、肉食品中的獸藥殘留、和環(huán)境污染，尋找抗生素替代品是畜牧研究人員的當(dāng)務(wù)之急。益生菌作為抗生素極具競(jìng)爭(zhēng)力的替代品，其對(duì)斷奶仔豬的作用效果已被廣泛報(bào)道，通常引入益生菌可以彌補(bǔ)腸道內(nèi)有益微生物的不足，提高或恢復(fù)仔豬抗疾病的能力，使仔豬獲得更好的營(yíng)養(yǎng)消化吸收和利用的能力，進(jìn)而提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能[1-3]，但益生效果顯著的菌株仍然不足，更多的優(yōu)良菌株待開發(fā)。本課題組從仔豬小腸內(nèi)容物中分離出的植物乳桿菌LPZ 菌株，已證實(shí)能顯著提高小鼠結(jié)腸內(nèi)微生物種類的多樣性和緩解炎癥，改善小鼠腸道的健康[4]。因此，本試驗(yàn)旨在研究該菌對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、免疫性能、抗氧化能力和糞中揮發(fā)性脂肪酸（VFA）的影響，為植物乳桿菌LPZ 在畜牧生產(chǎn)中應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌及藥物準(zhǔn)備 試驗(yàn)開始前從-80℃冰箱取出凍存的植物乳桿菌LPZ 菌株（本實(shí)驗(yàn)室分離并保藏）于37℃完全融化，置于渦旋儀混勻，再按5%接種量取菌液于MRS 培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。然后在6 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心10 min，去上清液收集離心沉積物。將收集的沉積物加入復(fù)配保護(hù)劑，用振蕩器振蕩均勻，制成菌懸液。再將其盛入冷凍平皿中，4℃冰箱平衡30 min，移入-20℃冰箱60 min，然后置于-80℃冰箱60 min，再在冷凍真空干燥機(jī)上-60℃冷凍干燥14 h，保存于-20℃冰箱中。冷凍干燥后的植物乳桿菌LPZ 用生理鹽水復(fù)活，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，用脫脂奶粉稀釋到濃度1×1010CFU/g。試驗(yàn)期間植物乳桿菌LPZ 以凍干粉形式添加，根據(jù)豬的采食量每7 d 拌一次料。

抗生素為飼料工業(yè)中常用的土霉素鈣預(yù)混劑（甘肅瑞和祥生物科技有限公司）和吉他霉素預(yù)混劑（無錫正大生物股份有限公司），有效成分含量分別為20%和50%，添加量分別為1 000 mg/kg 和100 mg/kg。前期研究[5-6]發(fā)現(xiàn)，斷奶仔豬每天補(bǔ)充濃度109～1010CFU 植物乳桿菌能有最佳的生產(chǎn)性能且預(yù)防仔豬腸道細(xì)菌性感染效果最佳，本試驗(yàn)選擇每千克飼料添加800 mg 含量為1×1010CFU/g 的植物乳桿菌LPZ 凍干粉開展益生效果評(píng)估試驗(yàn)。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及飼喂管理 試驗(yàn)在河南龍鳳山農(nóng)牧股份有限公司確山豬場(chǎng)進(jìn)行，選取日齡（26±2）d、體重（7.92±0.16）kg 的健康斷奶仔豬96 頭，按照體重與公母各半的原則將仔豬隨機(jī)分為3 個(gè)組，每個(gè)組包含4 個(gè)重復(fù)（欄），每個(gè)重復(fù)8 頭仔豬，試驗(yàn)期28 d。試驗(yàn)設(shè)空白對(duì)照組、抗生素組和LPZ 組，其中空白對(duì)照組仔豬飼喂基礎(chǔ)日糧，抗生素組在基礎(chǔ)日糧的基礎(chǔ)上添加抗生素（含土霉素鈣200 mg/kg、吉他霉素50 mg/kg），LPZ 組在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上添加800 mg/kg 植物乳桿菌LPZ 凍干粉。試驗(yàn)飼糧參照 《豬營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)》（NRC 2012）推薦量進(jìn)行配制。試驗(yàn)日糧全部為粉料?；A(chǔ)日糧及營(yíng)養(yǎng)成分含量見表1。

試驗(yàn)仔豬飼養(yǎng)在半側(cè)漏縫地板上，自動(dòng)通風(fēng)和溫控，舍內(nèi)溫度設(shè)置25℃。仔豬自由采食，自由飲水。每天07:00、17:00 飼喂2 次，保證料槽不斷料，同時(shí)觀察試驗(yàn)仔豬的健康狀況，并做好記錄。試驗(yàn)期內(nèi)定期清掃糞便、消毒、驅(qū)蟲、免疫等同試驗(yàn)場(chǎng)內(nèi)其他豬群。

1.3 動(dòng)物樣品采集 在試驗(yàn)開始后的第15 天和第29 天早上從每個(gè)重復(fù)中取1 頭接近平均體重的豬進(jìn)行前腔靜脈采血，每頭采5 mL，迅速裝到促凝管中，先置于37℃恒溫水浴箱1 h，然后置于4℃冷藏箱2 h，待血清析出后，3 000 r/min 冷凍離心15 min，使用移液器吸取血清分裝，-20℃保存，用于分析血液指標(biāo)。在試驗(yàn)開始后的第1 天和第 28 天15:00，每個(gè)欄隨機(jī)挑2 頭健康仔豬，無菌收集直腸內(nèi)容物，將其放入50 mL 螺口管中，并迅速放入-20℃的冰箱保存，后期采用氣相色譜儀測(cè)定糞便中乙酸、丙酸和丁酸的含量。

1.4 測(cè)定指標(biāo)

1.4.1 生產(chǎn)性能指標(biāo) 試驗(yàn)期間以重復(fù)為單位準(zhǔn)確測(cè)定和記錄每日飼料添加量和剩余量，并計(jì)算試驗(yàn)1～14 d、15～28 d 及1～28 d 的平均日采食量（ADFI）。試驗(yàn)正式開始的第1 天、第15 天及29 天07:30 以重復(fù)為單位稱重（仔豬保持空腹?fàn)顟B(tài)），計(jì)算各階段的平均日增重（ADG），再根據(jù)平均采食量計(jì)算耗料增重比（F/G）。每天上、下午分2 次觀察腹瀉情況，糞便按照三分制登記：0 分為正常；1 分為糞便軟落地成形；2 分為糞便呈流泄?fàn)盥涞夭怀尚停ㄖ卸雀篂a）；3 分為糞便呈水樣噴射狀（重度腹瀉）。最后計(jì)算腹瀉率和腹瀉指數(shù)，腹瀉指數(shù)越高，代表腹瀉越嚴(yán)重。計(jì)算公式：

表1 試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分（風(fēng)干樣）

腹瀉率（%）=腹瀉頭次/（供試豬總頭數(shù)×試驗(yàn)天數(shù)）

腹瀉指數(shù)=糞便評(píng)分之和/供試豬總頭數(shù)

1.4.2 血清免疫指標(biāo)檢測(cè) 血清中IgA、IgM 和IgG 的檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）的方法，具體操作參照南京建成生物工程研究所試劑盒說明書。

1.4.3 血清抗氧化指標(biāo)測(cè)定 檢測(cè)血清中總抗氧化能力（T-AOC）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）、丙二醛（MDA），按南京建成生物工程研究所試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.4.4 糞便中揮發(fā)性脂肪酸的測(cè)定 從采集的斷奶仔豬直腸糞便樣品中取2～3 g 轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)，加入2 倍的超純水混合均勻，以10 000 r/min、4℃離心15 min，取離心好的糞便上清液1.5 mL，加入0.2 mL 8.2% 偏磷酸混合均勻，水浴30 min，10 000 r/min、4℃離心10 min，取上清液，氣象色譜法測(cè)定糞便中乙酸、丙酸和丁酸的濃度。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 處理后，采用SPSS 17.0 進(jìn)行方差分析，采用Duncan′s 法對(duì)平均值進(jìn)行多重比較，數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，以P＜0.05 為差異顯著的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物乳桿菌LPZ 對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響 從表2 可以看出，與對(duì)照組相比，添加植物乳桿菌LPZ 顯著提高了仔豬第28 天體重，并且顯著降低了15～28 d 和1～28 d 的F/G；而這些指標(biāo)與抗生素組差異不顯著。此外，抗生素組仔豬第14 天體重和ADG 顯著高于對(duì)照組，而1～14 d 的F/G 顯著低于對(duì)照組；但LPZ 組仔豬這些指標(biāo)與對(duì)照組和抗生素組差異不顯著。其他指標(biāo)在3 個(gè)組間差異不顯著。

表2 植物乳桿菌LPZ 對(duì)斷奶仔豬采食量、日增重和飼料轉(zhuǎn)化率的影響

從表3 可以看出，雖然LPZ 組仔豬腹瀉指數(shù)和腹瀉率高于抗生素組仔豬（P＜0.05），但與對(duì)照組相比，日糧添加植物乳桿菌LPZ 后仔豬腹瀉指數(shù)和腹瀉率均降低（P＜0.05）。

表3 植物乳桿菌LPZ 對(duì)斷奶仔豬腹瀉的影響

2.2 植物乳桿菌LPZ 對(duì)斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響從表4 可以看出，與對(duì)照組和抗生素組相比，添加植物乳桿菌LPZ 提高了第14 天 IgA、IgM 和IgG 水平及第28 天 IgA 和IgG 的水平（P＜0.05），但這些指標(biāo)在對(duì)照組和抗生素組間差異不顯著。此外，LPZ 組第28 天IgM 水平高于抗生素組（P＜0.05），但對(duì)照組與植物乳桿菌LPZ 組和抗生素組差異不顯著。

表4 植物乳桿菌LPZ 對(duì)斷奶仔豬血清抗體水平的影響 g/L

2.3 植物乳桿菌LPZ 對(duì)斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響 從表5 可以看出，對(duì)照組和抗生素組仔豬第14 天T-AOC 和SOD 水平、第28 天 T-AOC 和MDA 水平差異不顯著，但與對(duì)照組相比，植物乳桿菌LPZ 組仔豬第14 天 T-AOC 和SOD 水平以及第28 天 T-AOC 水平升高（P＜0.05），MDA 水平降低（P＜0.05）。此外，植物乳桿菌LPZ 組仔豬第14 天 MDA 水平低于對(duì)照組和抗生素組仔豬（P＜0.05）。

2.4 植物乳桿菌LPZ 對(duì)斷奶仔豬糞便中VFA 的影響 從表6 可以看出，與對(duì)照組相比，添加植物乳桿菌LPZ提高了第14 天乙酸和第28 天仔豬糞便中丁酸含量（P＜0.05）；與飼喂含抗生素組相比，添加植物乳桿菌LPZ 提高了第14 天和第28 天仔豬糞便中乙酸含量（P＜0.05），提升了第28天乙酸、丙酸、丁酸含量（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 植物乳桿菌LPZ 對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能的影響 日糧添加益生菌可以改善仔豬生長(zhǎng)性能，通過對(duì)67 個(gè)試驗(yàn)合計(jì)4 122 頭豬進(jìn)行梳理，發(fā)現(xiàn)日糧中添加益生菌顯著提升平均日增重29.9 g/d，并且顯著降低了F/G 約0.096[7]。給正常斷奶仔豬飼喂包含乳酸菌的益生菌可以獲取更高的采食量、ADG 和更好的轉(zhuǎn)化率[8]。給斷奶仔豬灌服或飼喂植物乳桿菌能顯著提高ADG，顯著降低F/G[9]。本試驗(yàn)中添加植物乳桿菌LPZ 也顯著提高了試驗(yàn)結(jié)束時(shí)仔豬體重并降低了F/G，原因可能是該菌株源自仔豬腸道內(nèi)，更容易在仔豬腸道內(nèi)定殖，比其他來源植物乳桿菌更容易發(fā)揮其益生作用。

表5 植物乳桿菌LPZ 對(duì)斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響

表6 植物乳桿菌LPZ 對(duì)斷奶仔豬糞便中VFA 的影響 mmol/L

產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌是斷奶仔豬腹瀉的主要感染源，約占全世界每年死亡仔豬的50%[10]。大腸桿菌形成細(xì)菌脫羧氨基酸產(chǎn)生有毒的胺，刺激腸道導(dǎo)致腹瀉發(fā)生，而日糧添加益生菌可以降低斷奶仔豬腹瀉率。研究表明，益生菌可以阻止大腸桿菌的增殖，進(jìn)而阻止胺的產(chǎn)生[1]；益生菌也可以通過抑制病原體中的毒素表達(dá)來實(shí)現(xiàn)對(duì)動(dòng)物的保護(hù)，減少腹瀉發(fā)生[11]；益生菌還可以通過促進(jìn)豬體內(nèi)有益的胃腸道菌群的生長(zhǎng)，降低腸道致病性感染和腹瀉的發(fā)生率[12]。不同菌株的植物乳桿菌對(duì)仔豬腸道細(xì)胞的完整性有保護(hù)作用，能抑制有害菌對(duì)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，還能夠緩解脂多糖等引起的腸道細(xì)胞損傷[13]。本課題組早期在小鼠炎癥模型上的研究表明，植物乳桿菌LPZ 可以促進(jìn)小鼠腸道健康，使腸道內(nèi)的微生物多樣化，抑制腸道內(nèi)病原菌的活性，并能改善腸道的穩(wěn)定性[4]。本試驗(yàn)中仔豬飼料添加植物乳桿菌LPZ后仔豬腹瀉指數(shù)和腹瀉顯著下降，可能原因是該菌株能夠提升仔豬腸道健康，進(jìn)而強(qiáng)化了仔豬抗腹瀉的能力。

3.2 植物乳桿菌LPZ 對(duì)斷奶仔豬血清免疫指標(biāo)的影響免疫球蛋白是動(dòng)物體內(nèi)的一類非特異性免疫分子，血液中主要的免疫球蛋白有IgA、IgM 和IgG 3 種，其中IgA 的作用是阻止致病菌黏附至黏膜，以及抵擋致病菌侵襲；IgM 是B 細(xì)胞最早產(chǎn)生的一類免疫球蛋白，在初次免疫應(yīng)答中發(fā)揮著主要作用；IgG 主要在體液免疫應(yīng)答中發(fā)揮作用，在機(jī)體抵抗細(xì)菌和病毒中發(fā)揮重要作用。益生菌可以通過刺激動(dòng)物機(jī)體產(chǎn)生細(xì)胞因子刺激B細(xì)胞分泌IgA，增加IgG 的分泌，活化輔助性T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等對(duì)機(jī)體進(jìn)行調(diào)節(jié)[14-15]。研究表明，乳酸菌類益生菌進(jìn)入機(jī)體后，活化腸黏膜內(nèi)的相關(guān)淋巴組織，促使分泌型免疫球蛋白分泌量增加，提高免疫識(shí)別能力，并誘導(dǎo)T 細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子，最后通過淋巴細(xì)胞再循環(huán)而活化全身免疫系統(tǒng)，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體的非特異性和特異性免疫功能[16]。仔豬日糧添加復(fù)合益生菌可以顯著提高血液中IgA 和IgG 含量，增強(qiáng)生長(zhǎng)豬免疫功能，并提高了生長(zhǎng)性能[17]。同樣，仔豬日糧中添加植物乳桿菌能提升IgG、IgA 和白細(xì)胞介素2 的水平，降低白細(xì)胞介素4 水平[18]。本試驗(yàn)中添加植物乳桿菌LPZ 到仔豬日糧中顯著提高了仔豬體內(nèi)IgA、IgG 水平，說明植物乳桿菌LPZ 能夠通過刺激機(jī)體IgA、IgG 的分泌來提高免疫功能。

3.3 植物乳桿菌LPZ 對(duì)斷奶仔豬血清抗氧化指標(biāo)的影響 動(dòng)物機(jī)體抗氧化性能通過T-AOC 體現(xiàn)，T-AOC 是由活性氧清除非酶促抗氧化系統(tǒng)和酶促抗氧化系統(tǒng)（如GSH-Px、SOD、CAT 等酶）組成[19]。MDA 是動(dòng)物機(jī)體生物膜受氧自由基時(shí)產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化物分解產(chǎn)物，對(duì)細(xì)胞具有毒性，MDA 含量直接反映機(jī)體內(nèi)氧自由基的代謝情況，間接反映機(jī)體細(xì)胞的損傷程度[20]。研究表明，喂嗜酸乳桿菌FT28 仔豬紅細(xì)胞過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性顯著提高[21]。Li 等[22]在小鼠模型上的研究表明，植物乳桿菌C88 通過顯著改善抗氧化指數(shù)（包括MDA 水平，SOD、GSH-Px 和T-AOC 活性）可以顯著提升D-半乳糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激小鼠的抗氧化能力。Wang 等[23]在斷奶仔豬日糧中添加植物乳桿菌ZLP001 菌株改善了飼料的轉(zhuǎn)化率，增加了抗氧化酶的含量，降低了血清中MDA 濃度。本試驗(yàn)在斷奶仔豬日糧中添加植物乳桿菌LPZ 顯著提高了第14 天和第28天仔豬血液內(nèi)T-AOC 和SOD 水平，顯著降低血液內(nèi)MDA 水平。眾多研究表明，益生菌提升機(jī)體抗氧化能力主要是通過抗氧化酶系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)，益生菌有自己的酶系統(tǒng)，最著名的就是超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶系統(tǒng)。Kullisaar 等[24]研究表明，發(fā)酵乳桿菌E-3 和E-18 能夠表達(dá)Mn-SOD 以抵抗氧化應(yīng)激，而且這2 種乳酸桿菌菌株能夠產(chǎn)生大量的谷胱甘肽（GSH），發(fā)酵乳桿菌ME-3 中存在一個(gè)完整的谷胱甘肽系統(tǒng)。發(fā)酵乳桿菌還可以顯著增加肝臟和肌肉中SOD 和GSH 含量，并增強(qiáng)其抑制超氧化物陰離子生成的能力[25]。因此，本試驗(yàn)通過監(jiān)測(cè)仔豬血液抗氧化指標(biāo)的變化，發(fā)現(xiàn)日糧中添加植物乳桿菌LPZ 后抗氧化能力顯著增強(qiáng)，可能是體內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)在發(fā)揮作用。本試驗(yàn)說明植物乳桿菌LPZ 具有良好的抗氧化能力，這是土霉素鈣和吉他霉素等抗生素所不具備的。

3.4 植物乳桿菌LPZ 對(duì)斷奶仔豬糞便中VFA 的影響 短鏈脂肪酸作為腸道微生物代謝的主要產(chǎn)物，作為微生物調(diào)節(jié)因子和微生物與宿主相互作用的主要調(diào)節(jié)器，影響腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)和防御病原體入侵[26]，免疫系統(tǒng)成熟和調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)[27]。Mallo 等[28]在斷奶仔豬飼糧中添加乳酸菌顯著增加了回腸、盲腸和糞便中乳酸菌的數(shù)量，降低了大腸桿菌的數(shù)量。而Giang 等[8]指出，乳酸菌能夠抑制病原菌生長(zhǎng)的主要原因是乳酸菌在機(jī)體腸道產(chǎn)生有機(jī)酸，使腸道中有機(jī)酸含量升高，降低腸道的 pH，進(jìn)而抑制有害菌的生長(zhǎng)。研究表明，丁酸鹽和丙酸鹽還下調(diào)了沙門氏菌致病基因hilA和invF的表達(dá)，這些基因是沙門氏菌重要的轉(zhuǎn)錄激活因子[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，日糧中添加植物乳桿菌LPZ 顯著提高了第14 天仔豬糞便中乙酸和第28 天的丁酸含量。金三俊等[30]的研究也顯示，斷奶仔豬飼料中添加50 mL 復(fù)合微生態(tài)制劑后糞便中乙酸、丙酸和丁酸含量分別增加21.03%、41.08%和77.84%。本研究中添加植物乳桿菌仔豬糞便中VFA顯著降低可能與產(chǎn)脂肪酸的有益菌增多有關(guān)。Wang 等[31]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌ZLP001 處理組仔豬腸道產(chǎn)丁酸鹽的細(xì)菌Anaerotruncus 和Faecalibacterium 的豐度顯著增加，并且與糞便中的丁酸和乙酸濃度呈正相關(guān)。說明植物乳桿菌LPZ 也可以通過增加腸道內(nèi)VFA 的含量調(diào)節(jié)腸道健康，抑制有害菌的生長(zhǎng)，這也從另一方面說明了斷奶仔豬日糧中添加植物乳桿菌LPZ 后，腹瀉能夠顯著下降的原因。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，植物乳桿菌LPZ 菌株能夠提高斷奶仔豬生長(zhǎng)性能，降低腹瀉發(fā)生率，該菌株能夠提高機(jī)體免疫力和抗氧化能力，提升腸道短鏈脂肪酸的含量，在抗生素替代方面具有較好的應(yīng)用前景和推廣價(jià)值。