查星琴 ，成文敏，潘偉榮，李海昌，張 瑩，霍金龍，黃 英

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650201；2.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南昆明 650201；3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)云南省動(dòng)物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明 650201）

版納微型豬近交系（Banna Minipig Inbred Line，BMI）在發(fā)育、生理、解剖、病理、疾病發(fā)生等諸多方面與人類極其相似，是研究轉(zhuǎn)基因動(dòng)物、異種器官移植、生物醫(yī)學(xué)及豬基因組計(jì)劃中功能基因的理想實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型[1-4]。本實(shí)驗(yàn)室通過長期的統(tǒng)計(jì)、觀察和基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，BMI 在培育過程中，繁殖力較低的亞系精液品質(zhì)相對(duì)較差、畸形率較高。但常規(guī)的精液品質(zhì)指標(biāo)對(duì)于評(píng)估公豬的繁殖力具有一定局限性，從分子方面對(duì)精液品質(zhì)進(jìn)行選擇標(biāo)記，研究與精液品質(zhì)相關(guān)的基因，有利于快速和準(zhǔn)確地篩選精液，為公畜繁殖育種提供科學(xué)依據(jù)。

精漿蛋白是由哺乳類雄性動(dòng)物性腺、副性腺分泌的對(duì)精子細(xì)胞形成發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)功能的一類多功能蛋白。精子黏附蛋白家族（AQNl、AQN3、AWN、PSP-I和PSP-II）含量占精漿總蛋白的90% 以上，是公豬精漿蛋白的主要成分[5]，在精子獲能、頂體反應(yīng)、運(yùn)動(dòng)（超活化）及精卵融合中具有重要調(diào)控作用[5-9]。豬精漿蛋白-I（Porcine Seminal Protein-I，PSP-I）和豬精漿蛋白-II（Porcine Seminal Protein-II，PSP-II）是2 個(gè)主要的精子黏附蛋白成員，其含量占精漿總蛋白的50%以上，主要在精囊腺表達(dá)，在其他副性腺組織中僅有少量表達(dá)[10]。二者分子量為14～16 ku，序列同源性為45.2%，氨基酸序列中均含有1 個(gè)CUB 結(jié)構(gòu)域，分別由109 和116 個(gè)氨基酸殘基組成成熟肽。PSP-I 和PSP -II 主要以非共價(jià)異源二聚體形式存在于精漿中，主要參與生殖免疫調(diào)控、精子能動(dòng)性維持、精子膜完整性、精子線粒體活性、受精等一系列重要的生殖過程[11-12]。目前，對(duì)PSP-I 蛋白的研究鮮有報(bào)道，在BMI 上更是未見報(bào)道。本研究采用RT-PCR 方法克隆BMI 的PSP-I基因并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為深入研究BMIPSP-I基因的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑 采集活體去勢(shì)成年（15 月齡）BMI 不育公豬睪丸組織，經(jīng)液氮處理后，置于-80℃超低溫冰箱保存以備RNA 提取。本實(shí)驗(yàn)所用試劑DNA片段回收純化試劑盒購自全式金生物技術(shù)有限公司，逆轉(zhuǎn)錄酶XL（AMV）、DL2000、RT-PCR 一步法試劑盒、Competent Cell Preparation Kit、病毒總RNA/DNA 提取試劑盒（TaKaRaMiniBEST Viral DNA/RNA Extraction Kit Ver.3.0）、TaKaRa Ex TaqTMTaq 酶等均購自寶生物工程（大連）有限公司，pMD18-T 克隆載體和大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α購于TaKaRa 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 合成引物 下載GenBank 上豬的PSP-I基因的保守序列（基因登錄號(hào)：NM_213837），運(yùn)用Primer Premier5.0 和Oligo 6 軟件設(shè)計(jì)1 對(duì)特異性引物（F：5′-TCTCCAGGTGGACCCGAAATAT-3′，R：5′-TAGCAG GGAAGACAGGAAAGGC-3′），交上海生工有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增目的片段的大小約為420 bp。

1.2.2 RNA 的提取及cDNA 合成 稱取BMI 睪丸組織樣品約100 mg，依照RNA Plus（TaKaRa）公司相應(yīng)步驟提取總RNA，通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性，以檢測(cè)合格的總RNA 為模板，參考反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄體系：在20 μL 反應(yīng)體積中，加入2 μg（10 μL）的Total RNA 樣品、1 μL 的Oligo（dT）18（50 μmol/L）和1 μL 的dNTP（10 mmol/L）混合物后，輕輕混勻置于70℃孵育5 min 后，快速放在冰上冷卻；短暫離心后再加入4 μL 的5×first Buffer、2 μL 的DTT（0.1 mol/L）及1 μL 的recombiant RNase inhibitor，輕微吹打混勻，37℃孵育2 min，室溫下加入1 μL的reverse transcriptase M-MLV（200 U/ μL），稍微吹打?qū)⒏鹘M分混勻，37℃孵育10 min，最后53℃將其加熱1 h，94℃反應(yīng)5 min，終止反應(yīng)，儲(chǔ)存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3PSP-I基因PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系與程序 PCR 反應(yīng)總體系25 μL：1 μL DNA 模板（25 ng/ μL）、12.5 μL Premix Taq（5 U/μL）、上下游引物（10 pmol/μ L）各1 μL，加ddH2O 補(bǔ)足至 25 μL。PCR 擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火30 s，72℃延伸45 s，30 個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min。產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.2.4 PSP-I 基因克隆 采用DNA 純化回收試劑盒回收純化PCR 產(chǎn)物，取一份純化產(chǎn)物送上海生工有限公司直接進(jìn)行測(cè)序，另取一份純化后的目的片段連接到pMD18-T 克隆載體上在 l6℃下連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞并提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR 再擴(kuò)增和酶切鑒定后，篩選出陽性菌液送到上海生工生物技術(shù)有限公司序列測(cè)定。

1.2.5PSP-I基因序列的生物信息學(xué)分析 將測(cè)序得到的PSP-I基因編碼區(qū)序列采用Generunr 軟件進(jìn)行比對(duì)，人工校對(duì)預(yù)測(cè)出開放閱讀框；利用ExPaSyProtParam程序推測(cè)PSP-I基因編碼蛋白分子量、等電點(diǎn)、序列氨基酸的組成、總親水性和穩(wěn)定性；采用NCBI 數(shù)據(jù)庫中的nucleotide blast 軟件檢驗(yàn)核苷酸的序列；NetNGlyc 1.0 Server 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)N-糖基化位點(diǎn)；NetOGlyc 4.0 Server 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)O-糖基化位點(diǎn)；SignalP 4.1 Server預(yù)測(cè)信號(hào)肽序列；NetPhos 2.0 Server 預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)磷酸化位點(diǎn)；TMpred server 預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)域；ExPASy-PrtPram tool 參與編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析；SOPMA 參與蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1PSP-I基因擴(kuò)增結(jié)果 將PSP-I基因進(jìn)行擴(kuò)增，特異性片段為420 bp，經(jīng)電泳檢測(cè)，目的基因片段大小與預(yù)期片段大小一致（圖1）。

2.2PSP-I基因序列分析 登錄http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/，將所得測(cè)序結(jié)果與GenBank 中下載的豬PSP-I基因序列進(jìn)行比對(duì)，如圖2 所示，有2 處突變位點(diǎn)，分別在第80 bp 和352 bp 處，其中第80 位堿基G 突變?yōu)锳，第352 位堿基A 突變?yōu)镚，將測(cè)序結(jié)果推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank 中下載的豬PSP-I 蛋白進(jìn)行比對(duì)（圖3），第27 位氨基酸由I（異亮氨酸）突變?yōu)閂（纈氨酸）。

2.3PSP-I基因序列生物信息學(xué)分析 用ExPaSyProtParam程序預(yù)測(cè)PSP-I基因編碼蛋白分子量為8.588 9 ku，理論等電點(diǎn)為8.64；在氨基酸組成上，酸性氨基酸（Asp+Glu）有8 個(gè)；堿性氨基酸（Lys+Arg）有10 個(gè)；其中亮氨酸（Leu，占12.7%）、絲氨酸（Ser，占11.4%）、甘氨酸（Gly，占11.4%）等含量較高。

PSP-I 蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為34.99，屬于穩(wěn)定蛋白；脂溶指數(shù)為90.00，總的親水性平均系數(shù)（Grand Average Of Hydropathicity，GRAVY）為-0.241，具有疏水性。使用SignalP 4.1 對(duì)PSP-I 蛋白進(jìn)行預(yù)測(cè)，表明PSP-I 蛋白沒有信號(hào)肽位點(diǎn)（圖4）；用NetNGly 1.0進(jìn)行預(yù)測(cè)的結(jié)果表明，在第17 位有一個(gè)N-糖基化位點(diǎn)是NLTC（圖5）。

NetPhos2.0 預(yù)測(cè)表明，PSP-I 蛋白存在8 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中5 個(gè)絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)（A51、A52、A62、A67、A77）、0 個(gè)蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)、3 個(gè)酪氨酸（Tyr）活性位點(diǎn)（A7、A24、A69）（圖6）。

用SOPMA 方法預(yù)測(cè)的PSP-I 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)如圖7 所示，參與α-螺旋的氨基酸有9 個(gè)，含量為11.39%；有30 個(gè)氨基酸參與延伸鏈，占37.97%；15個(gè)氨基酸可能參與β-轉(zhuǎn)角，占18.99%；25 個(gè)氨基酸可能參與無規(guī)則卷曲，占31.65%。以上分析可以推測(cè)，無規(guī)則卷曲是PSP-I 蛋白的主要結(jié)構(gòu)。

3 討 論

精子黏附蛋白基因家族是由豬、馬、牛、羊等有蹄類動(dòng)物生殖道分泌的一類新穎的蛋白家族，能結(jié)合磷脂、寡糖、絲氨酸蛋白酶和硫酸多糖的配基發(fā)揮多種功能。其既是精漿蛋白中起重要作用的蛋白，也是占最大比重的蛋白[10]，分子量一般為12.16 ku，呈松散附著在精子細(xì)胞表面。該蛋白家族在公豬成熟精子中的mRNA表達(dá)豐度很高[13]，在受精過程的各個(gè)階段參與精子獲能和頂體反應(yīng)、調(diào)節(jié)精子活力、在雌性生殖道形成精子庫等多種生物功能[5,14]。公豬精漿中的AQNl、AWN、AQN3、PSP-I、PSP-II 5 個(gè)精子黏附蛋白家族成員已被分離鑒定。PSP-I 和PSP Ⅱ是公豬精液中含量最高的蛋白，為公豬生殖道組織特異性蛋白，揭示該基因的表達(dá)具有組織特異性。射精后PSP-I 和PSP-II 在精液中形成異二聚體復(fù)合物，在公畜生殖道內(nèi)可維持精子穩(wěn)定性，在母畜生殖道內(nèi)可促進(jìn)精子獲能；在精子冷凍中可修補(bǔ)解凍后損傷的精子膜，提高精子活力。Centurion 等[15]報(bào)道PSP-I/PSP-II（純化）二聚體可對(duì)高倍稀釋的精子起到保護(hù)作用，在生理溫度下可在5 h 內(nèi)保持精子的運(yùn)動(dòng)能力、活力和線粒體活性。以上研究表明豬PSP-I、PSP-II 和PSP-I/PSP-II 蛋白在受精過程中發(fā)揮重要作用，但目前對(duì)PSP-I、PSP-II 和PSP-I/PSP-II 蛋白的研究較少，對(duì)于PSP-I、PSP-II 和PSP-I/PSP-II 蛋白在繁殖育種中所能發(fā)揮的作用缺乏全面的評(píng)價(jià)。因此，克隆分析PSP-I、PSP-II 和PSP-I/PSP-II 蛋白具有重要意義。

本研究克隆得到BMI 的PSP-I基因序列長度為420 bp，其核苷酸序列中包含241 bp 的編碼區(qū)和179 bp的非編碼區(qū)，經(jīng)基因序列比對(duì)后，編碼區(qū)有1 個(gè)堿基發(fā)生突變，其中第80 位堿基G 突變?yōu)锳，將測(cè)序結(jié)果推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank 中下載的豬PSP-I 蛋白進(jìn)行比對(duì)，第27 位氨基酸由I（異亮氨酸）突變?yōu)閂（纈氨酸）。但這個(gè)堿基的突變是否引起PSP-I 蛋白結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變，從而造成版納微型豬近交系弱精的產(chǎn)生還有待深入研究。

PSP-I 蛋白質(zhì)屬于穩(wěn)定蛋白，具有疏水性。PSP-I蛋白沒有跨膜信號(hào)肽位點(diǎn)，在第17 位有1 個(gè)N-糖基化位點(diǎn)是NLTC。本實(shí)驗(yàn)中PSP-I 蛋白存在8 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中5 個(gè)絲氨酸（Ser）磷酸化位點(diǎn)（A51、A52、A62、A67、A77）、0 個(gè)蘇氨酸（Thr）磷酸化位點(diǎn)、3 個(gè)酪氨酸（Tyr）活性位點(diǎn)（A7、A24、A69）。在BMI PSP-I 蛋白序列中只存在3 個(gè)潛在的酪氨酸磷酸化位點(diǎn)，推測(cè)可能由于酪氨酸磷酸化位點(diǎn)較少，導(dǎo)致對(duì)蛋白的修飾和調(diào)控較低，PSP-I 蛋白的活性較弱，才引起B(yǎng)MI 繁殖力低下，具體原因仍需進(jìn)一步的深入研究。