陳雅麗，趙祜，呂東，李偉，張宏斌

(1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；2.甘肅省祁連山水源涵養(yǎng)林研究院，甘肅 張掖 734000；3.祁連山特有植物繁育及推廣國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，甘肅 張掖 734000；4.甘肅省祁連山特有珍稀樹種保護(hù)繁育工程研究中心，甘肅 張掖 734000)

青海云杉(PiceacrassifoliaKom.)為松科云杉屬喬木，是中國(guó)特有樹種，分布于我國(guó)青海、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古等省(區(qū))，其適應(yīng)性強(qiáng)，具有耐低溫、耐旱、耐瘠薄的特性，是高山區(qū)森林更新和荒山造林的重要樹種[1-2].青海云杉木材材質(zhì)優(yōu)良，可作建筑、橋梁、家具及木纖維工業(yè)原料等用材，也是重要的用材樹種[3-4].國(guó)內(nèi)開展青海云杉的遺傳改良工作是從20世紀(jì)70年代開始，相繼在各分布區(qū)內(nèi)建立了母樹林及種子園[5]，目前對(duì)于青海云杉種子園育種資源的研究多集中在無(wú)性系的開花散粉規(guī)律[6-8]、木材和種實(shí)等表型性狀的變異[9-11]和半同胞子代測(cè)定[12-14]等的研究上，基于分子水平分析種子園遺傳多樣性的研究較少.利用DNA分子標(biāo)記技術(shù)研究物種的遺傳多樣性可以直接從分子層面反映遺傳多態(tài)性，除卻了環(huán)境因素的干擾，而且DNA分子標(biāo)記可以提供大量的遺傳變異信息，是群體遺傳關(guān)系研究的有力工具[15].胡楊[16]利用ISSR分子標(biāo)記研究了青海云杉無(wú)性系種子園的遺傳多樣性，結(jié)果表明種子園的遺傳多樣性水平較高，袁行棟[17]利用SSR分子標(biāo)記對(duì)青海云杉無(wú)性系的遺傳多樣性的研究也得出相同結(jié)論，但二者對(duì)于無(wú)性系間的親緣關(guān)系的分析不全面，沒有反映不同種源無(wú)性系的親緣關(guān)系.育種資源親緣關(guān)系的明確至關(guān)重要，對(duì)開展雜交實(shí)驗(yàn)、種子園無(wú)性系配置等具有重要指導(dǎo)意義，能最大限度地避免近交衰退，保證高世代種子園的品質(zhì)穩(wěn)固提高，是種子園可持續(xù)多世代改良的前提[18].

本研究以張掖龍渠青海云杉無(wú)性系種子園為研究對(duì)象，采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)，對(duì)青海云杉無(wú)性系種子園的育種資源進(jìn)行了遺傳多樣性及個(gè)體間、種源間的親緣關(guān)系等研究，以期為青海云杉遺傳改良策略的制定及高世代種子園的建設(shè)奠定理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

甘肅省張掖市龍渠青海云杉無(wú)性系種子園位于祁連山腳黑河出山口東側(cè)的沖擊扇上，N 38°48′41″，E 100°13′42″，海拔1 700 m，年降水量為193.0 mm，年蒸發(fā)量為1 653.0 mm，年均氣溫7.4 ℃，最高氣溫33.4 ℃，最低氣溫-26.5 ℃，相對(duì)濕度51%，無(wú)霜期152 d，日照時(shí)間2 435.6 h.1985年建園，建園材料來源于祁連山區(qū)的西水、連城、哈溪、古城、東大山、大黃山、大河口、隆暢河、祁連等種源地，種子園采用完全隨機(jī)排列設(shè)計(jì)，品字型栽植，株行距5.0 m×5.0 m.

本研究對(duì)種子園中108個(gè)無(wú)性系進(jìn)行了分析，各種源無(wú)性系數(shù)量見表1，采集每個(gè)無(wú)性系單株當(dāng)年生健康針葉，與硅膠干燥保存于塑料袋中，分別編號(hào)，帶回實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱內(nèi)保存.

1.2 DNA的提取

用天根植物基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取青海云杉無(wú)性系基因組DNA，用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳初步檢測(cè) DNA質(zhì)量，用微量分光光度計(jì)(Nano Drop ND-1000)檢測(cè)DNA的濃度、純度，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

表1 試驗(yàn)材料信息

1.3 引物篩選及PCR擴(kuò)增

從60對(duì)來自挪威云杉(PiceaabiesKarst.)的SSR引物[19]中篩選出10對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定性好、具有多態(tài)性的SSR引物用于本研究，各引物詳細(xì)信息見表2.引物由Sangon公司合成，20 μL SSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系包括：模板DNA(5～10 ng/μL)1.0 μL、d NTP(10 mmol/L)0.45 μL、引物(10 μmol/L)0.25 μL、Mg2+(25 mmol/L)2 μL、TaqDNA聚合酶(5 U/μL)0.8 μL、10×PCR緩沖液2 μL、HPLC超純水13.25 μL.PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，44個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸3 min；4 ℃保存.擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，在紫外燈下拍照記錄.

表2 10對(duì)SSR引物信息

1.4 電泳結(jié)果統(tǒng)計(jì)與分析

參考電泳圖譜中的分子量標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù) PCR 產(chǎn)物條帶大小從小到大依次用大寫英文字母A、B、C等表示，確定每個(gè)個(gè)體的基因型.用POPGENE 32軟件計(jì)算觀測(cè)等位基因(Na)、有效等位基因(Ne)、Shannon信息指數(shù)(I)、Nei多樣性指數(shù)(H)、觀測(cè)雜合度(Ho)、期望雜合度(He)、近交指數(shù)(F)、遺傳分化系數(shù)(Fst)、基因流(Nm)等遺傳參數(shù).通過GenAlEx 6.5軟件進(jìn)行分子方差(AMOVA)分析.使用Powermarker V3.25計(jì)算基于等位基因頻率的Nei’ 1983遺傳距離，采用非加權(quán)組平均法(UPGMA)對(duì)Nei’ 1983遺傳距離進(jìn)行聚類，用MEGV7.0.14查看聚類結(jié)果，根據(jù)聚類結(jié)果分析親緣關(guān)系情況.

2 結(jié)果與分析

2.1 青海云杉基因組DNA提取結(jié)果

使用天根植物基因組DNA提取試劑盒提取青海云杉無(wú)性系的基因組DNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果如圖1所示，可以看出條帶的亮度較好，比較集中，用微量分光光度計(jì)(Nano Drop ND-1000)檢測(cè)DNA的濃度為75 ng/μL左右，純度D值(260/280)約為1.8，符合進(jìn)行SSR-PCR反應(yīng)的要求.

圖1 青海云杉無(wú)性系基因組DNA電泳結(jié)果Figure 1 Genomic DNA electrophoresis results of P.crassifolia clones

2.2 SSR擴(kuò)增結(jié)果及SSR位點(diǎn)多態(tài)性

利用10對(duì)SSR引物對(duì)108個(gè)青海云杉無(wú)性系進(jìn)行SSR-PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)后，結(jié)果如圖2所示，條帶清晰，多態(tài)性較好，對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如表3所示，共擴(kuò)增出50個(gè)等位基因，10個(gè)位點(diǎn)檢測(cè)到等位基因(Na)3～8個(gè)，平均為5個(gè)；有效等位基因(Ne)為1.212 8～5.843 3，平均為2.484 2；觀測(cè)雜合度(Ho)為0～0.500 0，平均為0.156 6；期望雜合度(He)為0.176 3～0.832 9，平均為0.515 4；Nei多樣性指數(shù)(H)為0.175 5～0.828 9，平均為0.512 9；Shannon信息指數(shù)(I)為0.347 8～1.876 0，平均為1.006 5.其中，EAC1F04位點(diǎn)的多態(tài)性水平最高，各項(xiàng)遺傳參數(shù)值均較高，對(duì)所研究的青海云杉無(wú)性系遺傳多樣性貢獻(xiàn)較大，相應(yīng)的，EAC6D01位點(diǎn)的多態(tài)性水平則最低.

圖2 引物EAC1C08對(duì)部分青海云杉無(wú)性系的擴(kuò)增圖譜Figure 2 The amplification pattern of part of P.crassifolia clones by primer EAC1C08

表3 基于SSR標(biāo)記的青海云杉無(wú)性系遺傳多樣性參數(shù)

2.3 不同種源遺傳多樣性差異

9個(gè)青海云杉種源的遺傳多樣性參數(shù)匯總?cè)绫?所示，觀測(cè)等位基因(Na)為2.0～3.4，西水(XS)種源的值最高，祁連(QL)種源的值最低，平均為2.6，平均有效等位基因(Ne)為1.902 3.觀測(cè)雜合度(Ho)為0.100 0～0.280 0，祁連(QL)種源的值最高，哈溪(HX)種源的值最低，平均為0.170 9；期望雜合度(He)為0.300 7～0.488 9，大河口(DHK)種源的值最高，哈溪(HX)種源的值最低，平均為0.400 3.Shannon 信息指數(shù)(I)的變化范圍為0.467 2～0.819 6，平均為0.656 1，Nei多樣性指數(shù)(H)的變化范圍為0.278 0～0.476 5，平均為0.376 1，兩者皆為古城(GC)種源的值最大，祁連(QL)種源的值最小，種源間數(shù)值相差較大，說明種源間遺傳多樣性水平差異較大.采用Shannon信息指數(shù)(I)、Nei多樣性指數(shù)(N)、期望雜合度(He)這幾個(gè)參數(shù)來度量9個(gè)青海云杉種源的遺傳多樣性水平，由大到小依次為古城(GC)、東大山(DDS)、西水(XS)、大河口(DHK)、連城(LC)、大黃山(DHS)、隆暢河(LCH)、哈溪(HX)、祁連(QL)種源.

表4 9個(gè)青海云杉種源的遺傳多樣性分析

2.4 不同種源間的遺傳分化

青海云杉9個(gè)種源的遺傳分化系數(shù)(Fst)和基因流(Nm)(表5)為0.281 6和0.637 8，表明種源間存在較高程度的遺傳分化，種源之間的基因交流不頻繁，容易發(fā)生遺傳漂變現(xiàn)象[20].

分子方差(AMOVA)分析結(jié)果(表6)表明84%的遺傳變異存在于個(gè)體間，只有16%來源于種源間.青海云杉個(gè)體間變異大于種源間，說明青海云杉個(gè)體間變異為主要變異.

表5 遺傳分化系數(shù)與基因流

由表5所示，10個(gè)SSR位點(diǎn)的近交系數(shù)(F)在0.013 7～1.000 0之間，平均值為0.681 0，表明種子園內(nèi)無(wú)性系純合子過量，雜合子較少.

表6 9個(gè)青海云杉種源的AMOVA分析

2.5 青海云杉育種資源親緣關(guān)系分析

2.5.1 不同種源間的親緣關(guān)系分析 計(jì)算9個(gè)青海云杉種源的遺傳距離，用UPGMA算法進(jìn)行聚類，得到種源間的聚類圖(圖1).根據(jù)聚類圖，可以看出9個(gè)種源大致分為2組，第1組為大黃山(DHS)、古城(GC)和哈溪(HX)種源，第2組為東大山(DDS)、西水(XS)、大河口(DHK)、連城(GC)、祁連(QL)和隆暢河(LCH)種源.由圖可知，大黃山(DHS)、古城(GC)和哈溪(HX)種源之間存在一定的親緣關(guān)系，古城(GC)和哈溪(HX)種源親緣關(guān)系更近；東大山(DDS)和西水(XS)種源親緣關(guān)系比較接近，它們和大河口(DHK)種源存在一定的親緣關(guān)系；連城(LC)和祁連(QL)種源的親緣關(guān)系比較接近；第2組中，隆暢河(LCH)種源與其他種源的親緣關(guān)系較遠(yuǎn).

圖3 青海云杉9個(gè)種源間親緣關(guān)系UPGMA聚類圖Figure 3 UPGMA clustering of relationship among the 9 provenances of P.crassifolia

2.5.2 個(gè)體間的親緣關(guān)系分析 基于108個(gè)青海云杉無(wú)性系間的Nei’ 1983遺傳距離進(jìn)行UPGMA聚類分析，得到108個(gè)個(gè)體的親緣關(guān)系圖譜(圖4).108個(gè)個(gè)體大致分為兩大組，基本與種源的聚類結(jié)果相一致：第1組中有29個(gè)無(wú)性系，大黃山(DHS)、古城(GC)和哈溪(HX)種源的無(wú)性系占75.9%；第2組中有79個(gè)無(wú)性系，東大山(DDS)、西水(XS)、大河口(DHK)、連城(GC)、祁連(QL)和隆暢河(LCH)種源的無(wú)性系占97.5%.聚類結(jié)果顯示無(wú)性系間存在逐步分化的關(guān)系，種源相同的無(wú)性系優(yōu)先聚在一起，種源聚類圖中某些種源親緣關(guān)系較近，在個(gè)體聚類圖中這些種源的無(wú)性系也大多聚為一類.

圖4 108個(gè)個(gè)體親緣關(guān)系UPGMA聚類圖Figure 4 UPGMA clustering of 108 individuals

3 討論與結(jié)論

青海云杉是個(gè)古老的樹種，擁有廣泛的分布范圍，已有研究表明，青海云杉天然群體具有較高的遺傳多樣性水平[21-22].本研究采用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)張掖龍渠青海云杉無(wú)性系種子園進(jìn)行了遺傳多樣性研究，結(jié)果共擴(kuò)增出了50個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，平均等位基因數(shù)(Na)為5，平均有效等位基因數(shù)(Ne)為2.484 2，平均觀測(cè)雜合度(Ho)為0.156 6，平均期望雜合度(He)為0.515 4，平均Nei多樣性指數(shù)(H)為0.512 9，平均Shannon信息指數(shù)(I)為1.006 5，表明青海云杉育種資源具有較高的遺傳多樣性水平，遺傳結(jié)構(gòu)優(yōu)良，可為高世代種子園的建設(shè)提供豐富的原材料.與其他基于SSR標(biāo)記的針葉樹遺傳多樣性的研究結(jié)果相比，青海云杉的遺傳多樣性低于同為云杉屬的粗枝云杉(PiceaasperataMast．)(Nei多樣性指數(shù)為0.707)[23]、天山云杉(Piceaschrenkiana)，Shannon信息指數(shù)為1.281 1[24]，高于華北落葉松(Larixprincipis-rupprechtiiMayr)(Shannon信息指數(shù)為0.712 7)[25]、白皮松(PinusbungeanaZucc.)(Shannon信息指數(shù)為0.401 0)[26]、油松(Pinustabuliformis)(Shannon信息指數(shù)為0.599)[27]，稍低于長(zhǎng)白落葉松(LarixolgensisHenry)(Shannon信息指數(shù)為1.020 3)[28]、樟子松(Pinussylvestrisvar.mongolica)，Shannon信息指數(shù)為1.034[29].

結(jié)合Shannon信息指數(shù)(I)、Nei多樣性指數(shù)(H)、期望雜合度(He)這幾個(gè)遺傳參數(shù)的值，古城(GC)、東大山(DDS)、西水(XS)種源的遺傳多樣性水平相對(duì)較高，隆暢河(LCH)、哈溪(HX)、祁連(QL)種源遺傳多樣性水平相對(duì)較低，但隆暢河(LCH)和祁連(QL)種源地的樣本數(shù)量較少(n=5)，容易存在“遺傳漂變”的影響，這2個(gè)種源地的遺傳多樣性水平還有待于進(jìn)一步研究.

青海云杉種源間存在較高程度的遺傳分化，遺傳分化系數(shù)(Fst)為0.281 6，基因流(Nm)為0.637 8，說明群體之間基因交流較少[30]，這也是導(dǎo)致種源之間遺傳分化水平較高的原因.孫雪新等[31]和李萍等[21]利用同工酶標(biāo)記分子研究結(jié)果表明青海云杉天然群體間的遺傳分化水平低，群體平均分化系數(shù)分別為0.023和0.064 3.王文峰[22]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)青海云杉天然群體遺傳多樣性研究的結(jié)果為群體間的遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.289 7、群體間基因流(Nm)為0.613 0，與本研究的結(jié)果相似.由此說明了利用不同的標(biāo)記研究青海云杉群體遺傳分化水平的結(jié)果有差異，而DNA分子標(biāo)記可以直接反應(yīng)植物在分子水平上的遺傳變異，因此得出的結(jié)果也更準(zhǔn)確.分子方差(AMOVA)分析結(jié)果顯示大部分的遺傳變異存在于個(gè)體間(84%)，王婭麗等[32-33]研究了青海云杉天然群體表型性狀和種實(shí)性狀的變異，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)了群體內(nèi)變異占主要地位(68.80%、72.82%).青海云杉無(wú)性系種子園平均近交系數(shù)值為0.681 0，純合子嚴(yán)重過量，說明種源內(nèi)部近交程度嚴(yán)重.

群體聚類分析發(fā)現(xiàn)，9個(gè)種源可分為2組，第1組為大黃山(DHS)、古城(GC)和哈溪(HX)種源，第2組為東大山(DDS)、西水(XS)、大河口(DHK)、連城(LC)、祁連(QL)和隆暢河(LCH)種源，其中有3對(duì)種源的親緣關(guān)系較近，他們分別是古城(GC)種源和哈溪(HX)種源、東大山(DDS)種源和西水(XS)種源、連城(LC)種源和祁連(QL)種源.據(jù)資料顯示，哈溪(HX)種源與古城(GC)種源在地理位置上相近，東大山(DDS)、西水(XS)和大河口(DHK)種源之間的地理位置相近，由此說明種源間親緣關(guān)系與地理距離存在相關(guān)性，與孫雪新等[31]、王婭麗等[33]、王文峰[22]的研究結(jié)果一致.個(gè)體間的聚類基本上也分為兩大組，與種源間聚類結(jié)果相對(duì)應(yīng)，種源相同的無(wú)性系多聚為一類.