李世瑛，張小麗，馬小軍，宋曉育，張禹，唐然

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070；2河南省汝陽縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 汝陽 471200)

小尾寒羊是我國肉裘兼用型綿羊品種，具有生長發(fā)育快、繁殖力強、性能遺傳穩(wěn)定、適應(yīng)性強的特點，已成為我國發(fā)展肉羊生產(chǎn)或培育雜交肉羊品種的優(yōu)良母本材料[1].舍飼是目前我國綿羊養(yǎng)殖的重要方式，但由于舍飼養(yǎng)殖常存在基礎(chǔ)設(shè)施薄弱、飼養(yǎng)密度較高、經(jīng)營管理粗放等問題，導(dǎo)致綿羊易發(fā)生各種疾病，其中乳房炎的發(fā)病率高達10%～20%[2].乳房炎主要致病菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和鏈球菌[3].Zecconi等[4]報道40%的母羊臨床乳房炎是由于金黃色葡萄球菌感染所造成的.細胞因子(cytokines，CKs)是一類具有生物活性的小分子蛋白或多肽的總稱，由免疫細胞(如單核細胞、巨噬細胞、T細胞等)和某些非免疫細胞(如血管內(nèi)皮細胞、表皮細胞、成纖維細胞等)合成和分泌，能夠誘導(dǎo)、促進和調(diào)節(jié)免疫細胞活化、增殖、分化和表達，并且對機體免疫應(yīng)答、免疫發(fā)生、免疫保護和免疫損傷效應(yīng)的產(chǎn)生發(fā)揮重要作用[5-6].其中對乳房炎起防御作用的細胞因子有白細胞介素(interleukin,IL)、干擾素(interferon,IFN)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等[7].目前研究表明，在金黃色葡萄球菌引起的奶牛乳房炎中，有IL-1β、IL-8、IL-12、IFN-γ和TNF-α等細胞因子[8]參與乳腺抗感染免疫.據(jù)報道在細菌性小鼠乳房炎模型中IL-1β、IL-12、IL-6及腫瘤壞死因子的表達均有升高[9].

近年來，奶牛金黃色葡萄球菌乳房炎已成為人們關(guān)注的熱點，然而對金黃色葡萄球菌感染引起的綿羊乳房炎則鮮有報道，為了研究金黃色葡萄球菌感染對綿羊血常規(guī)及血清細胞因子的影響，本試驗以金黃色葡萄球菌人工感染綿羊乳腺，建立綿羊乳房炎病理模型，通過動物血球分析儀測定金黃色葡萄球菌感染前后綿羊血常規(guī)指標變化情況，并利用qRT-PCR和ELISA方法檢測的金黃色葡萄球菌感染前后綿羊血清中細胞因子mRNA相對表達量及濃度的變化，分析金黃色葡萄球菌感染對綿羊血常規(guī)及外周血細胞因子的影響，以期為揭示細胞因子在綿羊乳房炎發(fā)病過程中的作用機制及金黃色葡萄球菌感染引起的乳房炎的臨床診斷提供基礎(chǔ)資料.

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

RNA提取試劑Trizol(Invitrogen，美國)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega，美國)；qRT-PCR試劑盒(Roche，瑞士)；ELISA檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)常規(guī)試劑；動物血球分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)；熒光定量PCR儀(Funglyn Biotech FTC-3000)；顯微照相裝置(DP71)(日本Olympus公司產(chǎn)品).

1.2 試驗動物及菌株

健康、泌乳期的小尾寒羊5只(年齡2～3歲，體質(zhì)量約36～40 kg)，購于甘肅省定西市某綿羊散養(yǎng)戶.致病性金黃色葡萄球菌由本實驗室自臨床型綿羊乳房炎患羊奶樣中分離、鑒定及保存的.

1.3 金黃色葡萄球菌的人工感染試驗

5只綿羊分別于金黃色葡萄球菌感染前(0 h)先用一次性負壓采血管經(jīng)頸靜脈采血，每只羊采血3份，一份抗凝血混勻后立即送往實驗室在1～1.5 h內(nèi)進行血常規(guī)的檢測，一份抗凝血低溫離心分離白細胞，置于液氮中保存；非抗凝血靜置后分離血清，-70 ℃保存.采血完成后，5只綿羊分別于一側(cè)乳頭管中注入0.5 mL(3×103cfu/mL)金黃色葡萄球菌菌液[10]，灌注后輕柔按摩數(shù)秒,使其分布均勻.各綿羊分別于金黃色葡萄球菌感染后12、24、36、48、72、96 h采血，方法同感染前.

1.4 血常規(guī)的檢測

抗凝血按照動物血球分析儀說明書操作步驟進行，測定金黃色葡萄球菌感染前(0 h)和感染后12、24、36、48、72 h及96 h綿羊血常規(guī)指標.

1.5 綿羊血液CKs表達分析

1.5.1 綿羊外周血白細胞CKs基因表達分析 利用Funglyn Biotech FTC-300熒光定量PCR系統(tǒng)對TNF-α、IFN-α、IL-16及IL-1β基因和β-actin內(nèi)參基因進行qRT-PCR分析.

1.5.2 引物設(shè)計和合成 根據(jù)GenBank公布的綿羊幾種細胞因子和β-actin的mRNA序列，采用Primer Premier5.0軟件設(shè)計引物，引物序列及擴增產(chǎn)物大小見表1.引物由天津金唯智生物科技有限公司合成.

表1 CKs和β-actin基因PCR擴增引物序列

1.5.3 綿羊外周血總RNA提取 分別取保存的感染組與對照組綿羊外周血白細胞，利用Trizol抽提綿羊外周血總RNA.

1.5.4CKs基因的RT-PCR擴增 總RNA 2 μg，Oligo(dT)18 primer 1 μL，加Nuclease-free Water至12 μL.65 ℃，5 min后立即放置于冰上.加5×Reaction Buffer 4 μL，RiboLock RNase Inhi-bitor 1 μL，10 mmol/L dNTP Mix 2 μL，Revert Aid M-MuLV RT 1 μL，總反應(yīng)體系20 μL.42 ℃，60 min，70℃，5 min終止反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA.

PCR反應(yīng)體系(25 μL)：2 μL cDNA產(chǎn)物，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各1.0 μL，去離子水8.5 μL.反應(yīng)條件：預(yù)變性94 ℃ 5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s(具體溫度見表1)，72 ℃ 30 s，以上反應(yīng)循環(huán)數(shù)35個，最后72 ℃ 10 min進行延伸，4 ℃保存.PCR擴增的產(chǎn)物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.5.5 qRT-PCR檢測綿羊外周血白細胞中CKsmRNA的表達 熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系(20 μL)：2 μL cDNA，10 μL FastStart SYBR Green Master，上、下游引物各0.5 μL，7 μL ddH2O.反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，退火15 s(具體溫度見表1)，72 ℃延伸30 s，45個循環(huán).設(shè)立NTC空白對照，重復(fù)3組，取平均Ct值，用相對定量2-ΔΔCt法分析結(jié)果.

1.5.6 血清中CKs濃度的檢測 按照ELISA試劑盒說明書操作步驟，利用間接ELISA法檢測對照組及感染組感染金黃色葡萄球菌后不同時間血清中TNF-α、IFN-α、IL-16及IL-1β的濃度.

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 血常規(guī)檢測結(jié)果

結(jié)果表明，綿羊在感染金黃色葡萄球菌12 h后，與對照組相比其外周血中白細胞總數(shù)顯著降低，在感染后24 h，極顯著降低(P<0.01)，而在感染后48 h，其白細胞總數(shù)接近健康動物正常數(shù)目，至感染后96 h時，顯著高于對照組(P<0.05).淋巴細胞數(shù)目和單核細胞數(shù)目在金黃色葡萄球菌感染后24 h顯著低于對照組(P<0.05)，隨后都表現(xiàn)出上升的趨勢，但與對照組相比差異不顯著.中性粒細胞總數(shù)隨著感染時間的變化，先下降后上升趨勢，但與對照組相比差異不顯著.紅細胞總數(shù)等其他生理指標在接菌后均無顯著變化(P>0.05，表2).

表2 綿羊乳腺金黃色葡萄球菌感染后血常規(guī)檢測結(jié)果

2.2 PCR擴增目的片段

將反轉(zhuǎn)錄好的cDNA作為模板，TNF-α、IFN-α、IL-16及IL-1β和內(nèi)參基因β-actin為特異性引物進行擴增， PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別在預(yù)期分子量處出現(xiàn)強弱不同的電泳條帶，如圖1所示.

1：IFN-α；2：TNF-α；3： IL-1β；4：IL-16；5：β-actin；M：DNA marker.圖1 細胞因子及β-actin PCR擴增產(chǎn)物Figure 1 Electrophoregram of CKs and β-actin PCR product

2.3 實時熒光定量PCR產(chǎn)物的特異性

qRT-PCR擴增結(jié)果顯示本試驗設(shè)計的特異引物擴增效果良好，溶解曲線只有一個特異性峰出現(xiàn)，說明擴增過程中無引物二聚體和非特異性產(chǎn)物出現(xiàn)(圖2).

圖2 CKs基因SYBR Green I Real-time PCR 擴增產(chǎn)物的熔解曲線Figure 2 The melting curves of CKs gene SYBR Green I Real-time PCR amplification products

2.4 CKs基因mRNA的相對表達量檢測結(jié)果

qRT-PCR檢測的結(jié)果表明金黃色葡萄球菌感染后12 h，綿羊血清中的TNF-α及IL-16mRNA的表達量較0 h組極顯著升高(P<0.01)，IFN-α及IL-1βmRNA的表達量較0 h組顯著升高(P<0.05)；在感染后36 h，細胞因子TNF-α、IL-16、IFN-α及IL-1βmRNA的表達量達到峰值，感染后48 h逐漸下降(圖3).

2.5 血清中CKs的濃度

由圖4可知，在感染金黃色葡萄球菌12 h后，綿羊血清中的IL-1β和IL-16的濃度開始顯著上升，感染24 h后血清中IFN-α和IL-16的濃度顯著高于0 h，IL-1β極顯著高于0 h；IFN-α和IL-16濃度在感染24 h后達到峰值，IL-1β和TNF-α于感染后36 h達到峰值；金黃色葡萄球菌感染48 h后血清中CKs的濃度開始下降，72 h后血清中IFN-α、IL-1β、IL-16和TNF-α 的濃度基本恢復(fù)正常.

圖3 金黃色葡萄球菌感染后血清中CKs基因mRNA相對表達量Figure 3 Relative mRNA expression of CKs gene i serum after S.aureus infected

圖4 感染金黃色葡萄球菌后血清中CKs的濃度Figure 4 The concentration of CKs in serum after S.aureus infected

3 討論

乳房炎是影響畜牧業(yè)發(fā)展的重要疾病之一，發(fā)病率居高不下.當病原微生物感染乳腺后，利用粘附因子在乳腺內(nèi)定殖，從而誘導(dǎo)乳腺局部和全身性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生大量活化的免疫細胞和細胞因子，免疫細胞和細胞因子進入乳腺并相互清除病原微生物[11-12].白細胞吞噬病原微生物，可特異性實現(xiàn)對機體的保護作用，淋巴細胞參與機體的免疫過程，具有吞噬、趨化和殺菌作用，而單核細胞能夠激活淋巴細胞的特異性免疫功能，促進淋巴細胞發(fā)揮免疫作用[13-14].在本試驗中，金黃色葡萄球菌感染后綿羊血液中白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和單核細胞都呈現(xiàn)出先下降后上升的趨勢，其原因可能是炎癥初期大量白細胞進入炎區(qū)，使全身循環(huán)血液中的白細胞總數(shù)降低，而隨著局部炎癥的改善，白細胞向乳腺趨化減少，以及機體白細胞儲備的釋放，導(dǎo)致外周血中白細胞總數(shù)逐漸升高.

金黃色葡萄球菌誘發(fā)的乳腺炎與多種炎性細胞因子有關(guān)，例如TNF-α 和IL-1β 等.TNF-α 作為具有調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫功能和代謝過程的細胞因子，是機體感染炎癥及免疫應(yīng)答體系和一系列病理生理過程的重要介質(zhì).IL-1β 能誘導(dǎo)TNF及其自身的分泌，并和TNF相互促進對方的釋放，在炎癥反應(yīng)中起協(xié)同作用[15].本研究顯示IL-1β 和TNF-α 在血清中的表達量逐漸升高，在感染后36 h達到峰值，之后，IL-1β 和TNF-α 呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，但還是高于0 h.余光濤[ 16 ]研究顯示，在大鼠乳腺感染金黃色葡萄球菌后，發(fā)現(xiàn)TNF-α 和IL-1β 都呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢.韓炎森[ 17]以金黃色葡萄球菌注射奶山羊，發(fā)現(xiàn)血清中TNF-α 較感染前呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢.其主要原因可能是金黃色葡萄球菌進入乳腺組織后，刺激機體單核巨噬細胞活化并產(chǎn)生大量 IL-1β 和TNF-α，引起乳腺組織局部浸潤和炎癥反應(yīng)，增加微血管壁通透性，激活中性粒細胞及內(nèi)皮細胞表面黏附受體，導(dǎo)致乳腺組織損傷.IL-16作為CD4+T細胞的配體，在T細胞活化、增殖以及成熟中發(fā)揮重要作用，還與IFN-α共同刺激單核細胞產(chǎn)生細胞因子，參與病原菌清除過程[18].本試驗檢測了細胞因子在血清中的表達，試驗結(jié)果表明，IL-16和IFN-α都是先上升后下降，幾乎恢復(fù)正常值，說明IL-16和IFN-α 也參與了炎癥的反應(yīng)過程.鄧珊等[19]運用ELISA 法檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清中 IFN-α 水平明，發(fā)現(xiàn)其水平顯著高于正常對照(P=0.003).Mc-fadden C等[20]研究發(fā)現(xiàn)慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者血漿中 IL-16、TNF-α和FIB水平顯著高于健康對照組(P<0.01)[20].也有研究報道：IL-16 在支氣管哮喘患者血清中呈現(xiàn)高水平表達，在哮喘整個病理過程中呈現(xiàn)正相關(guān)性[21].以上研究都與本研究結(jié)果一致.

4 結(jié)論

綿羊乳腺感染金黃色葡萄球菌后，血液中的白細胞、淋巴細胞、單核細胞和細胞因子(IFN-α、IL-1β、IL-16和TNF-α)參與炎癥反應(yīng)過程，且具有時間依賴性.