趙國棟,張 瀟,黃 鑫,成嘉璐,錢荷英,李 剛,徐安英

(1.江蘇科技大學(xué) 蠶業(yè)研究所/生物技術(shù)學(xué)院,鎮(zhèn)江 212100)(2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 蠶業(yè)研究所,鎮(zhèn)江 212100)

鱗翅目昆蟲家蠶(Bombyxmori)具有強(qiáng)大的吐絲結(jié)繭能力,一直以來被人類馴養(yǎng)從而發(fā)揮出巨大的經(jīng)濟(jì)價值和社會價值,目前也是生物研究中一種極為熱門的模式動物,是進(jìn)行生理生化、分子遺傳研究的重要模型[1-2]．

家蠶絲腺是天然的蛋白質(zhì)資源庫,能夠?yàn)樾Q絲蛋白的合成提供場所和物質(zhì)材料．根據(jù)其結(jié)構(gòu)和功能的不同,可以將家蠶絲腺分為吐絲管,前部絲腺(ASG)、中部絲腺(MSG)和后部絲腺(PSG)等[3]．家蠶絲蛋白主要由絲膠蛋白(主要在中部絲腺合成)和絲素蛋白(主要在后部絲腺合成)組成．在幼蟲各齡的眠期和蛻皮期,家蠶合成少量的絲蛋白,當(dāng)進(jìn)入五齡盛食期時,絲素蛋白,絲膠蛋白在家蠶體內(nèi)大量合成[4-6]．研究表明絲蛋白基因的表達(dá)涉及復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制,受到多個特異因子的調(diào)控,主要體現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄水平,目前已發(fā)現(xiàn)至少有6種轉(zhuǎn)錄因子參與到絲蛋白基因的表達(dá)調(diào)控中,分別是SGF-1、SGF-2、SGF-4、FMBP-1和FBF-A1[7-8]．一般認(rèn)為這些不同的蛋白結(jié)合因子通過結(jié)合絲蛋白基因上游相應(yīng)位點(diǎn),實(shí)現(xiàn)對絲蛋白基因表達(dá)的調(diào)控．

最初絲腺蛋白特異性轉(zhuǎn)錄因子FMBP-1(Fibroin-modulator-binding protein-1)、FMBP-2、FMBP-3被檢測到與絲蛋白基因內(nèi)含子元件結(jié)合,后來發(fā)現(xiàn)這些FMBP均與上游元件結(jié)合[9]．從FMBP-2、FMBP-3結(jié)合的蛋白中鑒定為BmFkh和POU-M1．BmFkh在中部絲腺和后部絲腺中均有表達(dá),是絲素蛋白和ser-1基因共同的調(diào)控元件[10-11]．POU-M1基因在包括絲腺在內(nèi)的許多組織中均有表達(dá),該基因可能是一種抑制子或者與其他因子協(xié)同發(fā)揮作用[12-13]．而FMBP-1被發(fā)現(xiàn)在四齡和五齡幼蟲攝食期的后部絲腺中含量較高,但在四齡蛻皮期的中部和后部絲腺中含量較低,推測其與絲蛋白基因的特異性表達(dá)密切相關(guān)[9]．

本研究以家蠶和野桑蠶以及不同絲量品種的家蠶為供試材料,利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測絲腺組織中FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平,比較其在不同品種中的轉(zhuǎn)錄水平差異,同時采用RNAi技術(shù)探究該基因在絲蛋白基因表達(dá)中發(fā)揮的作用,為進(jìn)一步研究絲蛋白基因的表達(dá)調(diào)控提供相關(guān)的理論基礎(chǔ)和數(shù)據(jù)支持．

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料與主要試劑

1.1.1 材料供試家蠶品種菁松、皓月和大造,均由江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所品種資源組保存并提供,野桑蠶來源于江蘇科技大學(xué)蠶業(yè)研究所桑園．在標(biāo)準(zhǔn)條件下用新鮮的桑葉飼養(yǎng),飼育溫度25℃±1℃,相對濕度 60%～75%,光照晝夜12 h交替．

1.1.2 主要試劑保幼激素(JHⅢ)購自美國Sigma-aldrich公司,總RNA抽提試劑盒TRIzol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒SuperScriptTMFirst-strand synthesis System for RT-PCR以及SYBR Premix Ex Taq試劑盒均購自寶生物工程(大連)有限公司．siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計并合成,序列為F:GCC GGU CGA UAU GAU ACA ATT;R:UUG UAU CAU AUC GAC CGG CTT．

1.2 方法

1.2.1 保幼激素溶液的配制及添食

先將保幼激素(JHⅢ)用95%乙醇溶解至50 μg/mL,使用時再用雙蒸水將其稀釋至10 ng/mL．將新鮮桑葉浸入保幼激素溶液5 s,自然晾干后添食家蠶5齡4 d幼蟲,以清水浸葉并晾干為對照處理．

1.2.2 家蠶絲腺總RNA的提取及cDNA第1鏈合成

將收集的各品種家蠶和野桑蠶五齡中期幼蟲絲腺置于預(yù)冷的研缽中,添加液氮研磨至粉末,加入Trizol提取組織的總RNA,-70℃保存?zhèn)溆茫崛〉目俁NA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠快速電泳檢測其完整性,并用酶標(biāo)儀測定其濃度．cDNA第1鏈用SuperScriptTMFirst-strand synthesis System for RT-PCR試劑盒合成,合成反應(yīng)50 μL體系包括:總RNA 1 μg,50 μmol/L Oligo(dT)16引物1 μL,5×M-MLV buffer 10 μL,10 mmol/L dNTP 2.5 μL,40 U/μL RNase Inhibitor 0.5 μL,200 U/μL M-MLV 1 μL;于42℃反應(yīng)1 h合成cDNA,70℃ 15 min滅活反轉(zhuǎn)錄酶,加RNAse H 后37℃ 20 min消化剩余的RNA,-20℃保存?zhèn)溆茫?/p>

1.2.3 引物設(shè)計

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的家蠶絲腺轉(zhuǎn)錄因子FMBP-1的編碼序列(登錄號:NM-001043504.1),采用Primer5.0軟件,按照熒光定量PCR引物的設(shè)計原則設(shè)計所需的引物,設(shè)計的引物序列如表1．引物由上海生工生物工程股份有限公司合成．

表1 Real-time PCR引物對Table 1 Primer pairs for Real-time PCR

1.2.4 實(shí)時熒光定量PCR

采用SYBR PrimeScriptTMRT-PCR試劑盒,在ABI Prism 7300型熒光定量PCR儀(美國,Applied Biosystems)上進(jìn)行測定,具體實(shí)驗(yàn)步驟按照說明書進(jìn)行,反應(yīng)體系為20 μL．反應(yīng)程序?yàn)?95 ℃變性1 min;隨后40個循環(huán):95 ℃ 15 s, 60 ℃ 31 s．反應(yīng)過程由測定儀軟件自動設(shè)定,每個樣品重復(fù)測定3次．

1.2.5 RNAi分析

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中獲得的家蠶絲腺轉(zhuǎn)錄因子FMBP-1的編碼序列,按照siRNA設(shè)計原則委托上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司生產(chǎn)．

選取生長一致的家蠶皓月幼蟲,在5齡第2 d開始分成實(shí)驗(yàn)組和對照組分別飼養(yǎng)．注射前饑餓1 h,放置冰上1 min,用50 μL微量注射器從幼蟲背面注射FMBP-1 siRNA,每頭注射5 μg,對照組注射同體積PBS,48 h后解剖收集實(shí)驗(yàn)組和對照組的中部絲腺和后部絲腺,并提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄成cDNA,利用qRT-PCR檢測RNAi后FMBP-1基因和絲蛋白基因的表達(dá)情況．

分別觀察并記錄對照組和實(shí)驗(yàn)處理組家蠶化蛹、結(jié)繭、化蛾階段的變化差異,并調(diào)查兩組家蠶繭層率．

1.3 數(shù)據(jù)處理

熒光定量RT-PCR的結(jié)果數(shù)據(jù)用實(shí)驗(yàn)儀器自帶的Sequence detection software version 1.3.1軟件處理,并參照J(rèn)an H Schefe的方法進(jìn)行效率校正[14]．圖表采用Microsoft Office Excel軟件制作,并分析差異顯著性．

2 結(jié)果與分析

2.1 FMBP-1基因在不同品種家蠶和野蠶絲腺中的轉(zhuǎn)錄水平差異

首先采用實(shí)時熒光定量PCR的方法,分別測定了家蠶(菁松)和野蠶五齡幼蟲不同發(fā)育時間中部絲腺和后部絲腺FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平．結(jié)果如圖1：家蠶菁松5齡1 d和5齡4 d中部絲腺中FMBP-1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平明顯高于野蠶(圖1(a)),在后部絲腺中,5齡4 d和5齡7 dFMBP-1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平同樣高于野蠶(圖1(b))．這與家蠶和野蠶蠶繭的大小是一致的,說明該基因與絲蛋白的表達(dá)調(diào)控有一定的相關(guān)性．

“*”表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),圖2～7同．

圖1FMBP-1基因在家蠶(菁松)和野蠶絲腺中的轉(zhuǎn)錄水平

Fig.1Transcriptional level ofFMBP-1 gene in the silk

glands ofBombyxmori(Jingsong)andBombyxmandarina

采用同樣的方法,分別檢測多絲量品種皓月和少絲量品種大造五齡幼蟲不同時間中部絲腺和后部絲腺中FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果如圖2，該基因在皓月品種中部絲腺和后部絲腺的五齡3個測定時間,其mRNA轉(zhuǎn)錄水平均高于大造品種(圖2),表明該基因與家蠶繭絲量存在一定的相關(guān)性．

圖2 FMBP-1基因在皓月和大造絲腺中的轉(zhuǎn)錄水平Fig.2 Transcriptional level of FMBP-1 genein the silk glands of Haoyue and Dazao

2.2 添食保幼激素對五齡幼蟲絲腺中FMBP-1基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

與對照組相比,添食保幼激素(JH)后,中部絲腺中FMBP-1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平先呈現(xiàn)下降趨勢然后上升,后部絲腺中,添食保幼激素后,實(shí)驗(yàn)組FMBP-1基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平同樣先下降后上升,而且相對表達(dá)量的峰值延遲1 d(圖3)，由此推斷FMBP-1基因參與蠶絲蛋白的合成,或?qū)z蛋白的合成起到一定的調(diào)控作用．

圖3 添食保幼激素后家蠶絲腺組織FMBP-1基因轉(zhuǎn)錄水平Fig.3 Transcriptional level of FMBP-1 gene inthe silk glands of silkworm after feeding JH

2.3 RNAi對家蠶幼蟲FMBP-1基因干擾效果及影響分析

2.3.1 RNAi對家蠶絲腺FMBP-1基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

通過RNAi技術(shù)對家蠶皓月絲腺組織FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行干擾,并采用實(shí)時熒光定量PCR檢測干擾后家蠶絲腺該基因的轉(zhuǎn)錄水平變化,結(jié)果如圖4，在家蠶中部絲腺和后部絲腺中,FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比分別下降了38.9%和25.4%,說明對FMBP-1基因的干擾效果較為顯著．

圖4 RNAi干擾后家蠶絲腺FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 Transcriptional level of FMBP-1 genein the silk glands of silkworm after RNAi

2.3.2 干擾FMBP-1基因表達(dá)對家蠶表型性狀的影響

RNAi處理后家蠶表型性狀的變化，如圖5，與對照組相比,RNAi處理后的家蠶蛹體積變小,繭殼皺縮,繭層明顯變薄,化蛾后,蠶蛾腹部存在一定程度的皺縮．此外,通過RNAi干擾FMBP-1基因表達(dá)后對家蠶的繭層率也有影響,與對照組相比,RNAi實(shí)驗(yàn)組的繭層率顯著下降(圖6)．根據(jù)RNAi后家蠶表型性狀的變化,推測FMBP-1基因在絲蛋白的合成過程中發(fā)揮著重要的作用．

圖5 通過RNAi干擾FMBP-1基因表達(dá)的家蠶表型性狀Fig.5 Phenotype of Bombyx mori after FMBP-1gene were disturbed by RNAi

圖6 RNAi干擾FMBP-1基因表達(dá)對家蠶繭層率的影響Fig.6 Effects of silencing the expression ofFMBP-1 gene on cocoon layer rate

2.3.3 干擾FMBP-1基因表達(dá)對絲蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

為進(jìn)一步檢測FMBP-1基因?qū)z蛋白合成的作用,我們采用實(shí)時熒光定量PCR進(jìn)一步從分子水平檢測了絲素重鏈Fib-H、絲素輕鏈Fib-L和P25基因的轉(zhuǎn)錄水平,結(jié)果如圖7，F(xiàn)MBP-1基因經(jīng)RNAi干擾后,實(shí)驗(yàn)組中Fib-H、Fib-L和P25基因的轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比都顯著下降,分別下降46%、41%和80%,表明FMBP-1基因?qū)z蛋白基因的轉(zhuǎn)錄有重要的作用．

圖7 干擾FMBP-1基因表達(dá)對絲蛋白基因轉(zhuǎn)錄水平的影響Fig.7 Effects of silencing the expression of FMBP-1gene on the transcriptional levels of silk protein genes

3 討論

家蠶絲腺是高度特異化的器官,具有超強(qiáng)合成絲蛋白的能力,一直是蠶業(yè)科學(xué)研究的重點(diǎn)[15]．絲蛋白基因的表達(dá)特異性受到多個特異因子調(diào)控,對家蠶絲腺功能基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究以及分析絲腺特異性表達(dá)基因的調(diào)控機(jī)制具有積極的意義．絲蛋白的合成主要在五齡盛食期,而在眠期和蛻皮期基本處于關(guān)閉狀態(tài)．家蠶在五齡中期以前,食下的桑葉蛋白質(zhì)主要用于蠶體自身的構(gòu)成,到五齡中后期,蠶體生長基本完成,食入的桑葉蛋白質(zhì)則主要用于蠶絲蛋白的合成．其中,順式作用元件和反式作用因子的調(diào)控以及二者之間的相互作用對于絲蛋白在家蠶絲腺中的特異性表達(dá)常常起到重要的作用[16]．

先前的研究表明FMBP基因是一種正調(diào)節(jié)因子,主要在家蠶五齡絲腺組織表達(dá)[17]．本實(shí)驗(yàn)分析比較了家蠶和野蠶、以及多絲量品種皓月和少絲量品種大造絲腺的FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,FMBP-1基因的轉(zhuǎn)錄水平與家蠶絲量多少密切正相關(guān)．

家蠶絲腺的生長發(fā)育受到蛻皮激素和保幼激素的協(xié)同調(diào)控[18]．保幼激素由昆蟲咽側(cè)體分泌,它能夠保持幼蟲的蟲態(tài),調(diào)控昆蟲發(fā)育、變態(tài)和生殖等過程[19]．文獻(xiàn)[20-21]研究發(fā)現(xiàn)通過喂食保幼激素類似物可以增加15%的繭絲量,而且能促進(jìn)后部絲腺細(xì)胞RNA的合成．另有研究表明保幼激素類似物可以使家蠶幼蟲的齡期延長,并且可以使后部絲腺的RNA合成活性呈現(xiàn)先降后升的趨勢,絲蛋白合成活性也呈現(xiàn)出先降后升的趨勢．文中通過喂食保幼激素,發(fā)現(xiàn)喂食后的家蠶絲腺內(nèi)FMBP-1基因的含量有顯著的變化,推測該基因在保幼激素的調(diào)控通路中發(fā)揮著重要作用,有待進(jìn)一步研究,也說明該基因?qū)z蛋白合成有至關(guān)重要的作用．

此外,本實(shí)驗(yàn)還利用RNAi技術(shù),對FMBP-1基因在絲腺組織的功能進(jìn)行了探究分析,結(jié)果表明,FMBP-1基因?qū)倚Q蠶繭的繭層率有重要影響,對蠶絲蛋白的表達(dá)調(diào)控發(fā)揮著重要作用,這與之前的研究結(jié)果也是一致的[8],當(dāng)然,調(diào)控的機(jī)理還待進(jìn)一步研究,希望本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果能為進(jìn)一步探究絲腺特異性轉(zhuǎn)錄因子的深入研究提供線索和參考．