焦健 張紅培

摘要：農(nóng)作物新品種的培育過程中，常常涉及到生物基因工程技術的使用，比如轉基因作物新品種、分子設計育種、基因編輯育種等。VIGS技術是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)應用中一種反向遺傳學的基因工程技術，它一般根據(jù)具體育種目標，構建精準的基因沉默病毒載體，最終結合育種實踐培育出符合預期的農(nóng)作物新品種。該文研究了一種高通量的農(nóng)業(yè)基因工程技術VIGS在農(nóng)作物育種中的基因篩選應用。

關鍵詞：VIGS（基因沉默）;高通量;農(nóng)業(yè)基因工程;技術應用

1 ? VIGS技術簡介

由于農(nóng)作物突變體的收集獲得較難，病毒誘導的基因沉默（Virus-induced gene silencing，VIGS）技術已經(jīng)成為一種有效的研究功能基因組學的反向遺傳學工具，而且VIGS是農(nóng)作物基因組功能分析的重要基因工程技術手段。VIGS一般是在已改造、優(yōu)化的病毒載體中，插入適當大小的目的基因cDNA片段，隨著病毒侵染寄主并在農(nóng)作物組織中大量繁殖后，病毒載體中的目的cDNA片段在農(nóng)作物體內(nèi)利用siRNA的生物合成途徑產(chǎn)生針對靶標基因的多種siRNA，繼而通過siRNA干涉機制，降解靶標基因的mRNA，最終實現(xiàn)對目的基因轉錄水平的沉默或翻譯水平的抑制[1]。農(nóng)作物VIGS的基本過程包含以下幾個方面：1）病毒載體（已插入被沉默目的基因cDNA片段）的構建;2）寄主農(nóng)作物的病毒侵染（如穿刺法、注射法、高壓法和真空滲透法等）;3）寄主農(nóng)作物天然VIGS防御體系針對入侵病毒，產(chǎn)生sRNA并啟動sRNA對目的基因的干涉機制[2]。

2 ? VIGS技術在農(nóng)業(yè)基因工程應用中的優(yōu)勢

相比較其他可導致目標基因沉默或功能抑制的技術方法，VIGS技術在農(nóng)業(yè)基因工程的實際應用中，具有以下6個方面的優(yōu)勢：1）快速簡單、操作方便、實驗周期短;（2）不需要繁瑣且周期長的遺傳轉化，當代就能觀察農(nóng)作物目標基因沉默的表型及進一步的分子鑒定;3）只需利用目標基因的一段cDNA片段就能將該目標基因沉默，無需知道基因的完整編碼序列;4）對同源性較高的一類基因家族成員，可選擇高度保守的區(qū)域用以沉默整個家族成員，也可以選擇非保守區(qū)域用以沉默其中某個家族成員;5）由于有些農(nóng)作物育種突變體的收集獲得較難，而且對于某些沉默致死或不育的基因，也可以利用VIGS的方法來實現(xiàn)對這類基因的功能分析;6）瞬時VIGS技術可用于高通量地篩選分析基因的功能以及可在不同農(nóng)作物種間完成比較基因學的快速研究[3]。由此可見，VIGS技術具備了上述實驗方法和操作上的優(yōu)勢，使其成為一種有效地篩選農(nóng)作物優(yōu)質育種基因、研究農(nóng)作物新基因功能的反向遺傳學工具。

3 ? 高通量VIGS技術在農(nóng)作物基因功能檢測中的應用

本研究以八氫番茄紅素脫氫酶（PDS）基因為研究對象，該基因的沉默可導致植物葉片及莖桿組織失綠，即光漂白表型。因此，在實施瞬時基因沉默實驗時，往往以PDS基因作為標志性基因或陽性對照。此外，我們利用Web MicroRNA Designer 3（http：//wmd3.weigelword.org，WMD3）平臺設計沉默麥類作物PDS基因的amiRNAs_PDS，WMD3網(wǎng)絡工具由Weigel創(chuàng)建，以便于設計、選擇適當?shù)腶miRNA序列，并且提供了AtmiR319和OsmiR528等常用miRNA前體相關的引物，使amiRNA的構建更加快捷。

本研究建立了基于BSMV的vamiRNAs表達系統(tǒng)，我們選擇了單、雙子葉植物不同的miRNA前體為骨架以表達這些vamiRNA_PDS，探索amiRNA的設計和選擇標準。另外，以單、雙子葉植物不同的miRNA前體為骨架，攜帶可誘導葉片產(chǎn)生光漂白表型的vamiRNA_PDS，比較分析同源或異源的不同miRNA前體在麥類作物中表達vamiRNAs的情況。實驗采用來源不同的5個miRNA前體，他們分別是OsaMIR528，AthMIR319a，TaeMIR171a，HvuMIR168和HvuMIR171前體，其中OsaMIR528和AthMIR319a前體相對于小麥而言是外源miRNA前體，而且AthMIR319a前體相對于小麥來說又是雙子葉植物的miRNA前體，其他前體均屬于單子葉植物自大麥或小麥內(nèi)源的miRNA前體。

以BSMV表達vamiR_TaPDS為例，利用End-point Stem-loop RT-PCR技術檢測不同miRNA前體表達vamiR_TaPDS的相對轉錄水平，圖1-A是該技術原理的示意圖。如圖1-C所示，半定量RT-PCR利用Stem-loop引物分別擴增vamiRNA 23、26和29循環(huán)后，可檢測到不同miRNA前體在小麥葉片中均可切割產(chǎn)生vamiRNA。結合Real-time RT PCR（圖1-B），檢測不同miRNA前體在小麥中的切割效率，發(fā)現(xiàn)OsaMIR528前體可表達出較多的vamiRNA。另外，來源單、雙子葉植物不同的miRNA前體均可誘導小麥葉片光漂白表型（圖1-D）。

因此，BSMV病毒載體攜帶內(nèi)源miRNA前體，可以在普通小麥中表達vamiRNA，即“與amiRNA序列相同的sRNA”;并且OsaMIR528前體相對本實驗其他miRNA前體，表達vamiRNA的效率更高?？梢?，利用BSMV病毒載體的VIGS技術，可以高通量沉默目標基因，檢測目標基因的功能，這就為農(nóng)業(yè)實際育種過程中，高通量篩選目標基因提供了瞬時、快速和便利技術手段。

4 ? 結語

與發(fā)達國家相比，中國農(nóng)業(yè)育種技術還有差距，需要我們創(chuàng)新育種理念，補上短板，突破傳統(tǒng)育種技術的限制，走出多種基因工程育種技術的新路，為保障中國糧食安全提供核心戰(zhàn)略支撐。當前基因工程育種技術的重點在于解析復雜性狀分子調(diào)控網(wǎng)絡，闡明其相互效應，構建具有育種價值的分子模塊系統(tǒng)，建立模塊耦合組裝的理論和應用模型，實現(xiàn)高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、優(yōu)質、高效多模塊的有效組裝，創(chuàng)建新一代超級品種培育的系統(tǒng)解決方案和育種新技術。

目前，先進的表達小分子RNA的VIGS技術，可以用于農(nóng)作物新品種目標基因的高通量沉默和篩選，該項技術具有瞬時性、便捷性、快速性和高通量等優(yōu)點[4]。本研究通過利用BSMV病毒載體，在麥類作物中表達了vamiRNA，建立了基于BSMV病毒載體的sRNA表達系統(tǒng)，為篩選育種目標基因和研究麥類作物靶標基因的功能提供了反向遺傳學方法。

參考文獻：

[1]Jiao，J.;Wang，Y.C.;Selvaraj，S.N.;Xing，F(xiàn).G.;Liu，Y.Barley stripe mosaic virus （BSMV）induced microRNA silencing in common wheat（Triticum aestivum L.）.PLoS ONE 2015， 10，e0126621.

[2]Tang，Y.;Wang，F(xiàn).;Zhao，J.;Xie，K.;Hong，Y.;Liu，Y.L.Virus-based microRNA expression for gene functional analysis in plants.Plant Physiol.2010，153，632–641.

[3]Sha A，Zhao J，Yin K，Tang Y，Wang Y，Wei X，et al.Virus-based microRNA silencing in plants.Plant Physiol.2014;164：36–47.

[4]Cai，Q.;Qiao，L.;Wang，M.;He， B.; Lin， F.M.;Palmquist，J.;Huang，S.D.;Jin，H. Plants send small RNAs in extracellular vesicles to fungal pathogen to silence virulence genes. Science 2018，360，1126–1129.