摘要：葡萄糖作為一種速效碳源，是大多數(shù)工業(yè)微生物包括芽孢桿菌優(yōu)先利用的碳源。其分解代謝物會(huì)抑制其他糖代謝相關(guān)的基因表達(dá)，從而無(wú)法利用非速效碳源，這種現(xiàn)象被稱為碳代謝物阻遏效應(yīng)，是細(xì)菌應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的一大難題。這種效應(yīng)在革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌中主要是由CcpA蛋白調(diào)控的。本綜述介紹了目前對(duì)這一現(xiàn)象的認(rèn)識(shí)及未來(lái)的研究方向。

關(guān)鍵詞：芽孢桿菌；糖代謝；阻遏機(jī)制

芽孢桿菌（Bacillus）為革蘭氏陽(yáng)性原核細(xì)菌，普遍存在于自然環(huán)境中。在土壤、哺乳動(dòng)物的糞便、農(nóng)產(chǎn)品、鳥(niǎo)類羽毛中是占據(jù)主導(dǎo)優(yōu)勢(shì)的微生物。由于生存環(huán)境多變且差異較大，細(xì)胞均由復(fù)雜的代謝調(diào)控網(wǎng)絡(luò)來(lái)適應(yīng)各種不良條件，如高溫、饑餓、酸堿、化合物變化引起的滲透壓變化等。不僅如此，芽孢桿菌還可以形成芽孢來(lái)抵御惡劣的生存環(huán)境，在生存條件惡劣、營(yíng)養(yǎng)條件缺乏時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成抗逆性強(qiáng)的芽孢休眠體，一旦轉(zhuǎn)至營(yíng)養(yǎng)豐富的環(huán)境中，處于休眠狀態(tài)的菌群會(huì)迅速繁殖，重新長(zhǎng)成一個(gè)細(xì)菌。

芽孢桿菌由于其酶系豐富，生長(zhǎng)速率適中，蛋白折疊充分，具有很多其他工業(yè)菌種沒(méi)有的優(yōu)勢(shì)，被作為同源或異源表達(dá)的平臺(tái)，是優(yōu)良的工業(yè)微生物菌株，在世界上被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)淀粉酶、堿性蛋白酶和某些抗生素。其中地衣芽孢桿菌是嗜溫菌，在40-50℃下仍能較好的生長(zhǎng)；在發(fā)酵過(guò)程中可以分泌肽類物質(zhì)抑制其他細(xì)菌、真菌的生長(zhǎng)，因此不易染菌；該菌自身酶系比較豐富、酶的產(chǎn)量比其他水平較高，其胞外蛋白分泌量可達(dá)枯草芽孢桿菌的2.4-2.6倍；該菌被稱為整腸生，因其對(duì)氧氣需求量高，可以在人、動(dòng)物的腸道中迅速奪取氧氣，以保證腸道中厭氧菌群的平衡，從而維護(hù)腸道的生態(tài)平衡；此外，該菌被認(rèn)定為食品安全級(jí)菌株 （Generally Recognized As Safe，GRAS），至今已有40多年的歷史。

盡管存在這些優(yōu)勢(shì)，地衣芽孢桿菌中仍有很多未知的特性有待考察，其潛力仍需繼續(xù)挖掘。地衣芽孢桿菌主要分泌的酶是生長(zhǎng)相關(guān)酶，如蛋白酶和淀粉酶，但這種其適應(yīng)自身生長(zhǎng)的機(jī)制并不適用于酶生產(chǎn)的工業(yè)過(guò)程。對(duì)于工業(yè)生產(chǎn)來(lái)說(shuō)，菌株應(yīng)以最低的資源消耗包括最低的生物量的積累最大限度地增加酶的表達(dá)。野生型地衣芽孢桿菌自身會(huì)在生長(zhǎng)后期表達(dá)多種蛋白酶基因，其中編碼胞外堿性絲氨酸蛋白酶基因 （aprE）最為常見(jiàn)。而其分泌至特質(zhì)制培養(yǎng)基中的蛋白酶，可能會(huì)對(duì)已表達(dá)的目標(biāo)蛋白產(chǎn)生一定的降解作用。此外，還有報(bào)道指出，當(dāng)?shù)匾卵挎邨U菌作為宿主進(jìn)行外源蛋白的表達(dá)時(shí)，還存在著產(chǎn)量低等問(wèn)題。比如本研究采用的是α-淀粉酶基因作為報(bào)告基因，而α-淀粉酶是對(duì)菌體本身有一定毒性的。

地衣芽孢桿菌在工業(yè)化生產(chǎn)上的應(yīng)用，主要是采用組成型表達(dá)機(jī)制來(lái)合成其內(nèi)源性代謝產(chǎn)物。一方面，組成型表達(dá)機(jī)制適用于宿主內(nèi)源基因的高效表達(dá)，且不需要添加誘導(dǎo)劑；但另一方面，其表達(dá)量受菌體生長(zhǎng)影響，不易控制，在生長(zhǎng)早期，目標(biāo)蛋白的大量表達(dá)對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有不利影響，所以當(dāng)表達(dá)的目的蛋白對(duì)菌體有害時(shí)，其可能會(huì)影響菌體的正常生長(zhǎng)代謝，甚至毒害菌體而威脅菌體生存，以致蛋白的表達(dá)量極低。由于當(dāng)前對(duì)該菌株誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的認(rèn)識(shí)僅停留在解除效應(yīng)物阻遏的開(kāi)關(guān)機(jī)制，其在發(fā)酵過(guò)程中的各類影響因素尚不清楚，所以地衣芽孢桿菌在應(yīng)用上不如已被充分研究的大腸桿菌和酵母，其優(yōu)勢(shì)尚未良好地發(fā)揮。誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)將酶的生產(chǎn)與細(xì)胞生長(zhǎng)分開(kāi)，可以解決上述的這些問(wèn)題，開(kāi)發(fā)各種誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可以大大拓寬這種優(yōu)勢(shì)菌種的應(yīng)用范圍。

1. 木糖操縱子的特性

在對(duì)芽孢桿菌研究的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)它可以利用木糖，進(jìn)一步在其胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了木糖運(yùn)輸系統(tǒng)及代謝途徑。地衣芽孢桿菌中存在的木糖運(yùn)輸途徑為ABC運(yùn)輸系統(tǒng)：以水解ATP得到的能量作為運(yùn)輸動(dòng)力，通過(guò)與木糖專一性結(jié)合的介導(dǎo)蛋白完成運(yùn)輸。木糖進(jìn)入枯草芽孢桿菌細(xì)胞內(nèi)，在木糖異構(gòu)酶（XylA）的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槟就?，在木酮糖激酶（XylB）的催化作用下，進(jìn)一步生成5-磷酸-木酮糖，5-磷酸-木酮糖經(jīng)由磷酸戊糖途徑進(jìn)入糖代謝途徑。

目前，研究較為透徹的木糖操縱子有兩種，分別來(lái)源于枯草芽孢桿菌和大腸桿菌。D-木糖操縱子位于大腸桿菌染色體glyS位點(diǎn)附近，XylA的結(jié)構(gòu)基因編碼440個(gè)氨基酸，另外還有XylB、XylT和XylR三個(gè)讀碼框。大腸桿菌兩個(gè)啟動(dòng)子PA、PF的轉(zhuǎn)錄翻譯均受木糖誘導(dǎo)，同時(shí)也受葡萄糖降解的抑制。XylR本身帶有弱啟動(dòng)子且處于xylF（木糖結(jié)合蛋白基因）、xylG（ATP結(jié)合蛋白基因）、xylH（木糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因）下游，不受木糖和葡萄糖降解的調(diào)控，xylR生產(chǎn)的阻遏蛋白能夠正向調(diào)節(jié)xylAB的表達(dá)?？莶菅挎邨U菌的xyl操縱子位于染色體168度，屬于強(qiáng)啟動(dòng)子。xylR位于染色體162度，該基因編碼木糖啟動(dòng)子的阻遏蛋白，與xylA相鄰但轉(zhuǎn)錄方向正好相反?？莶菅挎邨U菌木糖操縱子有兩個(gè)調(diào)控元件OL和OR，這兩個(gè)調(diào)控元件相互串聯(lián)并交錯(cuò)重疊，阻遏蛋白能同時(shí)分別與這兩個(gè)調(diào)控元件結(jié)合，實(shí)現(xiàn)對(duì)xyl操縱子的負(fù)調(diào)控。添加木糖后，阻遏蛋白從與xylO的復(fù)合物中分離，從而使xylA、xylB一系列基因得以轉(zhuǎn)錄。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，葡萄糖和果糖的存在會(huì)抑制木糖的誘導(dǎo)作用；而葡萄糖-6-磷酸會(huì)使XylR與xylO結(jié)合更緊密，是一種輔阻遏物。此外，xyl操縱子還受CCR效應(yīng)的影響：在葡萄糖與木糖同時(shí)存在的條件下，微生物優(yōu)先利用葡萄糖，葡萄糖耗盡時(shí)激活木糖利用基因?？莶菅挎邨U菌的木糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白位于cre之后，葡萄糖存在時(shí)CcpA與cre緊密結(jié)合，從而影響木糖的利用，同樣葡萄糖的存在也會(huì)影響木糖操縱子的作用。

2. 甘露糖操縱子的特性

目前已有研究的是枯草芽孢桿菌的甘露糖操縱子，該操縱子由三個(gè)基因組成，分別是manP，manA和yjdF，它們負(fù)責(zé)甘露糖的運(yùn)輸和利用。在上游和與甘露糖操縱子相同的方向上調(diào)節(jié)基因ManR編碼甘露糖操縱子的轉(zhuǎn)錄激活因子。甘露糖誘導(dǎo)著甘露糖操縱子的轉(zhuǎn)錄和manR的轉(zhuǎn)錄。甘露糖的存在導(dǎo)致來(lái)自manP啟動(dòng)子（PmanP）的lacZ表達(dá)增加了4至7倍，來(lái)自manR啟動(dòng)子（PmanR）的lacZ表達(dá)增加了3倍。

D-甘露糖是一種2-二聚體葡萄糖，存在于甘露聚糖和異甘露聚糖多糖、糖蛋白和許多其他糖結(jié)合物中。許多細(xì)菌可以使用D-甘露糖作為碳源。在枯草芽孢桿菌中，甘露糖分兩步進(jìn)入碳水化合物代謝。首先，它通過(guò)甘露糖特異性PTS轉(zhuǎn)運(yùn)體在攝取過(guò)程中磷酸化到甘露糖-6-磷酸。其次，通過(guò)甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶將其轉(zhuǎn)化為果糖-6-磷酸。甘露糖操縱子中的三個(gè)基因已經(jīng)被鑒定。第一個(gè)基因manP編碼一個(gè)假定的PTS甘露糖特異性酶IIBCA組分（轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白），它與支原體的果糖特異性過(guò)氧化物酶具有明顯的序列相似性，因此屬于Fru過(guò)氧化物酶家族。第二個(gè)基因manA編碼甘露糖-6-磷酸異構(gòu)酶，而第三個(gè)基因yjdF的功能尚不清楚。據(jù)推測(cè)，上游和與甘露糖操縱子相同的方向是一個(gè)調(diào)節(jié)基因manR編碼甘露糖操縱子的激活物。利用蛋白質(zhì)序列比對(duì)N端DNA結(jié)合基序，鑒定出兩個(gè)PRDs和一個(gè)EIIAEII B結(jié)構(gòu)域，表明manR是一種含有PRD的激活劑，類似于嗜硬脂菌的MTLR。

3. 地衣芽孢桿菌中鼠李糖操縱子的特性

鼠李糖操縱子作為一種誘導(dǎo)表達(dá)元件，在地衣芽孢桿菌中可以用來(lái)介導(dǎo)異源基因的表達(dá)。地衣芽孢桿菌中的鼠李糖啟動(dòng)子，是由六個(gè)結(jié)構(gòu)基因和一個(gè)啟動(dòng)子（ori）組成，其結(jié)構(gòu)基因分別為轉(zhuǎn)醛酶（rhaA），鼠李糖脫氫酶（rhaD），鼠李糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（rhaB，rhaC，rhaE）和激活蛋白（rhaM）。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因rhaB，rhaC，rhaE分別編碼鼠李糖PTS系統(tǒng)中的蛋白EIIC、EIIB和EIIA，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)鼠李糖。

糖特異性膜結(jié)合酶I I復(fù)合物（EII），起到了特定糖的運(yùn)輸和磷酸化作用。EII復(fù)合物通常由三個(gè)功能域組成，融合在單個(gè)蛋白或被分離的蛋白質(zhì)上，其中IIA域（以前稱為EIII）和IIB域分別具有第一和第二磷酸化位點(diǎn)，而IIC域形成跨膜通道和糖結(jié)合位點(diǎn)。rhaM基因表達(dá)的是一種DNA結(jié)合蛋白，已被證明是激活操縱子所必需的蛋白。

4. CcpA蛋白的作用機(jī)理

4.1 碳代謝阻遏（CCR效應(yīng)）

Jacques Monod等人在1942年觀察到，大腸桿菌E. coli在葡萄糖和半乳糖同時(shí)作為碳源的情況下，大腸桿菌會(huì)優(yōu)先利用葡萄糖作為能源物質(zhì)，當(dāng)葡萄糖消耗后才開(kāi)始利用半乳糖，即菌體的二次生長(zhǎng)現(xiàn)象。之后許多研究結(jié)論表明，當(dāng)葡萄糖存在時(shí)，其分解代謝物會(huì)抑制與其他糖代謝相關(guān)的基因表達(dá)，從而利用速效碳源，這種現(xiàn)象被稱為碳代謝物阻遏（CCR）效應(yīng)。這種現(xiàn)象在細(xì)菌中普遍存在，是細(xì)菌應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)的一大難題。而這種效應(yīng)主要依賴于CcpA蛋白。

CCR效應(yīng)的組成部分為一個(gè)特有的順式活性序列（cre位點(diǎn)：catabolite responsive element分解代謝反應(yīng)元件）和一種反式作用蛋白（CcpA蛋白：catabolite control protein代謝控制蛋白），CcpA蛋白識(shí)別并與cre元件相互作用以負(fù)性調(diào)節(jié)相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄。芽孢桿菌中的典型cre序列已被確定為TGWAANCGNTNWCA，其中N代表任意堿基，W代表堿基A或者堿基T。這種結(jié)合序列通常存在與許多與碳代謝相關(guān)的基因的N末端序列處。

4.2 CcpA蛋白作用機(jī)制

CcpA是一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與芽孢桿菌中某些非速效碳源代謝基因如木糖操縱子、甘露醇操縱子、山梨醇操縱子上的特定位點(diǎn)結(jié)合進(jìn)而控制該基因的表達(dá)。早在1995年，Kim等人已在枯草芽孢桿菌中，通過(guò)足跡法和凝膠遷移阻滯（EMSA）實(shí)驗(yàn)證明了CcpA蛋白可以在共阻遏物P-（Ser）-Hpr不存在的情況下與淀粉酶編碼基因amyE啟動(dòng)子區(qū)域處的cre位點(diǎn)amyO結(jié)合。但之后的相關(guān)研究表明，在多數(shù)情況下，CcpA蛋白和cre位點(diǎn)的結(jié)合是需要共阻遏蛋白參與的。共阻遏HPr蛋白（histidine-phosphoryl protein）有兩個(gè)磷酸化位點(diǎn)：組氨酸殘基和絲氨酸殘基。該蛋白的HPr蛋白的絲氨酸殘基隨后在Hpr 激酶/磷酸酯酶（HPrK/ P：Hpr kinase/phosphoesterase）的催化下被磷酸化，形成P-（Ser）-HPr，并與轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子CcpA形成復(fù)合體，而組氨酸殘基在磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（PTS ：phosphotransferase system）中的酶I（EI：enzyme I）催化下以磷酸烯醇式丙酮酸（PEP： phosphoenolpyruvate）為底物進(jìn)行磷酸化，并將磷酸基傳遞給負(fù)責(zé)葡萄磷酸化和糖轉(zhuǎn)運(yùn)的PTS系統(tǒng)；參與CCR效應(yīng)。

HPrK/P的活性受胞內(nèi)能荷水平（ATP/Pi）以及葡萄糖代謝產(chǎn)物比如1，6-二磷酸果糖（F-BP）、6-磷酸葡萄糖（G-6-P）水平的影響。當(dāng)葡萄糖等速效碳源存在時(shí)，在胞內(nèi)高能荷水平上升和葡萄糖代謝生成產(chǎn)物這兩種條件下，HPrK/P的激酶活性被激活，HPr的絲氨酸殘基在催化下進(jìn)行磷酸化，然后P-（Ser）-HPr與CcpA結(jié)合形成復(fù)合物，然后再與非速效碳源代謝基因的cre位點(diǎn)結(jié)合，抑制其轉(zhuǎn)錄及翻譯。

作者簡(jiǎn)介：

樓志華（1981.08-）男，漢族，浙江省義烏市人，碩士；職稱：中級(jí)工程師；研究方向：發(fā)酵工程、生物分離純化、酶工程。