劉慶春，華春秀，薛士鵬，管翠翠，夏西超,,,*，代紅梅，王雯，張科，姚倫廣

1. 南陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，南陽(yáng) 473007 2. 南陽(yáng)師范學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，南陽(yáng) 473061 3. 平頂山學(xué)院醫(yī)學(xué)院，平頂山 476000

多溴聯(lián)苯醚(PBDEs)是一類廣泛應(yīng)用于電子設(shè)備、塑料、紡織品和建筑材料中的阻燃劑，已被列入具有生態(tài)危害性的持久性有機(jī)污染物[1-2]。隨其應(yīng)用的不斷增加，大量PBDEs隨降雨進(jìn)入池塘、河流和湖泊等地表水，并在環(huán)境中呈現(xiàn)持久性累積，且在生物體內(nèi)大量蓄積，現(xiàn)已成為威脅淡水生物的重要有機(jī)污染物[3]。PBDEs很難被環(huán)境中微生物降解，容易在脂肪組織中累積下來(lái)，隨整個(gè)食物鏈呈現(xiàn)放大效應(yīng)[4]。PBDEs在生物體中能夠催化活性氧(ROS)生成，干擾線粒體呼吸作用，導(dǎo)致ROS過(guò)量產(chǎn)生，三磷酸腺苷(ATP)合成減少，最終誘發(fā)細(xì)胞死亡[5]。在PBDEs家族中，PBDE-47和PBDE-209應(yīng)用較為廣泛，在多種食品和動(dòng)物組織中被檢測(cè)到[5]。

過(guò)氧化氫酶(catalase, CAT)是一種廣泛存在于原核生物和真核生物體內(nèi)的活性酶，CAT能夠?qū)2O2分解為H2O和O2，而H2O2作為一種有害的活性氧造成細(xì)胞損傷和病變[6-7]。目前，CAT廣泛應(yīng)用于食品、環(huán)保和紡織業(yè)等，作為一種生物標(biāo)記來(lái)檢測(cè)污染物的含量。同時(shí)，CAT參與炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增生和細(xì)胞凋亡及免疫細(xì)胞的激活等活動(dòng)[6-7]。

雙殼類是軟體動(dòng)物一個(gè)重要類群，常年棲息在海洋、河流和湖泊底部，以濾食生活為主，是檢測(cè)環(huán)境污染的重要指示性生物[8-9]。背角無(wú)齒蚌(Anodontawoodiana)是雙殼類軟體動(dòng)物主要類群之一，在農(nóng)藥、重金屬和持久性有機(jī)污染物檢測(cè)中發(fā)揮積極作用，常作為淡水污染的指示性生物[10-11]。為了更好揭示PBDEs環(huán)境毒性，保護(hù)淡水資源和淡水生物，本研究以背角無(wú)齒蚌為研究對(duì)象，克隆出AwCAT全基因序列，分析PBDE-47和PBDE-209對(duì)AwCAT時(shí)空表達(dá)的影響，為揭示PBDEs毒理效應(yīng)提供理論參考。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 背角無(wú)齒蚌處理

背角無(wú)齒蚌購(gòu)自南陽(yáng)市水產(chǎn)市場(chǎng)，PBDE-47、PBDE-209和二甲亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，純度≥99.7%，購(gòu)自Sigma-Aldrich公司，TRIzol試劑、M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、菌株DH5α、克隆載體pMDl9-T、連接酶、PCR產(chǎn)物回收純化試劑盒和RACE試劑盒均購(gòu)自TaKaRa公司。其余常規(guī)藥品均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

背角無(wú)齒蚌(殼長(zhǎng)(6.5±0.5) cm)處理之前，置于實(shí)驗(yàn)室自動(dòng)水循環(huán)系統(tǒng)中適應(yīng)養(yǎng)殖2周，停止進(jìn)食。PBDE-47和PBDE-209溶解于DMSO中制備儲(chǔ)備液。處理實(shí)驗(yàn)在長(zhǎng)方形塑料盒(40 cm×25 cm，10 cm高)中進(jìn)行，飼養(yǎng)采用人工模擬池塘水(每1 L去離子水中含48 mg NaHCO3、33 mg CaCl2·2H2O、60 mg MgSO4·7H2O和0.5 mg KCl)，喂食小球藻，處置溫度(24±2) ℃[12]。為了確定AwCAT組織分布，對(duì)來(lái)自同一塑料盒5只動(dòng)物進(jìn)行解剖，取斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、心臟和外套膜等組織。根據(jù)上述動(dòng)物處理方法，動(dòng)物分為對(duì)照組、PBDE-47處理組(6.25、12.5、25、50和100 μg·L-1)和PBDE-209處理組(10、20、40、80和160 μg·L-1)，對(duì)照組用同體積DMSO處理，水中DMSO濃度不超過(guò)3‰。分別在0、6、12、24和48 h每組中取出5只河蚌，解剖肝胰腺和鰓，液氮速凍，于-80 ℃保存。

1.2 總RNA提取和cDNA第一鏈的合成

總RNA提取采用TRIzol試劑，用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，分光光度法測(cè)定RNA濃度，具有完整rRNA條帶的RNA用于合成cDNA，用M-MLV試劑盒合成第一鏈cDNA，用作PCR反應(yīng)模板。

1.3 背角無(wú)齒蚌AwCAT核心片段的擴(kuò)增

用簡(jiǎn)并引物AwCAT1和AwCAT2分離AwCATcDNA保守區(qū)域片段，PCR產(chǎn)物連接至pMDT-19載體，3個(gè)樣品雙向測(cè)序。確定AwCAT部分cDNA序列后，根據(jù)部分cDNA序列設(shè)計(jì)的特異性引物(表1)，按照試劑盒要求，采用巢式PCR擴(kuò)增AwCATcDNA 5’和3’區(qū)域序列，對(duì)3個(gè)5’RACE和3’RACE的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，拼接。

表1 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的引物Table 1 Description of the primes used in this study

1.4 序列和系統(tǒng)發(fā)育分析

通過(guò)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)搜索(www. ncbi.nlm.nih.gov/blast)進(jìn)行BLAST程序比對(duì)，分析AwCAT序列；根據(jù)SignalP-5.0 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預(yù)測(cè)信號(hào)肽；采用Simple Modular Architecture Research Tool(http://smart.embl-heidelberg.de/)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域；使用DANMEN分析程序?qū)wCAT基因進(jìn)行多序列比對(duì)；通過(guò)Swiss-model(http://swissmodel.expasy.org/)預(yù)測(cè)AwCAT的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)；使用MEGA5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.5 AwCAT mRNA水平定量檢測(cè)

為了確定AwCAT轉(zhuǎn)錄水平，采用SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒并按照要求進(jìn)行定量分析。β-actin作為內(nèi)參基因，根據(jù)AwCAT-F和AwCAT-R引物，用PCR儀中分離靶基因(表1)，瓊脂糖凝膠電泳僅檢測(cè)出一個(gè)條帶，PCR產(chǎn)物測(cè)序，序列鑒別。篩選β-actin和AwCAT最佳擴(kuò)增溫度，采用兩步法，使用ABI7500實(shí)時(shí)檢測(cè)系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國(guó))進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)2-△△CT分析AwCAT表達(dá)水平。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果(Results)

2.1 背角無(wú)齒蚌AwCAT 分子結(jié)構(gòu)

背角無(wú)齒蚌AwCATcDNA全長(zhǎng)由1 784個(gè)核苷酸組成(GenBank NO, KU363383)，包含14 bp的5’非翻譯區(qū)(UTR)和234 bp的3’UTR。開放閱讀框由1 536 bp核苷酸組成，編碼512個(gè)氨基酸的多肽鏈，分子量為58.05 kDa，理論等電點(diǎn)為7.23(圖1)。終止信號(hào)(AATAAA)在3’UTR的1 743～1 748位點(diǎn)處。AwCAT具有CAT家族2個(gè)特征性標(biāo)簽序列，一個(gè)是高度保守催化位點(diǎn)序列(61FDRERIPERVVHAKGAGA77)和一個(gè)是血紅素配體信號(hào)序列(351RLFSYSDTH358)(圖1)。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，保守氨基酸His72、Asn145和Tyr355存在于AwCAT和其他CAT序列中(圖2)；氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明，AwCAT含有NADPH結(jié)合殘基(N145、H191、F195、S198、R200、Y212、K234、W300、Q302和Y355)和血紅素結(jié)合殘基(R69、H72、R109、N145、F150、R351、Y355和R362)(圖2)。AwCAT中NFS(殘基436～438)為糖基化作用位點(diǎn)。

圖1 背角無(wú)齒蚌AwCAT 基因的cDNA序列和推導(dǎo)的氨基酸序列注：粗體部分為起始和終止密碼；波浪線部分為終止信號(hào)“AATAAA”；下劃線部分為潛在的活性位點(diǎn)序列(61FDRERIPERVVHAKGAGA77)和血紅素配體信號(hào)序列(351RLFSYSDTH358)；灰色陰影部分為糖基化位點(diǎn)。Fig. 1 The nucleotide acid sequence and the deduced amino acid sequence of AwCAT in Anodonta woodianaNote: The start codon (ATG) and stop codon (TAA) are indicated in bold; putative polyadenylation signal “AATAAA” is showed with wavy line; the highly conserved catalytic site motif (61FDRERIPERVVHAKGAGA77) and proximal heme-ligand signature motif (351RLFSYSDTH358) are underlined; the potential N-glycosylation residues are marked with shadow.

圖2 背角無(wú)齒蚌AwCAT與其他物種CAT序列多重比對(duì)注：高度保守的催化位點(diǎn)序列用單下劃線標(biāo)記，近端血紅素配體標(biāo)記序列用雙下劃線標(biāo)記；NADPH結(jié)合位點(diǎn)(N145、H191、F195、S198、R200、Y212、K234、W300、Q302和Y355)用粗體標(biāo)記；保守氨基酸(His72、Asn145和Tyr355)用陰影標(biāo)記。Fig. 2 Multiple alignment of AwCAT in Anodonta woodiana with other CATNote: The highly conserved catalytic site motif and proximal heme-ligand signature motif are respectively marked in singe underline and double underline; the putative NADPH-binding residues (N145, H191, F195, S198, R200, Y212, K234, W300, Q302 and Y355) are marked with bold; the conserved catalytic amino residues (His72, Asn145 and Tyr355) are indicated with shadow.

AwCAT與其他物種CAT序列具有高度的相似性，包括12個(gè)β-折疊和23個(gè)α-螺旋(圖3(a))。AwCAT三維結(jié)構(gòu)排列和其物種CAT序列三維結(jié)構(gòu)排列有很高的相似性(圖3(b))。

圖3 背角無(wú)齒蚌AwCAT二級(jí)和3D結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)注：(a)AwCAT二級(jí)結(jié)構(gòu)；(b)AwCAT的3D結(jié)構(gòu)。Fig. 3 Predicted secondary and 3D structures of AwCAT deduced amino acidsNote: (a) the secondary structure of AwCAT; (b) the 3D structure of AwCAT.

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

BLAST分析結(jié)果表明，AwCAT的氨基酸序列與其他物種CAT具有較高的同源性，與褶紋扇貝(Cristariaplicata)的同源性為91.99%，與加州夜蛾(Aplysiacalifornica)的同源性為73.88%，與家蠶(Bombyxmori)的同源性為66.09%，與斑馬魚(Daniorerio)的同源性為65.21%，與褐家鼠(Rattusnorvegicus)的同源性為66.98%，與人類(Homosapiens)的同源性為66.98%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，與AwCAT親緣關(guān)系最近是淡水雙殼類，其次是腹足類和海洋雙殼類，最后是脊椎動(dòng)物、昆蟲和甲殼類動(dòng)物(圖4)。

圖4 根據(jù)背角無(wú)齒蚌AwCAT氨基酸序列使用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic relationship of AwCAT of Anodonta woodiana according to neighborhood-joining method

2.3 AwCAT的組織分布

實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示，背角無(wú)齒蚌AwCAT在斧足、鰓、肝胰臟、閉殼肌、外套膜和心臟殼中廣泛表達(dá)(圖5)。AwCATmRNA在肝胰臟和鰓中表達(dá)水平最高，閉殼肌、外套膜和斧足為中等水平表達(dá)，心臟中表達(dá)水平較低(圖5)。

圖5 背角無(wú)齒蚌AwCAT基因的空間表達(dá)注：每組數(shù)據(jù)來(lái)源于5只動(dòng)物，重復(fù)3次。Fig. 5 Real-time PCR analysis of AwCAT transcript from different tissuesNote: The data of each group were from 5 animals, and tests were repeated 3 times.

2.4 急性毒性實(shí)驗(yàn)

背角無(wú)齒蚌48 h急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，PBDE-47對(duì)背角無(wú)齒蚌的半數(shù)致死濃度(LC50)為33.36 μg·L-1(表2)。最高濃度PBDE-209(160 μg·L-1)對(duì)背角無(wú)齒蚌的存活沒(méi)有顯著影響(表2)，因此，本實(shí)驗(yàn)中PBDE-209對(duì)背角無(wú)齒蚌的LC50值不能確定。

表2 PBDE-47和PBDE-209對(duì)背角無(wú)齒蚌的48 h急性毒性實(shí)驗(yàn)Table 2 The 48 h acute toxicity experiments for Anodonta woodiana exposed to PBDE-47 and PBDE-209

2.5 PBDE-47和PBDE-209對(duì)肝胰腺AwCAT表達(dá)的影響

在濃度為6.25、12.5、25、50和100 μg·L-1的PBDE-47處理組中，肝胰腺中AwCATmRNA水平顯著增加，并且這種上調(diào)效應(yīng)呈現(xiàn)時(shí)間和劑量依賴模式。與對(duì)照組相比，整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)程中AwCATmRNA水平在6.25、12.5、25、50和100 μg·L-1的PBDE-47處理組中分別增加了66.66%(P<0.05)、1.35倍(P<0.05)、1.54倍(P<0.05)、1.97倍(P<0.01)和2.39倍(P<0.01)以上(圖6)。

圖6 PBDE-47對(duì)背角無(wú)齒蚌肝胰腺AwCAT基因表達(dá)的影響注：數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差；n=5/組/時(shí)間點(diǎn)；a(P<0.05)、b(P<0.01)表示與相應(yīng)對(duì)照組相比有顯著差異；下同。Fig. 6 Temporal expression of AwCAT in the hepatopancreas of Anodonta woodiana after PBDE-47 exposureNote: Data are represented as means±SE; n=5/each group/each time point; a (P<0.05), b (P<0.01) mean significant difference vs control group at the same time; the same below.

與對(duì)照組相比，PBDE-209處理組AwCATmRNA水平呈現(xiàn)增加趨勢(shì)。在10、20、40、80和160 μg·L-1的處理組中，AwCAT表達(dá)水平分別增加了7.84%、35.38%、61.53%(P<0.05)、1.03倍(P<0.05)和1.09倍(P<0.05)以上(圖7)。

圖7 PBDE-209對(duì)背角無(wú)齒蚌肝胰腺AwCAT基因表達(dá)的影響Fig. 7 Temporal expression of AwCAT in the hepatopancreas of Anodonta woodiana after PBDE-209 exposure

2.6 PBDE-47和PBDE-209對(duì)鰓AwCAT表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，PBDE-47處理組鰓中AwCATmRNA水平在第6小時(shí)顯著升高，隨后隨時(shí)間呈降低的趨勢(shì)。在濃度為6.25、12.5和25 μg·L-1的PBDE-47處理組中，鰓中AwCATmRNA水平顯著增加；與對(duì)照組相比，整個(gè)實(shí)驗(yàn)觀察過(guò)程中AwCATmRNA水平在6.25、12.5和25 μg·L-1的PBDE-47處理組中分別增加了1.97倍(P<0.01)、58.68%(P<0.05)和52.77%(P<0.05)以上(圖8)。50 μg·L-1和100 μg·L-1的PBDE-47處理組中，鰓中AwCATmRNA水平在第48小時(shí)低于正常水平，分別減少了24.31%和58.68%(P<0.05) (圖8)。

圖8 PBDE-47對(duì)背角無(wú)齒蚌鰓AwCAT基因表達(dá)的影響Fig. 8 Temporal expression of AwCAT in the gill of Anodonta woodiana after PBDE-47 exposure

與對(duì)照組相比，PBDE-209處理組鰓中AwCATmRNA水平顯著增加。在10、20、40、80和160 μg·L-1的處理組中，AwCAT表達(dá)水平分別增加了85.71%(P<0.05)、1.52倍(P<0.05)、1.76倍(P<0.05)、2.02倍(P<0.01)和2.38倍(P<0.01)以上(圖9)。

圖9 PBDE-209對(duì)背角無(wú)齒蚌鰓AwCAT基因表達(dá)的影響Fig. 9 Temporal expression ofAwCAT in the gill of Anodonta woodiana after PBDE-209 exposure

3 討論(Discussion )

AwCAT序列包含一個(gè)是高度保守催化位點(diǎn)序列(61FDRERIPERVVHAKGAGA77)和一個(gè)是血紅素配體信號(hào)序列(351RLFSYSDTH358)，提示AwCAT屬于CAT家族的成員。多數(shù)CAT屬于單功能過(guò)氧化氫酶，是一種高度保守的含有4個(gè)同源性亞基的酶類，每個(gè)亞基能夠分別結(jié)合1個(gè)血紅素輔基和還原型輔酶[13-14]。血紅素是一種含鐵的輔基，常以鐵卟啉的形式存在，是CAT分子上的主要活性位點(diǎn)，它不僅參與催化H2O2形成無(wú)毒的H2O和O2，還能夠抑制脂質(zhì)過(guò)氧化作用，保護(hù)機(jī)體免受損傷[13-14]。多序列比對(duì)結(jié)果顯示，AwCAT和其他物種CAT均擁有保守的氨基酸殘基，如His72、Asn145和Tyr355。AwCAT的C端過(guò)氧化物酶體靶向信號(hào)ANL與人類、小鼠和大鼠CAT典型信號(hào)一致，提示AwCAT可能與脊椎動(dòng)物CAT家族大多數(shù)成員一樣具有過(guò)氧化物酶體糖蛋白的功能。哺乳動(dòng)物中，NADPH一般認(rèn)為與CAT緊密結(jié)合，并將底物(H2O2)提供給CAT，這一過(guò)程是通過(guò)CAT表面NADPH結(jié)合位點(diǎn)與血紅素基團(tuán)之間電子通道來(lái)完成和實(shí)現(xiàn)的[15-16]。AwCAT序列中12個(gè)氨基酸殘基與NADPH結(jié)合位點(diǎn)形成有關(guān)，其中，10個(gè)保守殘基(N145、H191、F195、S198、R200、Y212、K234、W300、Q302和Y355)發(fā)揮關(guān)鍵作用。AwCAT蛋白序列二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)結(jié)果顯示，AwCAT中α-螺旋和β-折疊數(shù)量與脊椎動(dòng)物數(shù)量相同，具有共同的保守殘基和空間結(jié)構(gòu)，提示AwCAT這些結(jié)構(gòu)特征與清除H2O2有關(guān)。

AwCAT在不同組織中具有不同的表達(dá)模式。肝胰腺中AwCATmRNA的表達(dá)水平最高，這與肝胰臟作為主要代謝場(chǎng)所和主要防御器官對(duì)氧化應(yīng)激的作用有關(guān)。類似的結(jié)果也在凡納濱對(duì)蝦和擬穴青蟹研究中發(fā)現(xiàn)[12]。肝胰腺相當(dāng)于哺乳動(dòng)物的肝臟和昆蟲的脂肪體，被認(rèn)為在非特異性免疫中發(fā)揮著重要的作用。由于其具有較高的代謝活性并且機(jī)體不斷產(chǎn)生活性氧，AwCAT基因高表達(dá)量表明它可能作為一種重要的肝胰腺解毒酶。在其他組織中AwCAT廣泛分布與不同器官中H2O2的氧化應(yīng)激效應(yīng)有關(guān)[12]。

在選定PBDE-47實(shí)驗(yàn)濃度時(shí)，PBDE-47的LC50為33.36 μg·L-1，但未檢測(cè)到PBDE-209的LC50，提示在相同的處理濃度下背角無(wú)齒蚌對(duì)PBDE-47脅迫效應(yīng)比對(duì)PBDE-209更為敏感。48 h急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，PBDEs對(duì)水蚤的48 h-LC50大小順序?yàn)椋篜BDE-28

研究發(fā)現(xiàn)，PBDE-47和PBDE-209處理后背角無(wú)齒蚌肝胰腺和鰓中AwCAT表達(dá)水平顯著增加，提示這與AwCAT增加機(jī)體H2O2和提高脅迫耐受性有關(guān)。白斑綜合征病毒感染后，日本囊對(duì)蝦肝胰腺CAT基因表達(dá)水平逐漸升高，48 h達(dá)到最高水平，以維持機(jī)體穩(wěn)態(tài)和抗氧化防御能力[18]。重金屬鉛(Pb2+)處理后，鯽魚血清乳酸脫氫酶和CAT活性明顯升高，以增強(qiáng)機(jī)體對(duì)重金屬的脅迫效應(yīng)和抗氧化能力[19]。Pb2+處理后太平洋牡蠣消化腺、鰓和閉殼肌中CAT表達(dá)呈現(xiàn)誘導(dǎo)效應(yīng)，以提升機(jī)體耐受力[20]。隨著進(jìn)入體內(nèi)的PBDE-47和PBDE-209增多，逐漸誘導(dǎo)產(chǎn)生大量活性氧自由基，進(jìn)而誘導(dǎo)超氧化物歧化酶活性不斷攀升，導(dǎo)致H2O2不斷升高。CAT作為H2O2濃度調(diào)節(jié)器，H2O2的升高，刺激體內(nèi)CAT表達(dá)釋放和水平升高，用于分解H2O2。由此可知，PBDE-47和PBDE-209處理后背角無(wú)齒蚌肝胰腺和鰓AwCAT表達(dá)水平顯著增加與增強(qiáng)動(dòng)物抗氧化能力和耐受性有關(guān)。

與對(duì)照組相比，不同濃度PBDE-47暴露后，前期AwCAT表達(dá)水平顯著上調(diào)，后期出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象，提示這與PBDE-47在背角無(wú)齒蚌體內(nèi)累積和代謝有關(guān)。正常情況下，動(dòng)物體內(nèi)ROS保持相對(duì)較低的水平，ROS生成后將迅速被一系列抗氧化酶清除，以維持ROS水平與抗氧化酶活性之間的平衡[21-22]。抗氧化酶是機(jī)體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要標(biāo)志之一。鰓作為貝類重要免疫器官，鰓絲直接接觸PBDE-47，并通過(guò)鰓絲呼吸作用迅速進(jìn)入機(jī)體，產(chǎn)生大量ROS，相對(duì)與肝胰腺而言，PBDE-47對(duì)鰓氧化應(yīng)激效應(yīng)更為直接和明顯。持續(xù)高劑量長(zhǎng)時(shí)間的PBDE-47暴露，將會(huì)導(dǎo)致進(jìn)入體內(nèi)PBDE-47超過(guò)鰓的解毒極限，鰓會(huì)受到損傷，鰓組織中大量細(xì)胞凋亡[23]。由此，處理后期AwCAT呈現(xiàn)表達(dá)水平下調(diào)的現(xiàn)象。在PBDE-209處理組中，鰓AwCAT表達(dá)呈時(shí)間和劑量依賴效應(yīng)，與所選擇的PBDE-209濃度未達(dá)到臨界值有關(guān)，動(dòng)物在這種濃度可以產(chǎn)生足夠的抗氧化能力，從而保持機(jī)體ROS生成和抗氧化酶還原作用之間的平衡。

由PBDE-47和PBDE-209對(duì)AwCAT時(shí)空表達(dá)誘導(dǎo)作用的特異性可以看出，PBDEs對(duì)背角無(wú)齒蚌脅迫是一個(gè)綜合的效應(yīng)，其產(chǎn)生氧化應(yīng)激后抗氧化系統(tǒng)啟動(dòng)，經(jīng)歷不同的暴露劑量和時(shí)間后產(chǎn)生損傷或修復(fù)。與相同濃度的PBDE-209相比，PBDE-47對(duì)這些非目標(biāo)生物的危害更大。

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