李倩,楊在亮,賀煒

1重慶市第六人民醫(yī)院,重慶 400060；2重慶市中醫(yī)院

肺癌是全球人類(lèi)癌癥死亡的主要原因之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2018年美國(guó)肺癌死亡人數(shù)約為15萬(wàn)余人[1]。肺癌主要分為兩類(lèi)，小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)。NSCLC又分為鱗癌、腺癌和大細(xì)胞癌。據(jù)報(bào)道，美國(guó)每年新發(fā)現(xiàn)23萬(wàn)病例中，有84%為NSCLC[2]，其主要臨床表現(xiàn)為咳嗽、痰中帶血。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNAs)是一個(gè)長(zhǎng)度為200 bp的轉(zhuǎn)錄本，其編碼蛋白質(zhì)的能力較低，與多種癌癥的生物學(xué)標(biāo)志物活性相關(guān)，如LncRNA-TDRG1在宮頸癌中高表達(dá)，并且在細(xì)胞生長(zhǎng)周期、細(xì)胞分化過(guò)程中發(fā)揮重要作用[3]。最近研究證實(shí)，LncRNAs參與多種腫瘤疾病的發(fā)生發(fā)展，如卵巢癌、胃癌[4]。核仁小RNA宿主基因5(SNHG5)被證實(shí)與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如胃癌[5]。Damas等[6]發(fā)現(xiàn)，在結(jié)直腸癌組織中SNHG5表達(dá)上調(diào)，并且與腫瘤的惡性進(jìn)展和不良生存呈正相關(guān)。微小RNA(miRNA)是長(zhǎng)度為20～22個(gè)核苷酸的非編碼RNA，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，如食管癌[7]。通常情況下，miRNA可與靶基因的3′-UTR結(jié)合，從而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖、遷移[8]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-26b靶向作用于巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶FUT4，從而抑制癌細(xì)胞的侵襲和遷移[9]。目前，LncRNA SNHG5與miR-26b在NSCLC中的具體作用機(jī)制尚不清楚。2013年1月—2016年12月，我們檢測(cè)了NSCLC組織中LncRNA SNHG5與miR-26b表達(dá)，探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取同期于重慶市第六人民醫(yī)院住院治療的NSCLC患者88例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)活檢病理或術(shù)后病理檢查明確診斷為NSCLC；②均為首次診斷，既往未接受過(guò)抗腫瘤治療；③臨床病理資料完整，且均通過(guò)患者及家屬的同意并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他呼吸系統(tǒng)疾病，如肺炎、肺氣腫；②合并其他系統(tǒng)疾病或惡性腫瘤，如胃癌、乳腺癌；③合并免疫功能缺陷疾病。88例患者中男59例、女29例，年齡38～73(55.34±3.7)歲，≥55歲者40例、<55歲者48例，吸煙68例。癌組織病理檢測(cè)結(jié)果：中低分化55例，高分化33例；TNM分期：Ⅰ期45例，Ⅱ期27例，Ⅲ期10例，Ⅳ期6例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移34例；腫瘤直徑≥3 cm 38例，<3 cm 50例。本研究通過(guò)重慶市第六人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 NSCLC組織及癌旁組織中LncRNA SNHG5與miR-26b表達(dá)檢測(cè) 應(yīng)用TRIzol法提取新鮮(離體30 min以?xún)?nèi))NSCLC及癌旁組織(距腫瘤邊緣﹥5 cm)中總RNA(試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司)，使用微量核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)RNA濃度，將符合標(biāo)準(zhǔn)的RNA凍存，備用。使用TaqMan miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Invitrogen公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件：37 ℃ 60 min、95 ℃ 5 min。反應(yīng)體系：1 μL dNTP，1 μL逆轉(zhuǎn)錄酶，1.5 μL 10×RT緩沖液，0.2 μL RNase抑制劑，1 μL RNA，3 μL miRNA-155/U6 RT引物和8 μL H2O。qPCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃延伸10 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系：10 μL 2×SYBR Green，1 μL 20×TaqDNA聚合酶，1 μL miRNA-155/U6 RT產(chǎn)物和8 μL H2O。SNHG5 正向引物：5′-TACTGGCTGCGCACTTCG-3′，反向引物：5′-CAGTAAAAGGGGAACACCA-3′；內(nèi)參基因U6正向引物：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物:5′-GGCTGAGAACTGAATTCCA-3′。miR-26b 正向引物：5′-UCCUUCAUUCCACCGGAGUCUC-3′，反向引物：5′-GACUCCGGUGGAAUGAAGGAUU-3′；以GAPDH作為內(nèi)參照，正向引物:5′-CGGATTTGGT-CGTATTGGG-3′，反向引物:5′-TGCTGGAAGATGGTGATGGGATT-3′。每個(gè)樣本至少重復(fù)3次試驗(yàn)，最后采集熒光信號(hào)，結(jié)果以2-ΔΔCt計(jì)算和標(biāo)準(zhǔn)化LncRNA SNHG5與miR-26b的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 隨訪 自患者出院起，每1～3個(gè)月隨訪1次，隨訪包括門(mén)診和電話兩種方式，隨訪時(shí)間3～60個(gè)月，隨訪至終止時(shí)間或患者死亡，隨訪時(shí)間截至2019年12月，收集患者生存數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC組織與癌旁組織中LncRNA SNHG5、miR-26b表達(dá)比較 LncRNA SNHG5在NSCLC組織及癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為1.63±0.62、1.95±0.52，NSCLC組織中LncRNA SNHG5的相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織(t=3.71，P<0.05)。miR-26b在NSCLC組織及癌旁組織中的相對(duì)表達(dá)量分別為0.76±0.14、1.60±0.45，NSCLC組織中miR-26b的相對(duì)表達(dá)量低于癌旁組織(t=16.72，P<0.05)。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，LncRNA SNHG5與miR-26b表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.328，P<0.05)。

2.2 NSCLC組織中LncRNA SNHG5、miR-26b表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系 NSCLC組織中LncRNA SNHG5、miR-26b相對(duì)表達(dá)量與TNM分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P均<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 NSCLC組織中LncRNA SNHG5、miR-26b表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 NSCLC組織中LncRNA SNHG5、miR-26b表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系 88例NSCLC患者均獲隨訪，無(wú)失訪病例。隨訪3年內(nèi)，共有39例患者死亡。NSCLC癌組織中LncRNA SNHG5相對(duì)表達(dá)量以中位數(shù)1.56為臨界值，分為高表達(dá)組43例、低表達(dá)組45例，LncRNA SNHG5高表達(dá)組3年總體生存率(OS)65.1%(28/43)，LncRNA SNHG5低表達(dá)組3年OS為46.7%(21/45)。Kaplan-Meier分析(Log-rank檢驗(yàn))結(jié)果顯示，LncRNA SNHG5高表達(dá)組3年總體生存率高于LncRNA SNHG5低表達(dá)組(χ2=4.265，P=0.038)。

miR-26b相對(duì)表達(dá)量以中位數(shù)0.72為臨界值，分為高表達(dá)組42例和低表達(dá)組46例。miR-26b高表達(dá)組3年OS為71.4%(30/42)，miR-26b低表達(dá)組3年OS為41.3%(19/46)。Kaplan-Meier分析(Log-rank 檢驗(yàn))結(jié)果顯示，miR-26b高表達(dá)組3年總體生存率低于miR-26b低表達(dá)組(χ2=3.862，P=0.049)。

3 討論

NSCLC早期臨床表現(xiàn)不明顯，一旦出現(xiàn)呼吸困難、胸痛、咳血等臨床癥狀時(shí)已為晚期，患者預(yù)后較差[2]。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是影響NSCLC預(yù)后的最重要因素之一。

LncRNA是一組非編碼RNA。近年來(lái)，LncRNA已被證實(shí)是細(xì)胞代謝過(guò)程中的調(diào)節(jié)劑[3]，如通過(guò)調(diào)節(jié)miRNA來(lái)促進(jìn)mRNA 的轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后翻譯，進(jìn)而影響蛋白質(zhì)表達(dá)。LncRNA SNHG5是LncRNA家族中的一員，其在前列腺癌、腎細(xì)胞癌及乳腺癌中均表達(dá)下調(diào)[10]，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中通過(guò)調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)通路發(fā)揮抑癌或致癌作用。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織中LncRNA SNHG5表達(dá)低于癌旁組織，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。其機(jī)制可能是當(dāng)LncRNA SNHG5表達(dá)下調(diào)時(shí)，細(xì)胞凋亡率下降，促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖及分化，腫瘤的惡性程度增加[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA SNHG5表達(dá)與NSCLC患者TNM分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。有文獻(xiàn)報(bào)道，LncRNA SNHG5通過(guò)調(diào)節(jié)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)來(lái)調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[11]。EMT是指上皮細(xì)胞惡變過(guò)程中逐漸失去上皮細(xì)胞的部分特征，如上皮屬性蛋白E-cadherin表達(dá)下調(diào)，使得細(xì)胞之間的黏附力降低、而運(yùn)動(dòng)能力逐漸增強(qiáng)，增強(qiáng)惡性變細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過(guò)程。LncRNA SNHG5表達(dá)下調(diào)，對(duì)細(xì)胞EMT過(guò)程的抑制能力減弱，間接促進(jìn)了腫瘤細(xì)胞的惡性進(jìn)展。此外，LncRNA SNHG5還可通過(guò)抑制轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白2來(lái)促進(jìn)細(xì)胞質(zhì)中蛋白合成，加速細(xì)胞的生長(zhǎng)周期，進(jìn)而促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖分化及轉(zhuǎn)移過(guò)程[12]。LncRNA SNHG5還可靶向抑制miR-32/Kruppel樣因子4軸的活性，激活其調(diào)節(jié)上調(diào)靶基因的功能，SNHG5的降低間接加快腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，加速腫瘤的惡性進(jìn)展[13]。

miRNA是非編碼的單鏈RNA，占人類(lèi)基因組序列的1%～3%，雖然數(shù)量較少，但卻具有較多生物學(xué)功能，如促進(jìn)細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育等[14]。miR-26家族是一個(gè)高度保守的小分子非編碼RNA，主要表達(dá)于心肌細(xì)胞，且在腫瘤細(xì)胞增殖、分化及凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[14]。miR-26b是miR-26家族的成員之一，其染色體位置為2號(hào)染色體基因CTDSP1第4個(gè)內(nèi)含子上，在肝癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胃癌中呈異常表達(dá)[15]。研究證實(shí)，乳腺癌組織中，miR-26b通過(guò)靶向調(diào)節(jié)下游靶基因(如CDK8、SLC7A11)來(lái)抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)及分化過(guò)程[15]。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組織中miR-26b表達(dá)低于癌旁組織，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。研究發(fā)現(xiàn)，miR-26b具有抑癌基因的作用，其通過(guò)抑制NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而抑制腫瘤細(xì)胞增殖[16]。當(dāng)NSCLC中miR-26b表達(dá)降低時(shí)，其抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用減弱，間接地對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖及分化過(guò)程起到促進(jìn)作用，增加癌細(xì)胞的惡性程度。本研究結(jié)果顯示，miR-26b表達(dá)與NSCLC患者TNM分期、組織分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-26b可通過(guò)抑制細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及停滯細(xì)胞的生長(zhǎng)周期來(lái)實(shí)現(xiàn)抑制癌組織的生長(zhǎng)分化過(guò)程[16]。另外，miR-26b可靶向調(diào)節(jié)蛋白酶氨酸磷酸酶IVA1來(lái)抑制肺癌細(xì)胞的增殖及遷移過(guò)程，因此，當(dāng)肺癌組織中miR-26b表達(dá)下調(diào)時(shí)，其抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡及遷移的作用減弱，對(duì)癌細(xì)胞的增殖及侵襲過(guò)程起到一定程度促進(jìn)作用，miR-26b表達(dá)越低，癌組織的惡性程度越高。miR-26b可通過(guò)激活Wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而刺激下游靶基因ZNRD1的表達(dá)，對(duì)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)起到積極促進(jìn)作用，加速腫瘤細(xì)胞的增殖及分化過(guò)程，進(jìn)一步增加腫瘤的惡性程度[17]。

本研究中LncRNA SNHG5和miR-26b的高表達(dá)組3年生存率均高于低表達(dá)組，說(shuō)明LncRNA SNHG5和miR-26b低表達(dá)很可能與NSCLC患者的不良預(yù)后相關(guān)，并有可能成為NSCLC預(yù)后不良的腫瘤標(biāo)志物。LncRNA SNHG5與miR-26b表達(dá)呈正相關(guān)，兩者在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮協(xié)同作用，共同促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化過(guò)程，但二者在NSCLC中的具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，NSCLC組織中LncRNA SNHG5和miR-26b表達(dá)均降低，與腫瘤組織分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者預(yù)后相關(guān)；檢測(cè)二者表達(dá)有助于NSCLC病情判斷及預(yù)后評(píng)估。