劉薇 于永波 陳敏 李蓓 張杰

國(guó)家兒童醫(yī)學(xué)中心，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科兒童耳鼻咽喉頭頸外科疾病北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，100045

Waardenburg綜合征（Waardenburg syndrome,WS）是一種較為常見的綜合征型遺傳性聾，人群發(fā)病率約為1/42000，占先天性耳聾的2%[1,2]。其病因可能是由于神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育缺陷或障礙而出現(xiàn)細(xì)胞異常增殖、生存、遷徙和分化，而黑色素細(xì)胞、聽覺神經(jīng)細(xì)胞及結(jié)腸神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均源自神經(jīng)嵴細(xì)胞，因此WS是一類以耳聾和著色異常為主要特征的綜合征性疾病[3]。根據(jù)臨床癥狀不同，將該病分為WS 1-4四個(gè)臨床亞型[4]，每一個(gè)臨床亞型的意義各有差異，WS的基因突變臨床上具有高度異質(zhì)性，這些基因相互作用，在疾病的發(fā)生和發(fā)展中占有不同地位。WS1主要致病基因是PAX3;WS2目前已報(bào)道的致病基因包括MITF、SOX10、SNAI2；WS3致病基因?yàn)镻AX3；WS4致病基因包括SOX10、EDNRB和EDN3。確定基因突變位點(diǎn)，從分子水平上了解疾病的病因，對(duì)于先證者自身預(yù)后及疾病的全面探究均有重大意義。本研究通過探究一WS2家系的臨床表型和基因分析，為WS的臨床鑒別提供了思路，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了SOX10基因一點(diǎn)突變，該位點(diǎn)在Deafness Variation Database數(shù)據(jù)庫中未收錄，屬于新發(fā)突變，具體介紹如下。

1 材料與方法

1.1 病例資料

本家系為就診于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科門診的一山西家系。共計(jì)2代，先證者及其父母。繪制家系圖譜（圖1），簽署知情同意書后，對(duì)先證者及其父母進(jìn)行全面查體（包括毛發(fā)、皮膚色素、骨骼肌肉、四肢關(guān)節(jié)、眼科）及臨床聽力學(xué)評(píng)估，詳細(xì)詢問既往史、家族史，每人抽取5ml外周靜脈血以進(jìn)行基因組DNA制備及候選基因突變篩查。

圖1 家系圖譜Fig.1 Family Tree

1.2 研究方法

1.2.1 聽力學(xué)檢查

先證者行聽性腦干反應(yīng)閾值及潛伏期（Auditory brainstem response,ABR）、穩(wěn)態(tài)聽覺誘發(fā)電位(Auditory steady state potential response,ASSR)、聲導(dǎo)抗、畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(Distortion product otoacoustic emission,DPOAE)和行為測(cè)聽；先證者父母行純音測(cè)聽檢查。ABR閾值≥80dBnHL者判定為極重度感音神經(jīng)性聾。ABR刺激類型為click、聲音強(qiáng)度單位為dBnHL;DPOAE為診斷型；ASSR最大刺激強(qiáng)度為35dBspl。

1.2.2 基因組DNA提取及文庫制備

采用QIAam全血DNA提取試劑盒（Qiagen公司，德國(guó)），按其說明書提取基因組DNA。取起始量3μg DNA，采用Covaris S2超聲儀（Covaris公司，美國(guó)）進(jìn)行超聲片段化。利用Nanodrop 2000樣本定量檢測(cè)儀（Thermo Fisher科技有限公司，美國(guó)）和Agilent2100生物分析儀（安捷倫科技公司，美國(guó)）進(jìn)行質(zhì)控，制備全基因組文庫。

1.2.3 目標(biāo)基因捕獲及高通量測(cè)序

應(yīng)用GenCap液相捕獲目標(biāo)基因技術(shù)（北京邁基諾公司），捕獲與耳聾相關(guān)基因的編碼外顯子區(qū)域。利用Illumina Nextseq 500第二代測(cè)序儀對(duì)捕獲到的區(qū)域進(jìn)行雙端測(cè)序，讀長(zhǎng)為150bp。

1.2.4 數(shù)據(jù)篩選與生物信息學(xué)分析

將目標(biāo)區(qū)域測(cè)序數(shù)據(jù)去除測(cè)序數(shù)據(jù)中的接頭和低質(zhì)量數(shù)據(jù)。運(yùn)用BWA軟件比對(duì)到參考基因組上（hg19版本），對(duì)測(cè)序深度、均一性、探針特異性等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。GATK軟件對(duì)各個(gè)樣本的比對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)的檢測(cè)，對(duì)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)和插入缺失突變(InDels)等數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析，篩選得到SNPs及 InDels在千人基因組、ESP6500si、Ex-AC_ALL、ExAC_EAS正常人群數(shù)據(jù)庫頻率小于等于 0.05，且 經(jīng) SIFT、PolyPhen2、MutationTaster、GERP++等數(shù)據(jù)庫預(yù)測(cè)結(jié)果均為致病性的位點(diǎn)作為與疾病相關(guān)的候選位點(diǎn)。

1.2.5 Sanger測(cè)序驗(yàn)證

根據(jù)先證者篩選得到的候選變異位點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成需要測(cè)序的DNA片段引物，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)方法對(duì)先證者及其父母DNA樣本進(jìn)行擴(kuò)增，使用ABI 3730xl測(cè)序儀（美國(guó)Applied Biosystems公司）以Sanger測(cè)序法進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用“Mutation Surveyor”軟件與參考序列進(jìn)行比對(duì)分析。

1.2.6 引物設(shè)計(jì)與合成

SOX10基因位于22q13.1區(qū)域，全長(zhǎng)12244bp，共有4個(gè)外顯子，mRNA轉(zhuǎn)錄本的長(zhǎng)度為2885bp，針對(duì)基因突變位點(diǎn)區(qū)域上下游約200bp設(shè)計(jì)相應(yīng)的引物進(jìn)行擴(kuò)增和Sanger測(cè)序驗(yàn)證。正向引物F416-B1_F序列AATCCACCCGAAGCTAGAGG，反向引物R416-B1_R序列GATGACAAGTTCCCCGTGTG。

2 結(jié)果

2.1 臨床結(jié)果

2.1.1 先證者

7個(gè)月男性患者，生后對(duì)聲音反應(yīng)差，聽力篩查未通過。無巨結(jié)腸病史，否認(rèn)耳毒性藥物服用史，否家族遺傳病史。查體：雙側(cè)虹膜藍(lán)染，無內(nèi)眥外移，無鼻根寬大，肢體活動(dòng)正常，毛發(fā)顏色大致正常，雙側(cè)耳廓外形正常，外耳道通暢，鼓膜完整，標(biāo)志清晰。ABR提示雙耳100dBnHL未引出，DPOAE未通過，雙側(cè)ASSR相關(guān)電位均無誘發(fā)波，行為測(cè)聽提示雙耳極重度感音神經(jīng)性聾，聲導(dǎo)抗雙耳“A”型曲線。根據(jù)WS臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，先證者診斷為WS2型。

2.1.2 先證者父母

語言發(fā)育正常，查體：虹膜顏色正常，無內(nèi)眥異位，肢體活動(dòng)正常，毛發(fā)顏色正常。純音測(cè)聽結(jié)果正常。家系圖譜如圖1所示。

2.2 基因結(jié)果

高通量測(cè)序結(jié)果顯示先證者位于SOX10基因的2號(hào)外顯子發(fā)生一處雜合突變，c.346C＞T（p.Q116X），即編碼區(qū)第346號(hào)核苷酸由胞嘧啶變異為胸腺嘧啶，造成氨基酸改變p.Q116X，即116位的谷氨酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子，導(dǎo)致基因編碼蛋白截?cái)?，從而喪失功能。HGMD數(shù)據(jù)庫未有該位點(diǎn)的相關(guān)性報(bào)道，ClinVar數(shù)據(jù)庫無該位點(diǎn)致病性分析結(jié)果；c.346C＞T的 CADD預(yù)測(cè) RawScore為 6.787656，PHRED分值為36，預(yù)測(cè)結(jié)果為“致病性”變異（圖2）。

圖2 突變位點(diǎn)CADD分值Fig.2 Score of CADD

生物信息學(xué)蛋白功能預(yù)測(cè)軟件SIFT、Poly-Phen_2、MutationTaster、GERP++、REVEL分別預(yù)測(cè)分別為未知、未知、有害、有害和未知(具體見表1)。根據(jù)ACMG指南[5,6]，該變異初步判定為致病性變異（Pathogenic），判定證據(jù)級(jí)別為 PVS1+PS2+PM2。經(jīng)家系驗(yàn)證分析，先證者父母該位點(diǎn)均無變異，此變異為新發(fā)突變（圖3）。保守性分析提示具有高度保守性，多個(gè)物種氨基酸序列一致（圖4）。

圖3 SOX10基因c.346C＞T突變位點(diǎn)Sanger測(cè)序圖。紅色箭頭表示突變位置，先證者發(fā)生c.346C＞T雜合突變，其父、其母該位置未檢測(cè)到突變Fig.3 Sanger sequence of c.346C＞T mutation site of SOX10.The red arrow indicates the mutation position.The proband has heterozygous mutation of c.346C＞T,and no mutation is detected at the position of the patient’s father and mother

圖4 p.Q116X在多個(gè)物種中具有高度的序列保守性Fig.4 p.Q116X has high sequence conservation in many species

3 討論

WS是一類具有高度臨床表型差異性及遺傳異質(zhì)性的疾病，即同一疾病，其臨床表現(xiàn)可能不同，同一臨床癥狀，其致病基因可能不同，同一致病基因的不同突變位點(diǎn)，其臨床分型亦不盡相同，因此WS是一類值得我們深入研究以豐富人類基因突變數(shù)據(jù)庫的綜合征性疾病。WS的主要癥狀之一即感音神經(jīng)性聾，從病理學(xué)上，由于耳蝸血管紋的形成需要黑色素細(xì)胞參與，黑色素細(xì)胞的缺失，導(dǎo)致血管紋縮小，耳蝸不發(fā)育，前庭膜塌陷及柯蒂氏器被破壞，從而導(dǎo)致聽力損失。WS2中耳聾的發(fā)生率較高，約占50%～87%[7]。

表1 蛋白功能預(yù)測(cè)Table 1 Protein Function Predict

WS2病例中，約15%由SOX10基因突變所致[8]。SOX10基因編碼的蛋白是一種轉(zhuǎn)錄因子，屬SOX基因超級(jí)家族成員，該家族蛋白特點(diǎn)為含有一高度保守的高活性組分結(jié)構(gòu)閾（high mobility group,HMG）。SOX10蛋白含有466個(gè)氨基酸，其主要功能是通過HMG結(jié)構(gòu)域識(shí)別并結(jié)合靶基因啟動(dòng)子DNA，導(dǎo)致DNA的構(gòu)象發(fā)生改變。SOX10蛋白之間可以通過單聚體或二聚體形式以多種方式激活靶基因并調(diào)節(jié)其轉(zhuǎn)錄，可直接或與其他轉(zhuǎn)錄因子協(xié)同作用于靶基因的轉(zhuǎn)錄，也可以和其他轉(zhuǎn)錄因子形成螯合復(fù)合體而間接影響靶基因的轉(zhuǎn)錄[8]。MITF、TYR、TYRP1、DCT、MPZ、GJB1、RET、DCT和EDNRB是其直接調(diào)控的下游靶基因[9]。多項(xiàng)研究表明，SOX10基因在內(nèi)耳發(fā)育早期高表達(dá)，并且表達(dá)持續(xù)整個(gè)內(nèi)耳發(fā)育時(shí)期，其在早期整兒耳板及耳囊廣泛表達(dá)，并不僅限于內(nèi)耳神經(jīng)嵴來源的黑色素細(xì)胞。SOX10基因突變可導(dǎo)致其下游靶基因表達(dá)異常，從而造成內(nèi)耳血管紋黑色素細(xì)胞和前庭及螺旋神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育異常，進(jìn)而引起耳聾。

目前報(bào)道的SOX10基因突變共有61種（http://grenada.lumc.nl/LOVD2/WS/），其中導(dǎo)致WS2的突變7種，均為無義突變或移碼突變，導(dǎo)致終止密碼子提前出現(xiàn)并產(chǎn)生蛋白截短體而致病。本研究中，SOX10基因c.346C＞T，導(dǎo)致氨基酸改變p.Q116X，亦為無義突變，該突變可能造成SOX10蛋白截短，c.346C＞T在正常人群數(shù)據(jù)庫中未出現(xiàn)，為低頻變異，在HGMD數(shù)據(jù)庫、Clinvar數(shù)據(jù)庫中均未報(bào)道過該位點(diǎn)致病性分析的結(jié)果。既往研究表明，SOX10通過與PAX3基因相結(jié)合，進(jìn)而活化下游靶基因MITF，部分學(xué)者認(rèn)為，SOX10突變后完全喪失了與PAX3結(jié)合的能力[10]，無法活化MITF，從而造成內(nèi)耳血管紋黑色素細(xì)胞和前庭及螺旋神經(jīng)節(jié)膠質(zhì)細(xì)胞發(fā)育異常。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，SOX10部分結(jié)構(gòu)發(fā)生變化不影響SOX10與PAX3基因的結(jié)合，但是影響MITF基因的活性，從而促使疾病的發(fā)生[11]。本研究中的SOX10突變后，可能造成蛋白截短，進(jìn)而導(dǎo)致SOX10部分功能喪失，引起WS的發(fā)生。同樣是SOX10基因突變，發(fā)生突變的位點(diǎn)不同，其作用機(jī)制不盡相同，引發(fā)的細(xì)胞發(fā)育異常及臨床癥狀亦不相同，這也是這個(gè)疾病值得探索的意義所在。

本研究從臨床和基因檢測(cè)兩方面給予患兒全面的診斷，基因診斷中發(fā)現(xiàn)了SOX10基因的新發(fā)突變位點(diǎn)，豐富了WS相關(guān)人類基因突變數(shù)據(jù)庫，為我們更好的認(rèn)識(shí)SOX10基因功能提供了新的線索。