武運(yùn)邦 謝紅 王金義 肖開蘋 潘欣陽 楊邯捷 趙惠亮 渠景連

【摘?要】?目的：研究血府逐瘀湯對(duì)肺纖維化（PF）大鼠肺組織上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的影響，并探討其可能機(jī)制。方法：將48只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、地塞米松組（0.000405 g·kg-1·d-1）和血府逐瘀湯高、中、低劑量組（14.04、7.02、3.51 g·kg-1·d-1），每組8只。除正常組外，其余各組大鼠均于氣管內(nèi)滴注博來霉素溶液建立PF模型。造模后第2天開始灌胃給藥，正常組和模型組予蒸餾水溶液（10 mL·kg-1·d-1）;各給藥組灌胃相應(yīng)藥物，每日1次，連續(xù)28 d。末次給藥24 h后，采用免疫組化法檢測大鼠肺組織中E-鈣黏蛋白（E-cadherin）和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA）的表達(dá)情況，采用Western blot法檢測大鼠肺組織中TGF-β1、Smad3的表達(dá)情況。結(jié)果：模型組大鼠肺組織E-cadherin表達(dá)顯著低于正常組（P<0.01），而α-SMA、TGF-β1、Smad3表達(dá)均顯著高于正常組（P<0.01）;與模型組比較，血府逐瘀湯高、中、低劑量組肺組織E-cadherin表達(dá)顯著升高（P<0.05或P<0.01），而α-SMA、TGF-β1、Smad3表達(dá)均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與地塞米松組比較，血府逐瘀湯低劑量組的E-cadherin表達(dá)顯著降低（P<0.05），而α-SMA、TGF-β1、Smad3表達(dá)均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：血府逐瘀湯可通過干預(yù)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化來減輕肺纖維化，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】?血府逐瘀湯;肺纖維化;上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

【中圖分類號(hào)】R285?【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A?【文章編號(hào)】1007-8517（2020）17-0011-06

Abstract：Objective To investigate the effects of Xuefu Zhuyu Tang on epithelial-mesenchymal transition （EMT） of lung tissue in pulmonary fibrosis（PF） model rats，and to explore its potential mechanism. Methods 48 Male SD rats were randomly divided?into normal group， model group， dexamethasone group（0.000405 g·kg-1·d-1）， Xuefu Zhuyu Tang high-dose， medium-dose and low-dose groups（14.04、7.02、3.51 g·kg-1·d-1）， with 8 rats in each group. Except for normal group， other groups were given endotracheal injection of?bleomycin to induce PF model. On the second day after modeling， normal group and modelgroup were given water intragastrically （10 mL·kg-1·d-1）， administration groups were given?relevant medicine intragastrically， once a day， for consecutive 28 days. 24hs after last medication， the expression of E-cadherin and α-SMA in lung tissue of rats were detected by immunohistochemistry method. The expression of TGF-β1 and Smad3 were detected by Western blotting assay. Results Compared with normal group， the expression of E-cadherin were decreased significantly in lung tissue of model group（P<0.01）， while the expression of α-SMA， TGF-β1 and Smad3 were increased significantly（P<0.01）. Compared with model?group， the expression of E-cadherin in lung tissue of rats were increased significantly in Xuefu Zhuyu Tang high-dose， medium-dose and low-dose groups（P<0.05 or P<0.01）， while the expression of α-SMA， TGF-β1 and Smad3 were decreased significantly（P<0.05 or P<0.01）.?Compared with dexamethasone group， the expression of E-cadherin were decreased?significantly， the expressipon of α-SMA， TGF-β1 and Smad3 were increased significantly（P<0.01）. Conclusion Xuefu Zhuyu Tang can relieve PF of model rats by intervening in EMT，the mechanism of which may be associated with inhibiting TGF-β1/Smad3 signaling pathway.

Keywords：Xuefu Zhuyu Tang; Pulmonary Fibrosis; Epithelial-Mesenchymal Transition

肺纖維化（Pulmonary Fibrosis，PF）是一種多病因且發(fā)病機(jī)制不明確的肺部疾病，其主要病理變化是初期的彌漫性肺泡炎和后期的成纖維細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞外基質(zhì)的過度沉積[1]。其中，肺泡上皮細(xì)胞的易損性、異常重塑、表型改變是肺纖維化發(fā)生的關(guān)鍵[2]。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal Transition，EMT）是上皮細(xì)胞向間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化的過程，在這一過程中，上皮細(xì)胞標(biāo)志物如E-鈣黏蛋白（E-cadherin） 逐漸丟失，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物如α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）表達(dá)升高[3]。研究表明，EMT與肺纖維化密切相關(guān)，它被證明是肌成纖維細(xì)胞的主要來源，而肌成纖維細(xì)胞通過分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與組織纖維化[4]。在EMT過程中，轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信號(hào)通路被激活，Smad3作為TGF-β信號(hào)通路中一個(gè)重要的組成部分，對(duì)于TGF-β1介導(dǎo)的EMT極其重要[5]。

中醫(yī)學(xué)理論認(rèn)為肺纖維化的病變實(shí)質(zhì)是“肺絡(luò)瘀滯”，故活血化瘀通絡(luò)是該病的主要治法。血府逐瘀湯出自于清代醫(yī)家王清任《醫(yī)林改錯(cuò)》，是活血化瘀的代表方劑。臨床研究表明，血府逐瘀湯對(duì)肺纖維化的抑制與改善作用明顯[6-7]，關(guān)于該方藥理作用的研究也逐漸增多，但尚未見從EMT角度進(jìn)行研究的報(bào)道。本研究以EMT為切入點(diǎn)，探討血府逐瘀湯對(duì)PF模型大鼠肺組織EMT的影響，并從TGF-β1/Smad3出發(fā)進(jìn)一步分析其可能機(jī)制，以期為闡明該方防治PF的作用機(jī)制提供參考。

1?材料

1.1?動(dòng)物?SPF級(jí)SD大鼠48只，雄性，體質(zhì)量（200±20）g，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（湘）2014-0011。

1.2?藥物與試劑?血府逐瘀湯由桃仁、川芎、桔梗、赤芍、枳殼、甘草、柴胡、紅花、當(dāng)歸、生地黃、牛膝組成，藥物購自貴陽同仁堂藥房。其中：桃仁（批號(hào)：170401， 產(chǎn)地：山東）;川芎（批號(hào)：170701， 產(chǎn)地：安徽）;桔梗（批號(hào)：170301， 產(chǎn)地：安徽）;赤芍（批號(hào)：170401 ，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古）;枳殼（批號(hào)：170401，產(chǎn)地：江西）;甘草（批號(hào)：180301，產(chǎn)地：新疆）;柴胡（批號(hào)：170301，產(chǎn)地：山西）;紅花（批號(hào)：171201，產(chǎn)地：新疆）;當(dāng)歸（批號(hào)：170701，產(chǎn)地：甘肅）;生地黃（批號(hào)：171201，產(chǎn)地：河南）;牛膝（批號(hào)：170401，產(chǎn)地：河南）。分別煎制濃縮為含生藥0.351、0.702、1.404 g·mL-1的合劑，每次制備3 d藥量，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

醋酸地塞米松片（批號(hào)：151238，浙江仙琚制藥股份有限公司）;博來霉素（批號(hào)：16032311，海正輝瑞制藥有限公司）;α-SMA抗體（一抗，兔源，批號(hào)：AG02247616，北京博奧森生物技術(shù)公司）;Smad3抗體（一抗，兔源，批號(hào)：GR3190902-12，英國abcam公司） ;TGF-β1抗體（一抗，兔源，批號(hào)：55e6713，Affinity公司）;E-鈣黏蛋白（E-cadherin）抗體（一抗，兔源，批號(hào)：18k0657，Affinity公司）;β-actin抗體（一抗，小鼠源，批號(hào)：48k2671）、山羊抗兔辣根過氧化酶標(biāo)記二抗（批號(hào)：3825j63）、山羊抗小鼠辣根過氧化酶標(biāo)記二抗（批號(hào)：1292k61）均購自美國Affinity Biosciences公司;Mayer蘇木素染液（批號(hào)：20170526）、DAB顯色試劑盒（批號(hào)：20170511）均購自北京索萊寶科技有限公司;BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)：SE248353，美國Thermo Scientific公司）;ECL發(fā)光液（批號(hào)：1716501）、PVDF膜（批號(hào)：MB0323）均購自默克密理博有限公司。

1.3?主要儀器?Allegra X-30R離心機(jī)（美國BECKMAN公司）;GNP-9080隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司）;1150H石蠟包埋機(jī)（德國Leica公司）;RM2265輪轉(zhuǎn)切片機(jī)（德國Leica公司）;PL303電子天平（梅特勒-托利多儀器公司）;BX 53顯微圖像采集系統(tǒng)（日本OLYMPUS公司）;PowerPacTMBasic電泳儀（美國Bio-Rad公司）;ChemiDocTM XRS+with Image LabTM Software凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）等。

2?方法

2.1?動(dòng)物分組及模型制備?將大鼠常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，隨機(jī)分為6組：正常組、模型組、地塞米松組、血府逐瘀湯高、中、低劑量組，每組8只。除正常組外，其余各組均采用氣管滴注博來霉素復(fù)制PF模型[8]：用10%水合氯醛3 mL·kg-1麻醉大鼠后，頸部皮膚消毒，剪去頸部鼠毛，行頸正中切口，分離暴露氣管。經(jīng)氣管軟骨環(huán)間隙向心端穿刺注入博來霉素5 mg /kg，在注射過程中必須非常緩慢的注入，并且邊注射邊觀察大鼠胸廓的起伏，防止堵塞氣道，導(dǎo)致大鼠的死亡。注射完成后立即將動(dòng)物直立并旋轉(zhuǎn)，使藥液在肺內(nèi)分布充分、均勻，然后縫合皮膚。正常組動(dòng)物在同樣條件下注入等量生理鹽水。術(shù)后讓大鼠自由飲水、進(jìn)食。

2.2?給

3.2?血府逐瘀湯對(duì)肺纖維化大鼠肺組織TGF-β1、Smad3表達(dá)的影響?模型組大鼠肺組織TGF-β1、Smad3的表達(dá)顯著高于正常組（P<0.01）。與模型組比較，血府逐瘀湯高、中、低劑量組肺組織TGF-β1、Smad3表達(dá)均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;與地塞米松組比較，血府逐瘀湯低劑量組的TGF-β1、Smad3表達(dá)顯著升高（P<0.01）。見表2、圖3。

4?討論

PF是肺組織受損后人體自身修復(fù)的結(jié)果，也是以成纖維細(xì)胞增殖以及細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積并伴炎癥損傷、組織結(jié)構(gòu)破壞為特征的多種肺部疾病的最終結(jié)局。臨床主要表現(xiàn)為干咳、進(jìn)行性呼吸困難，且隨著病情加重，呼吸功能不斷惡化，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。如前所述，EMT是上皮細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上發(fā)生間充質(zhì)細(xì)胞表型的轉(zhuǎn)變，其在PF和肌成纖維細(xì)胞活化的發(fā)展中起關(guān)鍵作用。EMT發(fā)生時(shí)，上皮細(xì)胞極性消失，上皮細(xì)胞標(biāo)志物下調(diào)，細(xì)胞骨架重排，遷移和運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，同時(shí)獲得間質(zhì)細(xì)胞特性，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物上調(diào)[3]。

研究表明，多種細(xì)胞因子參與了EMT過程，尤其是TGF-β1，是目前公認(rèn)的促進(jìn)EMT的核心細(xì)胞因子[9]，在此過程中，TGF-β1促進(jìn)了上皮細(xì)胞表型的丟失。TGF-β1介導(dǎo)EMT的途徑眾多，但主要依賴Smad途徑[10]。Smad蛋白家族是一類細(xì)胞內(nèi)TGF-β受體激酶的底物[11]，其本身既是轉(zhuǎn)錄因子，也是其他轉(zhuǎn)錄因子如Slug、Snail、Scatter、淋巴增強(qiáng)因子1、β連環(huán)蛋白等的誘導(dǎo)物[12]。Smad3控制一系列Smad依賴的靶基因轉(zhuǎn)錄[13]，TGF-β1受體絲氨酸-蘇氨酸激酶激活Smad2/3后，使其磷酸化，Smad3與Smad4結(jié)合形成復(fù)合物進(jìn)入到細(xì)胞核，從而與其他轉(zhuǎn)錄因子共同調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄，最終導(dǎo)致EMT及PF的發(fā)生。Wang等[14]在博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化模型小鼠中發(fā)現(xiàn)，熱休克蛋白27和Smad3表達(dá)均增加，進(jìn)而激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號(hào)通路促進(jìn)EMT。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為PF的病變實(shí)質(zhì)是“肺絡(luò)瘀滯”。肺為嬌臟，外易受六淫之邪，內(nèi)可生瘀血為患，諸因素均可閉阻氣機(jī)，導(dǎo)致肺絡(luò)之氣血運(yùn)行受阻，氣血不暢，更易釀生瘀血，從而造成肺絡(luò)瘀滯而發(fā)病[15]。李菊蓮等[16]也認(rèn)為本病早期毛細(xì)血管增生、擴(kuò)張、充血，管壁增厚，晚期由于大量纖維結(jié)締組織增殖而收縮，毛細(xì)血管數(shù)量減少甚至閉鎖，說明PF存在肺絡(luò)瘀滯病機(jī)?！敖j(luò)以通為用”，因此，治療本病當(dāng)以活血通絡(luò)為主。血府逐瘀湯是王清任所創(chuàng)的活血化瘀五大名方之一，由桃仁、紅花、當(dāng)歸、生地黃、川芎、赤芍、牛膝、桔梗、柴胡，枳殼、甘草組成。諸藥合用，不僅可行血分之瘀滯，又可解氣分之郁結(jié)，寓行氣于活血之中，寓養(yǎng)于行散之中，活血而不耗血，袪瘀又能生新，升降同用，使瘀血下行，氣機(jī)暢達(dá)，臟腑和調(diào)?，F(xiàn)代藥理研究表明，血府逐瘀湯可通過抑制Smad3、MMP-7的蛋白表達(dá)來降低肺纖維化程度[17]，此外對(duì)氧自由基損傷也有不同程度的干預(yù)作用，并可通過降低血清HA、肺組織HYP、膠原蛋白含量及提高彈性纖維含量來改善其細(xì)胞外基質(zhì)代謝[18]。在此基礎(chǔ)上，本研究以療效較好的地塞米松為陽性對(duì)照，探討了血府逐瘀湯對(duì)PF模型大鼠肺組織中上皮細(xì)胞標(biāo)志物、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)以及TGF-β1/Smad3信號(hào)通路的影響。

本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織E-cadherin表達(dá)較正常組顯著降低，而α-SMA表達(dá)較正常組顯著升高，提示模型復(fù)制成功。給予不同劑量的血府逐瘀湯后，各給藥組大鼠E-cadherin表達(dá)顯著升高，而α-SMA表達(dá)顯著降低，表明該方可不同程度地上調(diào)E-cadherin表達(dá)，下調(diào)α-SMA表達(dá)，提示該方防治PF的作用可能與抑制EMT有關(guān)。進(jìn)一步研究結(jié)果顯示，模型組大鼠肺組織中TGF-β1、Smad3的表達(dá)顯著升高，提示PF發(fā)生后TGF-β1/Smad3信號(hào)通路被激活，給予不同劑量的血府逐瘀湯后，大鼠肺組織TGF-β1、Smad3表達(dá)均顯著降低，提示血府逐瘀湯治療PF的機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路有關(guān)。此外，本研究結(jié)果還顯示，血府逐瘀湯低劑量組大鼠肺組織E-cadherin表達(dá)顯著低于地塞米松組，α-SMA、TGF-β1、Smad3表達(dá)顯著高于地塞米松組，而中、高劑量組與地塞米松組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示中劑量組（7.02g·kg-1·d-1）、高劑量組（14.04 g·kg-1·d-1）血府逐瘀湯對(duì)PF模型的改善作用與地塞米松相當(dāng)。

綜上所述，血府逐瘀湯可通過干預(yù)EMT來減輕模型大鼠的肺纖維化，其機(jī)制可能與抑制TGF-β1/Smad3信號(hào)通路有關(guān)，但其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1]黃云鑒. 肺纖維化中醫(yī)治療數(shù)據(jù)挖掘及養(yǎng)肺活血方干預(yù)機(jī)制研究[D]. 南京：南京中醫(yī)藥大學(xué)，2017.

[2]李洪，王昌明. 肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J]. 廣西醫(yī)學(xué)，2018，40（19）：2325-2327，2331.

[3]NIETO M A， HUANG R Y J， JACKSON R A， et al. EMT： 2016 [J]. Cell， 2016，166（1）： 21-45.

[4]BARTIS D，MISE N， MAHIDA R Y， et al. Epithelial-mesenchymal transition in lung development and disease： does it exist and is it important[J]. Thorax， 2014，69（8）：760-765.

[5]BAE E，KIM S J，HONG S， et al. Smad3 linker phosphorylation attenuates Smad3 transcriptional activity and TGF-β1/Smad3-induced epithelial–mesenchymal transition in renal epithelial cells[J]. Biochemical & Biophysical Research Communications， 2012，427（3）：593-599

[6]宋遠(yuǎn)瑛. 血府逐瘀湯治療老年特發(fā)性肺纖維化患者的臨床療效[J]. 實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志， 2016，20（9）：155，159.

[7]吳瓊，馬海洋，王志武，等. 活血化瘀法對(duì)肺癌放療后肺纖維化的抑制作用[J]. 中國臨床研究，2017，30（9）：1261-1263.

[8]TAOOKA Y，MAEDA A，HIYAMA K，et al. Effects of neutrophilelastase inhibitor on bleomycin-induced pulmonary fibrosisin mice[J]. AM J Respi Crit Care Med，1997，156 （1）：260-265.

[9]GASIOR K， WAGNER N J， CORES J，et al. The role of cellular contact and TGF-beta signaling in the activation of the epithelial mesenchymal transition （EMT）[J]. Cell Adhesion & Migration， 2019，13（1）：63-75.

[10]CHITRA P， SAIPRASAD G， MANIKANDAN R， et al. Berberine inhibits Smad and non-Smad signaling cascades and enhances autophagy against pulmonary fibrosis[J]. J Mol Med， 2015，93（9）：1015-1031.

[11]張秀莉，邱靜，李萬成. 肺纖維化中microRNA-29對(duì)TGF-β1/Smad3通路調(diào)控機(jī)制[J].國際呼吸雜志，2018，38（8）：627-630.

[12]COWARD W R， SAINI G， JENKINS G.The pathogenesis of idiopathic pulmonaryfibrosis[J]. Ther Adv Respir Dis， 2010，4（6） ：367-388.

[13]SAVAGNER P. Leaving the neighborhood：molecular mechanisms involved during epithelial-mesenchymal transition [J]. Bioessays， 2001，23（10）：912-923.

[14]WANG G， JIAO H， ZHENG J N， et al. HSP27 regulates TGF-β mediated lung fibroblast?differentiation through the Smad3 and ERK pathways[J]. Int J Mol Med，2017，39（1）： 183-190.

[15]渠景連. 養(yǎng)肺通絡(luò)法干預(yù)Notch信號(hào)通路防治肺纖維化的機(jī)制研究[D]. 南京：南京中醫(yī)藥大學(xué).2015.

[16]李菊蓮，王宇，鄧海娟. 肺痹與肺間質(zhì)纖維化關(guān)系探討[J]. 甘肅科技，2003，19（12）：113-114.

[17]王祺，于雪峰，齊越，等. 血府逐瘀湯干預(yù)肺纖維化大鼠作用機(jī)制研究[J]. 實(shí)用藥物與臨床，2019，22（6）：580-584.

[18]黃霞，劉惠霞，劉超，等. 血府逐瘀湯對(duì)肺間質(zhì)纖維化動(dòng)物氧化應(yīng)激及細(xì)胞外基質(zhì)代謝的干預(yù)作用[J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2012，35（11）：752-756.

（收稿日期：2020-04-09?編輯：劉斌）