陸 橋 聶武藝 胡勇軍

( 華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨廣州市光譜分析與功能探針重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 廣州 510631)

1 引言

激光自發(fā)明以來已被應(yīng)用于多種領(lǐng)域，尤其是與生命科學(xué)的結(jié)合更是研究的熱點(diǎn)和前沿[1]，它被譽(yù)為“一把鋒利的刀”。激光技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)的結(jié)合始于1963年，由美國(guó)科學(xué)家Honig提出，最初應(yīng)用于分子反應(yīng)動(dòng)力學(xué)和光電離光譜等基礎(chǔ)科學(xué)的研究[2]。隨后，研究人員又將這一技術(shù)應(yīng)用到分析化學(xué)領(lǐng)域，用于對(duì)無(wú)機(jī)材料、芳香族化合物、生物材料、氨基酸、藥物、有機(jī)酸代謝產(chǎn)物等分析中。最開始比較成功的應(yīng)用是激光解吸電離質(zhì)譜技術(shù)(LDI-MS)，它很好地解決了質(zhì)譜對(duì)小分子分析的困擾且實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的原位分析[7]。然而這種方法的檢測(cè)靈敏度相對(duì)較低，易產(chǎn)生碎片離子峰，且只適合于分析分子量低于500的小分子化合物，而大部分生物組織內(nèi)源物如磷脂，其分子量都在600以上，因而LDI-MS技術(shù)沒能在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

在LDI-MS的基礎(chǔ)上，上世紀(jì)80年代，分析化學(xué)家們又提出了將一束激光解吸電離改成用兩束激光分別完成對(duì)樣品的解吸和離子化任務(wù)，然后用質(zhì)量分析器對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，這一方法被稱為激光解吸后電離質(zhì)譜法(LDPI-MS)[8, 9]。兩束激光的時(shí)空可調(diào)性以及第二束電離激光的引入也大大提高了對(duì)樣品的離子化效率，使得其可以檢測(cè)到只用第一束激光無(wú)法探測(cè)到的樣品信號(hào)。當(dāng)前質(zhì)譜成像(MSI)技術(shù)日趨成熟，已被廣泛應(yīng)用于諸多領(lǐng)域，而與LDPI結(jié)合的MSI技術(shù)，即LDPI-MSI，兼具兩種技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，也開始得到分析學(xué)家和儀器學(xué)家的關(guān)注。生物技術(shù)的快速發(fā)展以及亟待解決的生命科學(xué)問題也促進(jìn)了LDPI-MSI技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，同時(shí)也對(duì)其提出了一些挑戰(zhàn)。本文將深入闡述LDPI-MSI的基本原理和影響LDPI過程中離子化效率的重要參數(shù)，同時(shí)介紹LDPI-MSI技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)分析研究中的應(yīng)用。

2 激光解吸后電離質(zhì)譜成像技術(shù)原理

2.1 基本原理介紹

LDPI-MS與LDI-MS及基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)質(zhì)譜法不同，其基本原理如圖1所示。在該系統(tǒng)中，兩束激光的燈泵和Q開關(guān)觸發(fā)信號(hào)線被同時(shí)連接在一個(gè)延時(shí)觸發(fā)器上，可以分別優(yōu)化兩束激光的能量和延時(shí)間隔。同時(shí)，可以通過光學(xué)元件來調(diào)整兩束激光的空間位置，從而實(shí)現(xiàn)了在時(shí)間和空間上對(duì)改離子源的同時(shí)優(yōu)化。第一束激光為解吸激光，其作用是使樣品在很短的時(shí)間內(nèi)得以解吸/氣化，一般使用納秒級(jí)或更短脈沖的激光，這對(duì)于熱不穩(wěn)定且難以揮發(fā)的物質(zhì)極為關(guān)鍵。這束激光一般采用低功率密度的可見波段的激光，但有時(shí)為了特殊需要也使用紅外激光、紫外激光，甚至是真空紫外或極紫外激光。當(dāng)解吸激光照射到樣品上時(shí)，待測(cè)樣品就會(huì)吸收光子并迅速將其大部轉(zhuǎn)換成熱能，使樣品在瞬間被氣化而從樣品解吸出來，這可以避免樣品分子因長(zhǎng)時(shí)間受熱而發(fā)生裂解。經(jīng)過解吸激光的照射后，在離樣品表面垂直距離約2 mm內(nèi)將會(huì)形成一個(gè)微小的樣品分子組成的氣團(tuán)，該氣團(tuán)中的大部分粒子是電中性的，只有少部分是帶電粒子，其中性粒子數(shù)目是帶電粒子的1000倍以上。當(dāng)經(jīng)過一定時(shí)間的延遲后(時(shí)間一般在微秒級(jí)，根據(jù)氣團(tuán)離樣品的距離而不同)，觸發(fā)第二束激光(電離激光)，該激光被聚焦到該氣團(tuán)上并將氣態(tài)的樣品分子電離，離子隨后被引入質(zhì)量分析器而被檢測(cè)到。

圖1 激光解吸后電離質(zhì)譜成像裝置原理圖和兩束激光觸發(fā)時(shí)序圖

在獲得單點(diǎn)樣品的質(zhì)譜信號(hào)后，研究人員又設(shè)想對(duì)樣品進(jìn)行逐點(diǎn)探測(cè)以獲取整個(gè)樣品表面的質(zhì)譜信息。他們通過在激光解吸樣品的時(shí)候有規(guī)律地移動(dòng)樣品，同時(shí)記錄樣品的位置信息和質(zhì)譜峰信息。然后將每一個(gè)點(diǎn)的質(zhì)譜信息與位置逐一對(duì)應(yīng)，獲得整個(gè)樣品每個(gè)點(diǎn)的質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度“熱圖”，即為質(zhì)譜成像圖。MSI是一種結(jié)合質(zhì)譜分析和影像可視化的分子成像技術(shù)，作為分子成像及質(zhì)譜領(lǐng)域研究的前沿和熱點(diǎn)，近年來受到研究人員高度的關(guān)注并得到迅速發(fā)展[11]。它可對(duì)生物組織樣品進(jìn)行多組分檢測(cè)、多維數(shù)據(jù)獲取，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)多種分子進(jìn)行高靈敏度地同時(shí)檢測(cè)，與此同時(shí)，它還能夠直接提供目標(biāo)化合物在生物組織中的空間分布信息。與其他成像技術(shù)相比，MSI技術(shù)無(wú)需利用放射性同位素或熒光進(jìn)行標(biāo)記，樣品前處理簡(jiǎn)單。因此本文所介紹的LDPI-MSI的基本原理就是在LDPI-MS基礎(chǔ)上引入MSI技術(shù)，實(shí)現(xiàn)獲取樣品的成分信息和分子分布信息。

2.2 解吸激光的選擇及對(duì)成像分辨率的影響

解吸激光的波長(zhǎng)、脈寬、能量、光斑大小等因素對(duì)樣品的解吸效率具有決定性作用[12]。陸橋等人在LDPI-MS裝置上使用光學(xué)參量震蕩/放大器(OPO/OPA)輸出的1.5～5.0 μm波長(zhǎng)的紅外激光作為解吸光源，并與傳統(tǒng)解吸激光波段532 nm和1064 nm作對(duì)比，發(fā)現(xiàn)生物組織樣品更易吸收紅外激光，在其它條件相同的情況下表現(xiàn)出更強(qiáng)的質(zhì)譜信號(hào)。崔揚(yáng)等人利用脈寬為75 fs、波長(zhǎng)為800 nm的近紅外飛秒激光對(duì)樣品進(jìn)行剝蝕，同時(shí)利用光闌對(duì)激光光斑進(jìn)行壓縮，實(shí)現(xiàn)了2.0 μm的橫向成像分辨率[14]。在解吸激光波長(zhǎng)的選擇上也應(yīng)考慮樣品分子的吸收波長(zhǎng)，應(yīng)使用最靠近分子最大吸收峰的激光波長(zhǎng)。此外，相同能量下的激光，脈寬越短，其功率密度越高，因此選擇短脈沖的激光，可以降低激光的能量，在對(duì)樣品解吸過程中可降低對(duì)樣品的破壞程度[15]?；诩す獾膫鹘y(tǒng)MSI技術(shù)，由于受光的衍射極限限制(≈λ/2N.A.，其中N.A.為數(shù)值孔徑)，激光的聚焦光斑直徑最小不低于光的半波長(zhǎng)。除此之外，聚焦透鏡存在球差和相差，使得激光遠(yuǎn)場(chǎng)聚焦光斑大小會(huì)遠(yuǎn)大于理論值。近些年近場(chǎng)技術(shù)的發(fā)展很好地解決了光的衍射極限問題，使得激光的聚焦光斑大小突破到亞微米級(jí)。Zenobi等人在近場(chǎng)掃描顯微鏡的基礎(chǔ)上構(gòu)建近場(chǎng)激光解吸系統(tǒng)，可以將解吸激光聚焦到直徑為200 nm以下，實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的高分辨成像[16]。

2.3 電離激光的選擇

紫外光或者真空紫外光作為第二束激光已經(jīng)廣泛應(yīng)用于LDPI-MSI技術(shù)中，真空紫外激光(光子的能量為7～11 eV)可以通過單光子吸收對(duì)絕大多數(shù)的分子進(jìn)行“軟”電離，這樣可避免分子裂解而產(chǎn)生大量的碎片離子峰[17]。準(zhǔn)分子激光器產(chǎn)生的157 nm波長(zhǎng)的激光由于其相對(duì)較高的光子密度及成熟的商業(yè)化機(jī)型，許多實(shí)驗(yàn)室將其作為后電離激光的優(yōu)選[18，19]。但是，對(duì)于電離能高于157 nm單光子能量的樣品分子，不能對(duì)該分子實(shí)現(xiàn)單光子電離，因而會(huì)產(chǎn)生碎片。其它諸如產(chǎn)生248 nm波長(zhǎng)的KrF準(zhǔn)分子激光器以及產(chǎn)生160 nm波長(zhǎng)的H2準(zhǔn)分子激光器也存在同樣的問題[20]。劉平等人比較了118 nm波長(zhǎng)的真空紫外激光與355 nm和266 nm波長(zhǎng)的紫外激光作為后電離源后，發(fā)現(xiàn)118 nm激光作為后電離激光時(shí)分子碎片率較低，母體離子峰相對(duì)更強(qiáng)[5]。使用同步輻射光源作為后電離光時(shí)，由于其可調(diào)諧性，可針對(duì)不同分子有不同的垂直電離能而選擇不同波長(zhǎng)的光，實(shí)現(xiàn)對(duì)分子的單光子電離[17，21，22]。此外，共振增強(qiáng)了多光子電離(REMPI)配合超聲分子束冷卻技術(shù)也可以實(shí)現(xiàn)對(duì)樣品分子的“軟”電離[23，24]。

2.4 影響離子產(chǎn)率的參數(shù)

除了兩束激光的自身性質(zhì)會(huì)對(duì)樣品的離子化效率產(chǎn)生影響外，兩束光之間的延遲時(shí)間及第二束光與樣品臺(tái)的垂直距離均會(huì)對(duì)電離效率產(chǎn)生重大影響。通過優(yōu)化兩束光之間的延遲時(shí)間及第二束光與樣品臺(tái)的垂直距離, 可以極大地提高電離的效率，有助于質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度和質(zhì)譜分辨率的提高。如圖2所示，陸橋等人通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜信號(hào)強(qiáng)度會(huì)隨延時(shí)的增加先增加然后降低，也會(huì)隨電離光與樣品臺(tái)的垂直距離的增加先增加然后降低[25]。只有在恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間節(jié)點(diǎn)和位置才能獲得最佳的質(zhì)譜信號(hào)。對(duì)于利用具有大氣壓接口的四極桿/飛行時(shí)間質(zhì)譜儀的LDPI實(shí)驗(yàn)，由于離子傳輸?shù)膯栴}，離子源所處環(huán)境的氣壓大小也會(huì)對(duì)質(zhì)譜信號(hào)有極大的影響[26]。

圖2 影響激光解吸后電離離子產(chǎn)率的兩個(gè)因素(a).兩束激光的延時(shí)時(shí)間；(b).電離激光與樣品靶的距離

3 在生物醫(yī)學(xué)分析中的應(yīng)用

3.1 對(duì)藥物在生物體內(nèi)作用機(jī)理的研究

對(duì)藥物在生命體內(nèi)的作用機(jī)理研究一直是藥學(xué)家、生命科學(xué)家等的研究熱點(diǎn)。通過質(zhì)譜成像技術(shù)我們可以清晰且直觀地觀察到藥物的作用部位以及藥物代謝情況[27]。Heeren等人利用LDPI-MSI技術(shù)闡述了阿霉素、紫杉醇、曲安奈德等藥物在病人組織區(qū)域內(nèi)的分布，揭示了藥物在人體內(nèi)的作用部位和機(jī)理。Akhmetov等人對(duì)表皮葡萄球菌生物膜上的利福平藥物進(jìn)行成像，模擬研究了該藥物的擴(kuò)散機(jī)制[28]。近些年質(zhì)譜成像技術(shù)的快速發(fā)展也促進(jìn)了激光解吸后電離質(zhì)譜成像(LDPI-MSI)技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用，尤其是對(duì)生物樣品進(jìn)行質(zhì)譜成像。在生物組織層面，楊晴等人以及劉平等人利用LDPI-MS實(shí)現(xiàn)了對(duì)小鼠腎臟組織中抗癌藥物分子的探測(cè)[29，30]。陳家新等人在此基礎(chǔ)上配合質(zhì)譜成像技術(shù)，揭示了藥物分子在組織中的分布，為藥物開發(fā)及藥代動(dòng)力學(xué)研究提供了理論支撐，他們以實(shí)驗(yàn)小鼠為模型，通過研究藥物在給藥小鼠腎臟組織中的分布來探討藥物代謝機(jī)理[31，32]。陸橋等人在此基礎(chǔ)上創(chuàng)造性地提出在生物組織樣品上添加生物相容性較好的納米材料，提高了解吸激光對(duì)樣品的解吸效率，以此檢測(cè)到傳統(tǒng)技術(shù)難以探測(cè)到的低濃度藥物分子。崔揚(yáng)等人將飛秒激光作為第一束解吸激光對(duì)培養(yǎng)的生物膜的內(nèi)源物進(jìn)行了“低損”質(zhì)譜成像分析[33]。

3.2 在疾病診斷中的應(yīng)用

LDPI-MSI技術(shù)在醫(yī)學(xué)疾病診斷中也占據(jù)越來越重要的地位。陸橋等人通過構(gòu)建對(duì)實(shí)驗(yàn)小鼠接種腫瘤，利用LDPI-MSI技術(shù)探測(cè)腫瘤及癌旁組織中葉酸分子的分布情況，間接鑒別出腫瘤與非腫瘤組織區(qū)域[25]。相比于其他的傳統(tǒng)方法，該方法操作簡(jiǎn)便，無(wú)復(fù)雜的樣品前處理及標(biāo)記過程。這一方法對(duì)腫瘤的組織病理學(xué)檢測(cè)具有極大的應(yīng)用潛力，對(duì)腫瘤的外科手術(shù)治療具有潛在的指導(dǎo)價(jià)值。Niehaus等人利用LDPI-MSI技術(shù)對(duì)生物組織中內(nèi)源性物質(zhì)的分布進(jìn)行分析，可以通過檢測(cè)內(nèi)源物分布及含量變化推測(cè)出致病機(jī)理。這一方法對(duì)組織病理學(xué)檢測(cè)是一種極大的補(bǔ)充，它可以讓我們看到組織病理學(xué)不能給出的分子信息[34]。

3.3 對(duì)單細(xì)胞的分析

細(xì)胞是生命體的基本單元，對(duì)細(xì)胞的研究是揭露生命的起源以及對(duì)生命科學(xué)研究的重要途經(jīng)。包括LDPI-MSI在內(nèi)的質(zhì)譜技術(shù)在單細(xì)胞分析領(lǐng)域起到越來越重要的作用。目前基于激光的質(zhì)譜技術(shù)對(duì)單細(xì)胞分析的最大難點(diǎn)是解吸激光難以聚焦到亞微米級(jí)，因而無(wú)法對(duì)亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)進(jìn)行成像分析。當(dāng)?shù)谝皇す饩劢构獍咦銐蛐?，達(dá)到亞微米級(jí)別時(shí)，可以利用LDPI-MSI技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)單細(xì)胞進(jìn)行分析。殷志斌等人將第一束激光引入出口直徑為200 nm左右的光纖中，并配合使用原子力顯微鏡，構(gòu)建了近場(chǎng)激光解吸系統(tǒng)，加上用157 nm激光后電離，實(shí)現(xiàn)了對(duì)單個(gè)癌細(xì)胞內(nèi)抗癌藥物的質(zhì)譜成像，成像分辨率高達(dá)300 nm[35]。Zavalin等人利用一個(gè)N.A.值接近1的聚焦透鏡，將解吸激光聚焦到1 μm左右[36]。Niehaus等人將樣品貼附在玻璃片的另一面，激光透過玻璃片照射在樣品的背面，高能激光就可以穿透樣品，從而完成對(duì)樣品的解吸，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞內(nèi)的磷脂類物質(zhì)進(jìn)行了質(zhì)譜成像分析，分辨率達(dá)到亞微米級(jí)[34]。值得一提的是，他們的解吸激光波長(zhǎng)為355 nm，同時(shí)在樣品上噴涂MALDI技術(shù)用的基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)細(xì)胞的內(nèi)源物質(zhì)的高分辨質(zhì)譜成像。

4 結(jié)論與展望

質(zhì)譜技術(shù)以其高靈敏度和高分辨率在生物醫(yī)學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，例如藥物分子代謝產(chǎn)物的動(dòng)態(tài)分析、腫瘤標(biāo)志物的鑒定、蛋白組學(xué)分析等。在最近20年間發(fā)展起來的質(zhì)譜成像技術(shù)，尤其是生物組織分子質(zhì)譜成像已經(jīng)逐步進(jìn)入生物醫(yī)學(xué)分析領(lǐng)域。本論文詳細(xì)介紹了LDPI-MSI的基本原理、構(gòu)建LDPI的兩束激光源的選擇、影響LDPI-MS參數(shù)優(yōu)化以及其在生物醫(yī)學(xué)分析研究中的應(yīng)用?？梢灶A(yù)見，高空間分辨率質(zhì)譜分子成像及高靈敏度、高通量質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)將在生物醫(yī)學(xué)、藥學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，同時(shí)這對(duì)儀器的靈敏性、便攜化、穩(wěn)定性提出了更高的要求。國(guó)內(nèi)質(zhì)譜技術(shù)的迅猛發(fā)展及國(guó)產(chǎn)質(zhì)譜儀的產(chǎn)業(yè)化也將助推LDPI-MSI技術(shù)與生物醫(yī)學(xué)分析的融合，助力生物醫(yī)學(xué)分析的發(fā)展。