陳意光 張沛林 譚焯針 王宏海 夏澤敏 譚建華

(廣州質(zhì)量監(jiān)督檢測研究院， 廣州 511447)

生姜具有解毒止嘔、鎮(zhèn)痛消炎、營養(yǎng)保健、抗菌、抗氧化作用，在醫(yī)藥、保健、食品、化妝品等領(lǐng)域都具有較高的應(yīng)用價值[1-5]。生姜的化學(xué)成分很復(fù)雜，目前已發(fā)現(xiàn)的成分就有140多種。研究表明，姜辣素是生姜的主要功效成分。姜辣素的分子式中均有3-甲氧基-4-羥基苯基的官能團(tuán)，根據(jù)此官能團(tuán)連有脂肪鏈的不同分為姜酚類(gingerols)、姜烯酚類 (shogaols)、姜酮 (zingerones) 、姜二酮類(zingerdiones)和姜二醇類(ginerdiols)等類型[3]。姜酚呈黃色油狀液體，是一類6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚等的混合物(圖1)。姜烯酚在生姜中的含量較低。

目前針對姜酚和姜烯酚的檢驗(yàn)方法主要是采用高效液相色譜法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。檢測基質(zhì)包括生姜、生姜提取物、食品等[5-11]。國內(nèi)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)包括GB//T22293-2008《姜及油樹脂主要刺激成分測定 HPLC法》[11]。在餐具洗滌劑產(chǎn)品質(zhì)量比對項(xiàng)目調(diào)研中，可見部分產(chǎn)品標(biāo)示添加姜成分，但是目前國內(nèi)尚未有洗滌劑中姜酚和姜烯酚的檢測方法，企業(yè)和消費(fèi)者均無法得知餐具洗滌產(chǎn)品是否存在姜成分，含量有多少。因此建立餐具洗滌產(chǎn)品中姜酚，姜烯酚的檢測方法，對維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，開拓姜產(chǎn)品應(yīng)用領(lǐng)域，并為企業(yè)把控產(chǎn)品質(zhì)量，形成國際競爭力提供重要技術(shù)支撐，十分必要。

圖1 6種化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 試劑，儀器和樣品

1.1.1試劑和儀器

6-姜酚(6-Gingerol，CAS 23513-14-6，純度98%)；8-姜酚(8-Gingerol，CAS 77398-92-6，純度99%)；10-姜酚(10-Gingerol，CAS 107257-18-1，純度99%)：標(biāo)準(zhǔn)品，Stanford Chemicals； 6-姜烯酚(6-Shogaol，CAS 23513-13-5，純度97%)，8-姜烯酚(8-Shogaol，CAS 104186-07-4，純度90%)，10-姜烯酚(10-Shogaol，CAS 104186-05-2，純度90%)：標(biāo)準(zhǔn)品，Standard。

乙腈、甲醇、丙酮、二氯甲烷：色譜純，美國Fisher；甲酸：色譜純，德國CNW；無水硫酸鈉、25%氨水、正丁醇：分析純，廣州化學(xué)試劑廠；硅膠小柱：2g, 6mL，德國CNW，使用前先用6mL酸化二氯甲烷活化；超純水：實(shí)驗(yàn)室自制。

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Ulti mate 3000-TSQ Quantiva，美國Thermo fisher Scientific公司；渦旋混合儀：MinishakerMS3 digital，德國IKA公司；超聲波清洗儀：SK8200H，上?？茖?dǎo)超聲儀器公司；氮吹濃縮儀器：EFAA-DC24-RT，上海安譜公司；離心機(jī)：Mini Spin，德國Eppendorf公司；天平：CPA225D和BSA224S，瑞士Sartorius公司；超純水儀：Mill-Q，美國Merck millipore公司。

1.1.2材料

共20份樣品來源于不同品牌，購自廣州本地商場。其中樣品1到樣品4用于加標(biāo)實(shí)驗(yàn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：分別稱取標(biāo)準(zhǔn)品于10mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，搖勻，配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20℃存放。

標(biāo)準(zhǔn)中間液1：移取1mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液于100mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，搖勻，配制成濃度為10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，-20℃存放。

標(biāo)準(zhǔn)中間液2：移取1mL標(biāo)準(zhǔn)中間液1于10mL容量瓶中，用甲醇定容到刻度，搖勻，配制成濃度為1000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)中間液，使用前配制。

工作液：將標(biāo)準(zhǔn)中間液2用甲醇逐級稀釋，配制成濃度分別為0、4.0、8.0、20.0、40.0、80.0、120.0、160.0μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，使用前配制。

1.2.2溶液配制

提取液：移取10mL甲酸，10mL甲醇溶液到1L容量瓶中，用二氯甲烷定容到刻度。

酸化二氯甲烷溶液：移取10mL甲酸溶液到1L容量瓶中，用二氯甲烷定容到刻度。

洗脫溶液：移取10mL甲酸溶液到1L容量瓶中，加入100mL丙酮，用二氯甲烷定容到刻度。

流動相A：移取10mL正丁醇，0.1mL氨水到1L容量瓶中，用水定容到刻度。

流動相B：移取10mL正丁醇，0.1mL氨水到1L容量瓶中，用乙腈定容到刻度。

1.2.3儀器條件

色譜柱: Waters Acquity BEH-C18 1.7μm，2.1 mm50 mm；流速：0.3 mL/min；柱溫: 30℃；進(jìn)樣體積：3L。流動相梯度洗脫程序：0min，35%B，1min，35%B，5min，80%B，7min，80%B，7.5min，35%B，10min，35%B。

ESI離子源，負(fù)離子模式；噴霧電壓：3000V；鞘氣：50Arb，輔助氣：10Arb；離子源溫度：280℃，傳輸管溫度300℃。選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)，各化合物監(jiān)測離子對信息見表1；離子對駐留時間：軟件自動設(shè)定。

1.2.4樣品前處理

稱取1.0g樣品于15mL塑料離心管中，加入10mL提取液，渦旋混勻，加入3g無水硫酸鈉，再次渦旋混勻后，于離心機(jī)6000rpm離心5min。取2mL提取液于預(yù)先活化的硅膠小柱，待自然流干后，加入2mL洗脫溶液，自然流干。上柱液和淋洗液均棄去。再加入5mL洗脫溶液，完全收集于氮吹試管中。40℃氮?dú)獯蹈珊?，?.5mL甲醇溶解殘?jiān)芤哼^0.22μm有機(jī)濾膜后待測。

表1 6種化合物的保留時間和離子對參數(shù)

注1：定性離子峰高與定量離子峰高的比值

1.2.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果計算

樣品中含量按式(1)計算。

(1)

其中：c為樣品上機(jī)溶液從工作曲線計算得到的濃度，μg/L；V為定容體積，mL；m為稱樣量，g；

1.2.6加標(biāo)實(shí)驗(yàn)

對4種樣品做標(biāo)準(zhǔn)添加實(shí)驗(yàn)，其中樣品1添加10μg/kg、80μg/kg、400μg/kg 3個濃度，樣品2、樣品3、樣品4添加80μg/kg 1個濃度。根據(jù)測定結(jié)果計算平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

2.1.1前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

由于姜酚和姜烯酚在二氯甲烷中有較好的溶解性，方法采用添加少量甲酸和甲醇的二氯甲烷提取，可以增加二氯甲烷的萃取效率，并用硫酸鈉脫水，經(jīng)過離心處理后，可去除基質(zhì)中的水、親水性物質(zhì)和部分表面活性劑。

由于表面活性劑具有極性基團(tuán)，實(shí)驗(yàn)采用硅膠小柱吸附表面活性劑，并考察了丙酮、二氯甲烷+丙酮=9+1，二氯甲烷3種洗脫溶劑(洗脫體積為6mL)的凈化效果。結(jié)果表明采用丙酮為洗脫溶劑，經(jīng)凈化后的樣品仍然有較強(qiáng)的基質(zhì)效應(yīng)，未能實(shí)現(xiàn)凈化效果。采用二氯甲烷作為洗脫液，姜酚和姜烯酚未能洗脫。采用二氯甲烷+丙酮=9+1可以將樣品中的大部分基質(zhì)效應(yīng)去除，各化合物回收率接近100%。實(shí)驗(yàn)最終采用二氯甲烷+丙酮=9+1作為洗脫溶劑。采用丙酮和二氯甲烷+丙酮=9+1兩種洗脫溶劑的基質(zhì)效應(yīng)見表2，基質(zhì)效應(yīng)以濃度為40μg/L空白基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液和標(biāo)準(zhǔn)溶液中化合物的峰面積百分比表示。ND表示受基質(zhì)抑制，未出峰。

表2 6種化合物在兩種洗脫溶液中的基質(zhì)效應(yīng)

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步比較了3mL、4mL、5mL、6mL、7mL5種洗脫體積。洗脫體積在3mL時，姜酚和姜烯酚未洗脫；4mL開始有姜酚和姜烯酚被洗脫；至6mL，各化合物的響應(yīng)不再增加。實(shí)驗(yàn)最終確定洗脫液接收體積為第3mL到第7mL，共收集5mL。

2.1.2儀器條件的優(yōu)化

6種化合物在乙腈-水體系中可以實(shí)現(xiàn)分離。氨水的添加可以顯著的提高化合物的離子化效率，各化合物響應(yīng)可顯著提高。正丁醇的加入可以在此基礎(chǔ)上更進(jìn)一步提高各化合物的響應(yīng)。實(shí)驗(yàn)比較了0.2%、0.5%和1.0%的正丁醇添加量，結(jié)果表明1.0%的正丁醇響應(yīng)最高。考慮到更高濃度的正丁醇會提高流動相的沸點(diǎn)和粘度等性質(zhì)，未再提高正丁醇濃度。

采用超高效液相色譜柱，梯度洗脫條件經(jīng)優(yōu)化后，6個化合物在十分鐘的色譜時間實(shí)現(xiàn)完全分離，各化合物峰型尖銳，峰寬約0.2min。

化合物母離子的離子源條件通過TSQ Quantiva 2.0 Tune軟件人工優(yōu)化得到，子離子選擇和碰撞能通過TSQ Quantiva 2.0 Tune軟件自動優(yōu)化得到。

2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1儀器檢出限，方法檢出限，工作曲線

在本實(shí)驗(yàn)條件下，工作曲線、儀器檢出限(定性離子信噪比為S/N=3所對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度)及對應(yīng)的方法檢出限見表3，工作曲線見表3。6種成分在測定范圍內(nèi)與色譜峰峰面積均呈良好的線性關(guān)系，且該方法具有較高的靈敏度。標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖見圖2。

表3 6種化合物的工作曲線和檢出限

圖2 160 μg/L標(biāo)準(zhǔn)溶液定量離子對色譜圖

2.3.3方法的準(zhǔn)確性和精密度和檢測限

在不同基質(zhì)的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中，方法回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4。方法的平均回收率在86.6%到118.3%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在0.7%到6.1%之間。方法的準(zhǔn)確性和精密度好。陰性樣品加標(biāo)色譜圖見圖3。

圖3 10.0μg/kg加標(biāo)樣品定性離子對色譜圖

表4 在4個基質(zhì)中的添加回收結(jié)果

續(xù)表4

續(xù)表4

2.3.4洗潔精樣品中姜酚和姜烯酚的檢測

研究小組采用本方法對20批洗潔精樣品中姜酚和姜烯酚含量進(jìn)行測定。結(jié)果顯示，1批次樣品檢出姜酚和姜烯酚，結(jié)果分別為6-姜烯酚65.2μg/kg，6姜酚100.7μg/kg，8-姜烯酚18.8μg/kg，8-姜酚20.1μg/kg，10-姜烯酚38.1μg/kg，10-姜酚38.5μg/kg。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)首次采用硅膠小柱凈化，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定洗潔精產(chǎn)品中的6種姜酚和姜烯酚。方法靈敏度高，準(zhǔn)確性好，精密度高，通用性好。是檢測洗潔精產(chǎn)品中姜特征成分的合適方法。對維護(hù)消費(fèi)者權(quán)益，開拓姜產(chǎn)品應(yīng)用領(lǐng)域，并為企業(yè)把控產(chǎn)品質(zhì)量，形成國際競爭力提供重要技術(shù)支撐。對其他洗滌產(chǎn)品中姜酚、姜烯酚的檢測有一定的參考意義，具有較好的應(yīng)用前景。